張豐姣 毛雨 何麗 宋利革 劉紅梅 許玲玉 孫玲 康志強(qiáng) 王永魁

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院內(nèi)分泌科, 河南 鄭州 450000

骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)的慢性骨病，而糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡是大量或長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的重要病理機(jī)制[1-2]。研究[3-5]顯示，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與多種信號(hào)通路的調(diào)控密切相關(guān)。其中，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞增殖、凋亡和分化等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與骨相關(guān)性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。二甲雙胍(metformin，Met)是臨床常用降糖藥，具有抑制成骨細(xì)胞凋亡和改善糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的作用[8-9]，但其對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的影響及與PI3K/AKT/mTOR通路的關(guān)系并不明確。本研究以小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞株MC3T3-E1為研究對(duì)象，觀察Met調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路對(duì)長(zhǎng)效類糖皮質(zhì)激素地塞米松(dexamethasone，Dex)誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響，旨在為Met改善糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松提供新的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

MC3T3-E1細(xì)胞株(貨號(hào)：GD-C0419676，美國(guó)ATCC)，Dex、Met和噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT](貨號(hào)：D4902、AS63254、M5655，美國(guó)Sigma)，Caspase-3活性測(cè)定試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測(cè)試劑盒、總RNA提取試劑盒和通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：BC3830、CA1020、R1200、RP1105，北京索萊寶)，PI3K/AKT/mTOR通路活化劑胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)、抑制劑NVP-BEZ235和線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：P605、SC0330、C2006，上海碧云天)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、PI3K、AKT、磷酸化(phospho, p)-AKT、mTOR和p-mTOR抗體(貨號(hào):ab181602、ab154598、ab18785、ab38449、ab32028、ab109268，英國(guó)Abcam)。凝膠成像儀、熒光定量PCR儀和流式細(xì)胞儀(型號(hào)：VersaDoc 3000、CFX96 Touch、ZE5，美國(guó)Bio-Rad)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào)：Herocell 180，美國(guó)Thermo)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理：將解凍復(fù)蘇后的MC3T3-E1細(xì)胞接種至含DMEM培養(yǎng)基(添加有10 %胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中，在濕度飽和、37 ℃和5 %二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后，以0.25 %胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)分為：①對(duì)照組：正常培養(yǎng)；②Dex組：以含5 μmol/L Dex[5]培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；③Met組：以含5 μmol/L Dex和400 μmol/L Met[8]的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；④Met+IGF-1組：以含5 μmol/L Dex、400 μmol/L Met和50 ng/mL IGF-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；⑤Met+NVP-BEZ235組：以含5 μmol/L Dex、400 μmol/L Met和100 nmol/L NVP-BEZ235的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。其中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)：收集處理結(jié)束后的MC3T3-E1細(xì)胞，以磷酸緩沖液洗滌2次后，加入細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白；將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混勻后置于沸水浴中煮沸5 min；將變性后的蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜；以5 %脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯2 h后，加入按照1∶1 000比例稀釋的PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR一抗工作液室溫孵育2 h；經(jīng)按照1∶2 000比例稀釋的二抗工作液室溫孵育2 h后，以化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光；以GAPDH為內(nèi)參，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析MC3T3-E1細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)水平。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞接種至96孔板上，按照1.2.1中的分組處理細(xì)胞，另將只含有培養(yǎng)基不含細(xì)胞的孔作為空白組；處理結(jié)束后，每孔加入濃度為5 g/L MTT工作液20 μL孵育4 h；以二甲基亞砜震蕩反應(yīng)15 min后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞在490 nm處光密度(optic density，OD)值，并按照公式[細(xì)胞存活率(%)=100%×[(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)]計(jì)算各組細(xì)胞存活率。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：收集處理結(jié)束后的MC3T3-E1細(xì)胞，以預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀；采用600 μL 1×Binding Buffer調(diào)整細(xì)胞濃度；向含有105個(gè)細(xì)胞懸液中先后加入Annexin V-FITC和PI工作液各5 μL，混勻后避光下室溫孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀在60 min內(nèi)檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平：先根據(jù)總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取MC3T3-E1細(xì)胞總RNA后，再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，根據(jù)上海吉瑪生物公司合成的PCR引物在20 μL反應(yīng)體系下上熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞中Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平。該過(guò)程重復(fù)3次。其中，PCR擴(kuò)增參數(shù)如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共38個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增引物序列如下：Bcl-2上游：5’-GCCGGGAGAACAGGGTATGAT-3’，下游5’-GACGGTAGCGACGAGAGAAGT-3’；Bax上游：5’-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3’，下游5’-GTT GAAGTTGCCATCAGCAAA-CA-3’；GAPDH上游：5’-AATGTGTCCGTCGTGGATCTG-3’，下游5’-CAACCTGGTCCT-CAGTGTAGC-3’。

