歐陽(yáng)昕，宋渺渺，肖愛(ài)嬌，陳明人

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

新生兒缺氧缺血性腦損傷所導(dǎo)致的缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)發(fā)病率較高[1]，每1 000個(gè)活產(chǎn)兒當(dāng)中就有2～4個(gè)遭受這種病的影響[2]，這也是產(chǎn)生新生兒死亡和殘疾的主要原因[3]。HIE生理病理變化過(guò)程十分復(fù)雜，涉及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等多個(gè)方面[4]。因此，研究其相關(guān)機(jī)制和探索高效的治療手段具有重要意義。

中醫(yī)藥治療HIE日益受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注。研究表明，針灸被廣泛應(yīng)用于該病的治療，并取得了一定的療效[5]。本課題組最新的實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，艾灸具有減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的作用[6]。隨著灸療技術(shù)的創(chuàng)新，熱敏灸應(yīng)運(yùn)而生，且廣泛推廣，艾灸的臨床療效隨之大幅度提升，其中治療缺血性中風(fēng)取得了卓著的療效[7]。此外，本課題組近年來(lái)多項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)熱敏灸能明顯減輕成年大鼠腦缺血再灌注損傷[8-10]。這些研究成果為本次實(shí)驗(yàn)選用熱敏灸來(lái)治療新生小鼠HIE提供了豐厚的前期積累。我們發(fā)現(xiàn)，熱敏灸應(yīng)用在HIE新生小鼠中的研究甚少，而且其作用機(jī)制的研究也少有人涉足。因此，本課題以HIE新生小鼠為研究對(duì)象，采用熱敏灸為干預(yù)手段，觀(guān)察小鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)、caspase-9表達(dá)和caspase-3水平的變化，探討熱敏灸治療HIE的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康成年ICR小鼠共8只，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(贛)2017-0004，飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。按雌鼠∶雄鼠=3∶1比例合籠，母鼠孕期為21 d，待其自然分娩，小鼠出生當(dāng)日計(jì)為P0，使用P7 (出生后第7天)新生小鼠52只(不限雌雄)。

1.2 主要試劑與儀器

TTC試劑(Sigma)，S7165凋亡原位檢測(cè)試劑盒(Millipore)，#9505兔抗小鼠caspase-9(Cell Signaling Technology)和A11011山羊抗兔IgG(Invitrogen)，caspase-3放免試劑盒 (北京華英生物技術(shù)研究所)。CM1950冰凍切片機(jī)，Leica2000熒光顯微鏡，圖像分析軟件(Leica)，XH-6020全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(西安核儀器廠(chǎng))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

所有新生鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(13只)、模型組(13只)和艾灸組(26只)。假手術(shù)組僅行頸部手術(shù)，不做缺血、缺氧；模型組閉合右側(cè)頸總動(dòng)脈造成缺血，并置于缺氧箱進(jìn)行缺氧；艾灸組同模型組，并于缺氧后行艾灸治療，同時(shí)于艾灸前、后測(cè)量尾溫，將艾灸組進(jìn)一步分為非熱敏灸組(艾灸尾溫差≤1.5 ℃)和熱敏灸組(艾灸尾溫差>1.5 ℃)。

2.2 缺氧缺血性腦損傷模型的建立

在RICE-VANNUCCI[11]和LEVINE[12]方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合本課題的實(shí)際情況進(jìn)行了必要的改進(jìn)，制備了HIE新生小鼠模型，具體操作方法請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)[13-15]。

2.3 操作方法

艾灸組施以艾灸療法：用直徑4 mm×150 mm的熱敏灸艾條距大椎穴20 mm處懸灸，該穴定位參照文獻(xiàn)[16]。首次治療于造模后2 h進(jìn)行，35 min/次，此后1次/d，連續(xù)治療3 d。

2.4 腦組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察

于術(shù)后3 d，各組分別取3只鼠采用HE染色觀(guān)察腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。給予小鼠異氟烷吸入麻醉后迅速取腦，相機(jī)拍照，隨后行石蠟切片(厚度5 μm)、HE染色、封片，最后在鏡下(×400)觀(guān)察。HE染色具體操作方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

2.5 腦組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)

于術(shù)后3 d，各組分別取3只鼠采用TUNEL染色觀(guān)察腦組織細(xì)胞凋亡。首先給予小鼠異氟烷吸入麻醉后迅速取腦，相機(jī)拍照，隨后行冰凍切片(厚度35 μm)，進(jìn)行TUNEL染色，詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)[13-15]。染色后使用顯微鏡觀(guān)察拍照，最后用Image J軟件計(jì)數(shù)每個(gè)200倍視野下的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2.6 腦組織caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)

