梁浩明，高永堅，陳盛君，區(qū)淑蘊，陳錦霞，陳偉鋼，陳科成，林碧珊

(1.國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司研發(fā)中心，佛山 528303；2.江陰天江藥業(yè)有限公司研究院，江陰 214400)

中藥標準湯劑是經標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水湯劑，用于標化臨床用藥，保障用藥的準確性和劑量的一致性[1]。國家藥典委員會在2016年發(fā)布《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》提出，中藥配方顆粒以標準湯劑作為與臨床湯劑療效基本一致的標準參照物。

白術為菊科植物白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，用于治療脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動不安[2]。白術主要成分為內酯、糖和有機酸等[3]。目前《中華人民共和國藥典》2020版一部中僅從性狀、鑒別、檢查等項目對白術進行質量控制，并未規(guī)定含量測定項。脂溶性組分白術內酯Ⅲ是其主要活性物質，但由于水溶性差、轉移率低，不足以表征物質基礎的一致性[4]。筆者在本研究發(fā)現(xiàn)，水溶性成分綠原酸和果糖在白術標準湯劑的含量較白術內酯Ⅲ更高。因此，研究和探討上述3個成分是否均可作為白術的質量標志物。實驗收集6個產區(qū)共19批白術，建立白術標準湯劑中白術內酯Ⅲ、綠原酸和果糖的含量測定方法，計算出膏率和轉移率，為白術飲片及其制劑的質量標準研究提供科學參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 H-class型超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)(包括二元泵，柱溫箱，自動進樣器和PDA檢測器，Waters公司)；ELSD-6000型蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech公司)；BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)均購自Waters公司； MS105DU型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)；電控溫煎藥壺(深圳市一枚王電子商務有限公司)；TRL-0.5型真空冷凍干燥機(大連雙瑞科技有限公司)；KQ-500DE型超聲儀(昆山超聲儀器有限公司)；Synergy UV型超純水儀(Millipore公司)。

1.2試藥與藥材 白術內酯Ⅲ對照品(批號：11978-201501，含量：99.9%)和綠原酸對照品(批號：110753-201716，含量：99.3%)均購自中國食品藥品檢定研究院，D-果糖對照品(批號：5964，純度：98.8%)購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；乙腈和磷酸均為色譜純，超純水由MILLIPORE純水儀制備，其余試劑均為分析純。

19批白術藥材分別采集于浙江、安徽等不同種植產地，詳細信息見表1，經國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司質管部陳志榮主管中藥師鑒定均為白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖。由本實驗室按照《中華人民共和國藥典》2015年版一部炮制項要求制成對應批次白術飲片。

表1 15批不同產地白術藥材信息

2 方法與結果

2.1供試品的制備

2.1.1飲片供試品溶液的制備 白術內酯Ⅲ：取本品粉末(篩孔內徑355 μm，過三號篩)約2 g，精密稱定，置離心管中，加入70%乙醇10 mL，超聲處理(500 W，40 kHz)30 min，8 000 r· min-1(離心半徑r=9.8 cm)離心5 min，上清液轉移至50 mL量瓶中，再重復提取2次，合并上清液，加入70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

綠原酸：取本品粉末(篩孔內徑355 μm，過三號篩)約1.0 g，精密稱定，置燒瓶中，精密加入30%乙醇20 mL，稱定質量，加熱回流30 min ，放冷，再稱定質量，加30%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

果糖：取本品粉末(篩孔內徑355 μm，過三號篩)約1.0 g，精密稱定，置燒瓶中，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過，上清液轉移至100 mL量瓶中，再重復提取1次，合并濾液，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取濾液6 mL，置10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2白術標準湯劑的制備 取白術藥材，按《中華人民共和國藥典》2015年版白術項下飲片炮制方法，去雜質，洗凈，潤透，切厚片，干燥，得白術飲片[2]。取白術飲片100 g，置5 L電控溫煎藥壺中，加 9 倍量水浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮30 min，趁熱濾過，藥渣再加7倍量水，武火煮沸后文火煎煮20 min，趁熱濾過，2次濾液合并，65 ℃減壓濃縮至約250 mL，-50 ℃預冷3 h后冷凍干燥24 h，得白術凍干粉，即白術標準湯劑。