1.2.6Caspase-3活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞Caspase-3活性：收集處理結(jié)束后的各組MC3T3-E1細(xì)胞，采用磷酸緩沖液洗滌2次后，參照Caspase-3活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞Caspase-3活性。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.7JC-1探針檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位：按照1.2.1中分組處理MC3T3-E1細(xì)胞后，參照J(rèn)C-1探針線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組MC3T3-E1細(xì)胞線粒體膜電位變化，該過(guò)程重復(fù)3次。其中，在低水平的線粒體膜電位狀態(tài)下，JC-1單體不能形成聚合物而呈綠色熒光；在高水平的線粒體膜電位狀態(tài)下，JC-1單體可形成聚合物而成紅色熒光；故紅色熒光與綠色熒光百分比可反映出線粒體膜電位變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路活化程度比較

與對(duì)照組比較，Dex組細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白PI3K、p-AKT和p-mTOR表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與Dex組比較，Met組細(xì)胞中PI3K、p-AKT和p-mTOR表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；給予IGF-1后細(xì)胞中PI3K、p-AKT和p-mTOR表達(dá)水平明顯高于Met組，而給予NVP-BEZ235后細(xì)胞中PI3K、p-AKT和p-mTOR表達(dá)水平明顯低于Met組(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

表1 各組細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of the expression levels of PI3K/Akt/mTOR pathway related proteins in cells of each group

圖1 WB檢測(cè)細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.1 Expression of PI3K / Akt / mTOR pathway related proteins in cells by WB detection

2.2 各組細(xì)胞存活率比較

與對(duì)照組比較，Dex組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)；與Dex組比較，Met組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)；與Met組比較，IGF-1處理后細(xì)胞存活率明顯升高，而給予NVP-BEZ235作用后細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞存活率比較Table 2 Comparison of cell survival rate in each group (n=9,

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

Dex組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而Met組細(xì)胞凋亡率明顯低于Dex組(P<0.05)；與Met組比較，給予IGF-1作用后細(xì)胞凋亡率明顯降低，而NVP-BEZ235作用后細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2和表3。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡Fig.2 Flow cytometry to detect cell apoptosis in each group

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較Table 3 Comparison of the apoptosis rate in each group

2.4 各組細(xì)胞凋亡基因Bcl-2、Bax表達(dá)水平和Caspase-3活性比較

與對(duì)照組比較，Dex組細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低，而B(niǎo)ax mRNA表達(dá)水平和Caspase-3活性明顯升高(P<0.05)；與Dex組比較，Met組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，而B(niǎo)ax mRNA表達(dá)水平和Caspase-3活性明顯降低(P<0.05)；與Met組比較，給予IGF-1可使細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)升高而B(niǎo)ax mRNA表達(dá)、Caspase-3活性降低(P<0.05)，而給予NVP-BEZ235則使細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)降低而B(niǎo)ax mRNA表達(dá)、Caspase-3活性升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平和Caspase-3活性比較Table 4 Comparison of Bcl-2, Bax mRNA expression and caspase-3 activity in cells of each group