標(biāo)本數(shù)量和取材同2.5。使用時(shí)，每個(gè)標(biāo)本取2片，進(jìn)行caspase-9免疫熒光染色，具體操作方法請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]，其中一抗為兔抗小鼠 caspase-9(1∶400)，二抗為山羊抗兔IgG(1∶500)。熒光顯微鏡拍照后用Image J 軟件計(jì)數(shù)每個(gè)400倍視野下的caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2.7 腦組織caspase-3含量檢測(cè)

于術(shù)后3 d，各組分別取7只鼠進(jìn)行腦組織caspase-3含量檢測(cè)。給予小鼠異氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取腦，分離患側(cè)大腦半球，勻漿后采用放射免疫分析法測(cè)定caspase-3含量，同時(shí)測(cè)定腦組織蛋白質(zhì)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 熱敏灸對(duì)HIE小鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

3.1.1 各組小鼠腦組織大體觀(guān)察

假手術(shù)組腦組織紅潤(rùn)，腦溝及腦回清晰；模型組右半球見(jiàn)大面積梗死灶，腦組織液化、壞死，腦溝、腦回消失；非熱敏灸組右半球可見(jiàn)小面積梗死灶，腦組織液化、壞死，腦溝變淺、腦回變寬；熱敏灸組右半球可見(jiàn)更小面積梗死灶，腦組織液化、壞死現(xiàn)象不明顯，腦溝及腦回較清晰(見(jiàn)圖1)。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.非熱敏灸組；D.熱敏灸組,虛線(xiàn)框?yàn)楣Ｋ涝?。圖1 各組小鼠腦大體形態(tài)

3.1.2 各組小鼠腦組織切片HE染色結(jié)果

從圖2可以看出，假手術(shù)組右側(cè)腦組織排列致密，腦細(xì)胞無(wú)明顯脫落；模型組患側(cè)腦組織排列疏松，腦細(xì)胞脫落甚多；非熱敏灸組患側(cè)腦組織排列較疏松，腦細(xì)胞脫落較少；熱敏灸組患側(cè)腦組織排列較致密，腦細(xì)胞脫落最少。

3.2 熱敏灸對(duì)HIE小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響

見(jiàn)圖3。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，對(duì)4組結(jié)果對(duì)比觀(guān)察后，可以看出假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞很少，模型組多，而非熱敏灸組和熱敏灸組較少。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.非熱敏灸組；D.熱敏灸組。圖2 小鼠腦組織切片HE染色圖片(×400)

圖3 各組小鼠腦組織TUNEL染色(比例尺=50 μm)

通過(guò)對(duì)4組腦組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)模型組明顯多于假手術(shù)組(P<0.05)；非熱敏灸組和熱敏灸組均少于模型組(P<0.05)，熱敏灸組更少，見(jiàn)表1。

表1 小鼠腦組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

3.3 熱敏灸對(duì)HIE小鼠腦組織caspase-9表達(dá)的影響

Caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，對(duì)4組免疫熒光檢測(cè)結(jié)果比較可知，假手術(shù)組中caspase-9表達(dá)很少，模型組表達(dá)很多，而非熱敏灸組和熱敏灸組表達(dá)較少,見(jiàn)圖4。

圖4 小鼠腦組織caspase-9表達(dá)免疫熒光檢測(cè)結(jié)果(比例尺=50 μm)

通過(guò)對(duì)4組小鼠腦組織caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分析，可知模型組多于假手術(shù)組(P<0.05)；非熱敏灸組和熱敏灸組均少于模型組(P<0.05)；尤以后者減少更為明顯(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 小鼠腦組織caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

3.4 熱敏灸對(duì)HIE小鼠腦組織caspase-3含量的影響

從表3可以看到，模型組腦組織caspase-3含量高于假手術(shù)組；非熱敏灸組和熱敏灸組caspase-3含量明顯均低于模型組(P<0.05)。

表3 各組小鼠腦組織caspase-3含量比較

4 討論

目前，低溫治療被證實(shí)是HIE唯一的神經(jīng)保護(hù)干預(yù)方法，并成為治療HIE的標(biāo)準(zhǔn)做法[17]。然而，單靠低溫治療顯然不足以成功治療所有的HIE患者[3]。有數(shù)據(jù)顯示，受益的患者不到1/6[18]。另外，有臨床研究[4]指出盡管早期開(kāi)始低溫治療可為腦缺氧缺血后的患兒提供神經(jīng)保護(hù)，但急性損傷后單獨(dú)應(yīng)用低溫治療，并不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的嚴(yán)重?fù)p傷，也不能有效地改善HIE的預(yù)后，甚至?xí)蚱鋷?lái)的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量和對(duì)治療的依從性。因此，探索一種新的、起輔助作用的神經(jīng)保護(hù)措施勢(shì)在必行。