2.1.3標準湯劑供試品溶液的制備 白術內酯Ⅲ：取本品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱質量，超聲處理(500 W，40 kHz)30 min，取出，放冷，稱定質量，用70%乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

綠原酸：取本品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入超純水10 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)5 min，取出，放冷，稱定質量，用超純水補足減失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

果糖：取本品適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入40%乙腈10 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)10 min，取出，放冷，稱定質量，用40%乙腈補足減失質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2對照品溶液制備 ①取白術內酯Ⅲ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含8.52 μg的對照品溶液，即得。②取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含0.100 mg的對照品溶液，即得。③取D-果糖對照品適量，精密稱定，加40%乙腈制成每毫升含1.06 mg的對照品溶液，即得。

2.3色譜條件 白術內酯Ⅲ：色譜柱BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～7 min，50%A；>7～8 min，50%→90%A；>8～10 min，90%A)；柱溫30 ℃；流速0.20 mL·min-1；檢測波長220 nm；進樣量1 μL。

綠原酸：色譜柱BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～4 min，1%→6%A；>4～10 min，6%→9%A；>10～20 min，9%→90%A)；柱溫25 ℃；流速0.25 mL·min-1；檢測波長325 nm；進樣量1 μL。

果糖：色譜柱BEH Amide(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為含0.2%三乙胺的乙腈-水(80：20)；柱溫40 ℃；流速0.20 mL·min-1；進樣量1 μL；ELSD檢測器檢測，漂移管溫度75 ℃，氣體流速1.5 L·min-1。

對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1—圖3。

1.白術內酯Ⅲ。

1.綠原酸。

1.D-果糖。

2.4方法學考察

2.4.1線性關系考察 取白術內酯Ⅲ、綠原酸和D-果糖對照品適量，按“2.2”項下方法分別制成質量濃度分別為53.2 μg·mL-1，0.197 mg·mL-1，2.12 mg·mL-1的對照品溶液，逐步稀釋成不同濃度梯度，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積。白術內酯Ⅲ和綠原酸以對照品溶液濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，回歸方程分別為Y=20.389X+3.125 3(r=1.000)和Y=12 999X+1 353.1(r=1.000)。D-果糖以對照品溶液濃度對數值為橫坐標(X)，峰面積對數值為縱坐標(Y)進行線性回歸，回歸方程為Y=1.706 8X+6.793 9(r=0.999 3)。三者分別在0.266～53.2 μg·mL-1、0.004～0.197 mg·mL-1和0.021～2.12 mg·mL-1濃度范圍內均呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.4.2精密度實驗 取白術內酯Ⅲ、綠原酸和D-果糖對照品溶液適量，分別按“2.3”項下色譜條件重復進樣6次，計算得到峰面積的RSD值均小于0.60%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性實驗 分別取飲片供試品溶液和標準湯劑供試品溶液，于0，4，8，12，18和24 h，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，飲片和標準湯劑供試品溶液的白術內酯Ⅲ峰面積RSD分別為1.79%和0.96%，綠原酸峰面積的RSD值分別為1.33%和0.20%，果糖峰面積的RSD值分別為0.78%和0.83%，表明供試品溶液中白術內酯Ⅲ、綠原酸和D-果糖在24 h內穩(wěn)定。

2.4.4重復性實驗 分別取飲片和標準湯劑，分別按“2.1”項下方法平行制備供試品溶液各6份。按“2.3”項下色譜條件進樣測定，飲片和標準湯劑供試品溶液的白術內酯Ⅲ峰面積RSD分別為2.09%和1.42%，綠原酸峰面積的RSD值分別為0.60%和0.51%，果糖峰面積的RSD值分別為0.64%和1.64%，表明該方法重復性良好。

2.4.5加樣回收率 精密稱取已知含量的飲片和標準湯劑，各6份，按1：1分別加入白術內酯Ⅲ、綠原酸和D-果糖對照品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液。按“2.3”項下色譜條件進樣測定，飲片和標準湯劑供試品溶液的白術內酯Ⅲ平均回收率分別為96.5%和97.0%，綠原酸的平均回收率分別為99.2%和103.6%，果糖的平均回收率分別為98.7%和97.8%，RSD值均小于3.0%。