2.5 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較

與對(duì)照組比較，Dex組細(xì)胞JC-1綠/紅熒光比例明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明Dex可誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電位降低；與Dex組比較，Met組細(xì)胞JC-1綠/紅熒光比例明顯降低(P<0.05)，說(shuō)明Met可抑制Dex誘導(dǎo)引起的線粒體膜電位降低；與Met組比較，IGF-1作用后細(xì)胞JC-1綠/紅熒光比例進(jìn)一步降低，而給予NVP-BEZ235作用后細(xì)胞JC-1綠/紅熒光比例明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明IGF-1可增強(qiáng)Met對(duì)線粒體膜電位的作用，而NVP-BEZ235則減弱Met對(duì)線粒體膜電位的作用。見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較Table 5 Comparison of the mitochondrial membrane potential in each group (n=9,

3 討論

糖皮質(zhì)激素的不當(dāng)使用會(huì)導(dǎo)致激素性骨壞死，而糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡是其致病的重要原因[10-12]；然而，糖皮質(zhì)激素引起成骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制并不明確。細(xì)胞凋亡是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定細(xì)胞發(fā)生自主有序死亡的過(guò)程，主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、死亡受體途徑和線粒體途徑；其中，線粒體凋亡途徑最為重要，且受Bcl-2家族基因的嚴(yán)格調(diào)控；Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成員，分別在線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放過(guò)程中發(fā)揮著抑制和促進(jìn)作用，在線粒體膜滲透性改變后細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞漿使凋亡執(zhí)行因子Caspase-3活性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生[13-14]。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，可通過(guò)調(diào)控Bcl-2家族基因表達(dá)在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮著重要作用[15]；mTOR是AKT下游通路的主要靶點(diǎn)，AKT磷酸化被激活可引起mTOR磷酸化，而活化的mTOR進(jìn)入細(xì)胞核可通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax等基因表達(dá)抑制線粒體凋亡途徑[16-17]。本研究以5 μmol/L Dex處理小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1后發(fā)現(xiàn)，MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率、Bax基因表達(dá)水平和Caspase-3活性明顯升高，而細(xì)胞存活率、細(xì)胞中Bcl-2基因表達(dá)水平、線粒體膜電位和PI3K蛋白表達(dá)水平、AKT磷酸化水平、mTOR磷酸化水平均明顯降低。結(jié)果表明，Dex可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化引起MC3T3-E1細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑凋亡。該結(jié)果與樊萍等[5]研究所得出的Dex抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的結(jié)果相吻合。提示，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體凋亡是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

Met是從葛根提取物中分離得到的胍類合成衍生物，具有降糖、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理活性[18-20]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，給予400 μmol/L Met作用后Dex誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡明顯受到抑制，細(xì)胞存活率、抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)水平、線粒體膜電位均明顯升高，而促凋亡基因Bax表達(dá)水平和Caspase-3活性明顯降低。該結(jié)果與Zheng等[21]和甄東戶等[8]研究所得出的Met可抑制成骨細(xì)胞凋亡的結(jié)果相吻合，同時(shí)本研究還揭示了Met抑制的成骨細(xì)胞凋亡途徑是內(nèi)源性線粒體凋亡途徑。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Met改善胰島素抵抗的作用機(jī)制與激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)；黃穎等[9]研究證實(shí)，Met可通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路改善糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松。然而，Met是否通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮抑制成骨細(xì)胞凋亡的作用并不清楚。本研究進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，給予400 μmol/L Met作用后，Dex誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞中PI3K蛋白表達(dá)水平、AKT磷酸化水平、mTOR磷酸化水平均明顯升高。結(jié)果表明，Met可促進(jìn)Dex誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化。本研究進(jìn)一步給予IGF-1促進(jìn)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化后發(fā)現(xiàn)，Met對(duì)Dex誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞線粒體凋亡途徑的抑制效果明顯增強(qiáng)；而給予NVP-BEZ235抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活化后發(fā)現(xiàn)，Met對(duì)Dex誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞線粒體凋亡途徑的抑制效果明顯減弱。結(jié)果表明，Met可通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制Dex誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞線粒體凋亡途徑。

綜上所述，Met通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制線粒體凋亡途徑減輕糖皮質(zhì)激素Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。然而，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡機(jī)制十分復(fù)雜，Met是否還通過(guò)其他途徑發(fā)揮抑凋亡作用仍有待進(jìn)一步深入探討。