由于中醫(yī)藥治療HIE具有顯著的優(yōu)勢(shì)，不僅可以有效減輕HIE所致的神經(jīng)后遺癥，而且可以減少治療過(guò)程中所出現(xiàn)的毒副作用，引起國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的廣泛關(guān)注，并開(kāi)展了長(zhǎng)期的研究。課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到艾灸對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。作為中醫(yī)艾灸療法傳承與創(chuàng)新的熱敏灸，既具有艾灸的特性，又展示了獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。其治療手段是通過(guò)艾條燃燒的熱量刺激熱敏腧穴，從而激發(fā)經(jīng)氣感傳，氣至病所，達(dá)到醫(yī)治的效果。臨床證實(shí)其療效明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的艾灸療法[19-20]。因此，本課題組首次嘗試選用熱敏灸對(duì)HIE新生小鼠進(jìn)行治療。

值得注意的是，臨床實(shí)踐證明，在艾灸距離和艾灸強(qiáng)度一定的情況下，熱敏灸的療效與艾灸時(shí)間有關(guān)。傳統(tǒng)的艾灸時(shí)間為15 min，通常不能激發(fā)熱敏化腧穴產(chǎn)生熱敏灸感，當(dāng)艾灸時(shí)間為30～60 min時(shí)，艾灸熱敏化腧穴時(shí)可產(chǎn)生熱敏灸感。因此，熱敏灸時(shí)間一般需要30 min以上。本課題組以往的工作發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷大鼠艾灸大椎穴35 min的療效優(yōu)于15 min[21]。需要補(bǔ)充的是，由于鼠類(lèi)不能描述熱敏灸感，無(wú)法根據(jù)熱敏灸感判斷“大椎”穴是否為熱敏化穴位，因而依據(jù)熱敏灸的傳熱這一特性，觀(guān)察艾灸“大椎”穴35 min后尾溫是否升高，將艾灸35 min組進(jìn)一步分為非熱敏灸組和熱敏灸組。結(jié)果觀(guān)察到，同樣是艾灸35 min，出現(xiàn)尾溫升高的療效優(yōu)于尾溫未升高的[22]，即熱敏灸的療效優(yōu)于非熱敏灸。本次實(shí)驗(yàn)在操作過(guò)程中注意把握兩個(gè)要點(diǎn)，即艾灸時(shí)間長(zhǎng)短問(wèn)題和熱敏灸判別問(wèn)題，并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，結(jié)果觀(guān)察到非熱敏灸和熱敏灸組小鼠腦梗死面積均縮小、腦損傷減輕，尤以熱敏灸組更為明顯，表明熱敏灸具有顯著減輕缺氧缺血性腦損傷的作用，然而其作用機(jī)制尚不十分清楚。

本研究通過(guò)對(duì)腦組織TUNEL染色，觀(guān)察實(shí)施熱敏灸干預(yù)后腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)的變化。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，HIE組小鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加；與HIE組相比，非熱敏灸組與熱敏灸組小鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)均減少，尤以熱敏灸組減少更為明顯。這說(shuō)明了兩個(gè)問(wèn)題：一是缺氧缺血性腦損傷確實(shí)發(fā)生了細(xì)胞凋亡，這與文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道的結(jié)果基本一致；二是熱敏灸具有抗凋亡的作用。

為了進(jìn)一步明確熱敏灸抑制細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制，本次實(shí)驗(yàn)著重觀(guān)察了細(xì)胞凋亡啟動(dòng)組中的caspase-9和細(xì)胞凋亡執(zhí)行組中的caspase-3。結(jié)果表明，非熱敏灸與熱敏灸均可降低小鼠腦組織中caspase-9表達(dá)和caspase-3水平，尤以熱敏灸降低更為突出。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了熱敏灸可能通過(guò)降低腦組織caspase-9表達(dá)和caspase-3水平，從而起到抗凋亡的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究初步證實(shí)，熱敏灸可通過(guò)降低caspase-9表達(dá)和caspase-3水平，減少腦組織細(xì)胞凋亡，達(dá)到減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用熱敏灸治療新生兒HIE提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論支持，有可能作為臨床新生兒HIE治療的一種有效的輔助手段。