2.5含量測定 取19批白術飲片及其標準湯劑，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別測定白術內酯Ⅲ、綠原酸和果糖含量，結果見表2。結果顯示19批白術飲片中，白術內酯Ⅲ含量為0.004%～0.096%，綠原酸含量為0.009%～0.120%，果糖含量為1.59%～17.3%；標準湯劑中，白術內酯Ⅲ含量為0.002%～0.059%，綠原酸含量為0.011%～0.131%，果糖含量為1.79%～30.7%。

2.6白術標準湯劑工藝參數測定

2.6.1出膏率 白術標準湯劑的出膏率以冷凍干燥所得干膏粉質量(m)與投料量(m0)的比值計算，出膏率=m/m0，結果見表2。白術19批標準湯劑的出膏率為48.5%～65.5%，平均出膏率為(56.8±5.7)%。不同批次的出膏率差異較小，范圍位于均值的±30%。

2.6.2轉移率 白術內酯Ⅲ、綠原酸和果糖的轉移率分別以每克飲片經標準湯劑提取出該成分的量(W)與每克飲片含該成分的量(M)的比值計算，轉移率(%)=W/M×100%，結果見表2。轉移率以白術內酯Ⅲ計算為13.6%～54.5%，平均為(30.7±12.5)%；以綠原酸計算為36.0%～94.9%，平均為(69.2±12.0)%；以果糖計算為68.7%～99.1%，平值為(84.5±9.0)%。

表2 白術標準湯劑的出膏率和轉移率

3 討論

3.1含量分析方法考察 前期研究發(fā)現(xiàn)，白術內酯Ⅲ和綠原酸在白術標準湯劑指紋圖譜中為主要的色譜峰，而果糖在白術水煎液中含量較高。本實驗建立3種成分的含量測定方法，分別對檢測器、檢測波長、流動相組成、色譜柱、提取溶劑、提取方法等因素進行考察，確定本文所用色譜條件。研究期間發(fā)現(xiàn)，部分批次白術內酯Ⅲ和綠原酸的含量、峰響應差異較大，且極性存在一定差異，不利于同時測定兩種成分的含量。另外，硅膠氨基柱分析果糖時容易產生希夫堿，造成蒸發(fā)光散射檢測器的基線噪音較大[5]，選用BEH Amide色譜柱可避免上述情況，提高定量準確性和兼容性。

3.2不同產地白術成分含量比較 為保證標準湯劑的代表性，本實驗白術藥材來源于多個主產區(qū)，包括湖南、河北、河南、重慶、安徽、浙江。計算各產區(qū)成分的平均含量，河北保定、浙江金華和重慶秀山的白術內酯Ⅲ平均含量較接近，為0.018%～0.033%，河南焦作和安徽約為0.008%，湖南隆回為0.087%。河北保定、湖南隆回和浙江金華的綠原酸平均含量為0.052%～0.065%，而河南焦作、重慶秀山和安徽為0.014%～0.019%。湖南隆回、河南焦作和安徽的果糖平均含量為2.24%～3.00%，浙江金華和重慶秀山為4.18%～5.40%，河北保定為11.3%。因此，與白術內酯Ⅲ和綠原酸相比，果糖的含量較高且不同產地之中含量差異相對較小。

3.3轉移率考察 白術標準湯劑中，白術內酯Ⅲ、綠原酸和果糖的轉移率分別為(30.7±12.5)%，(69.2±12.0)%和(84.5±9.0)%。果糖的含量高于白術內酯Ⅲ和綠原酸，且果糖比白術內酯Ⅲ、綠原酸的轉移率高且穩(wěn)定。因此，白術標準湯劑的轉移率，建議選用果糖作為指標成分進行計算。

綜上所述，果糖在白術標準湯劑中含量高、轉移率穩(wěn)定。果糖在臨床上常用于機體能量補充及體液調節(jié)[6]，而近年研究表明果糖等低分子糖口服后能影響人體腸道運動，調節(jié)益生菌群，調控腸道糖類攝取轉運體表達，治療慢性腹瀉和腹部疼痛等胃腸道癥狀[7-9]，其胃腸道活性或與白術益氣健脾功效密切相關。因此，果糖可作為白術及其標準湯劑的質量控制標志物。