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        PM2.5對去勢后雌性SD大鼠骨微結(jié)構(gòu)micro-CT的影響

        2021-10-08 10:16:22林妹珠黃惠娟倪清麗董怡君劉宗玉蔡芬張小蕊
        中國骨質(zhì)疏松雜志 2021年9期

        林妹珠 黃惠娟 倪清麗 董怡君 劉宗玉 蔡芬 張小蕊

        1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○○醫(yī)院婦產(chǎn)科,福建 福州 350025 2. 福建醫(yī)科大學(xué)??偱R床醫(yī)學(xué)院,福建 福州 350025 3. 廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院,福建 福州 350025

        絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于雌激素水平下降,骨代謝水平改變導(dǎo)致骨礦密度、骨質(zhì)量下降,骨結(jié)構(gòu)退化、脆性增加,骨微結(jié)構(gòu)改變等一系列變化的全身骨代謝相關(guān)疾病。最新流行病學(xué)調(diào)研指出,美國約有1 000萬50歲以上的人患有骨質(zhì)疏松癥,經(jīng)濟負擔(dān)巨大,在美國和英國每年約花費179億美元和40億英鎊用于治療[1], 骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)是一個世界范圍的主要健康問題。PM2.5(particulate matter 2.5)指的是空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的顆粒物,其成分復(fù)雜,含無機成分、有機成分、重金屬等,可直接進入人體肺泡,危害健康。研究發(fā)現(xiàn),長期暴露在PM環(huán)境下,與骨質(zhì)疏松的發(fā)生具有密切相關(guān)性[2]。在骨質(zhì)疏松臨床篩查和診治中,雙能 X 射線吸收測定法測量骨密度被公認為診斷的金標準,但是骨密度反映骨量的多少,并不能反映骨微結(jié)構(gòu)的改變情況[3]。顯微計算機斷層掃描術(shù)(micro-computed content,Micro-CT)可以在3 D上測量骨小梁骨微結(jié)構(gòu)變化,從而對骨礦物進行定量定性分析,對診斷骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展過程更為敏感和可靠,為臨床研發(fā)骨骼藥物提供更多機會[4]。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物與分組

        3周齡約50 g的SPF級雌性健康SD大鼠24只,由第九○○醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)實驗科實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2017-0001。SD大鼠適應(yīng)性生長1周后隨機分為對照組,低、中、高劑量組,每組6只,進行PM2.5懸濁液氣道滴注,每3天滴注1次。其中對照組滴注生理鹽水,低、中、高劑量組滴注PM2.5懸濁液濃度分別為:35、70、150 μg/m3。在氣道滴注的第5個月末行去勢手術(shù),第九個月末取材。

        1.2 PM2.5懸濁液制備

        PM2.5的采集地點為福州市鼓樓區(qū),使用Thermo Science GUV-15-H-1(美國)大流量采樣器和Thermo Science G1200-41 PM2.5采樣頭,流量1.13 m3/min,用石英纖維膜(美國Whataman公司)采集PM2.5。采樣前將纖維膜于馬沸爐中450 ℃焙燒5 h,以消除可能載帶的有機物。每24小時更換一次纖維膜。將收集好PM2.5的纖維膜剪成1 cm×1 cm大小,加入超純水,置于超聲振蕩器中,4 ℃振蕩2 h后用8層無菌紗布過濾。將過濾好的液體置于無菌離心管內(nèi),低溫高速離心(4 ℃,12 000 r/min,30 min)后去除上清液,沉淀物質(zhì)用真空冷凍干燥機干燥12 h。稱重后,加入PBS磷酸鹽緩沖液配置成所需濃度的懸濁液,保存于4 ℃冰箱。

        1.3 PM2.5暴露

        1.3.1PM2.5暴露濃度標準:PM2.5暴露濃度標準參照中華人民共和國環(huán)境空氣質(zhì)量標準(GB3095-2012)一、二級標準24小時平均年濃度限值(35、75 μg/m3)以及《環(huán)境空氣質(zhì)量指數(shù)(AQI)技術(shù)規(guī)定(試行)》規(guī)定,重度污染的PM2.5濃度大于150 μg/m3。

        1.3.2PM2.5氣道滴注:將麻醉好的SD大鼠固定,暴露氣道,用棉簽清理口腔后,用腰麻針套管作為氣道滴注針,向氣道內(nèi)滴注相應(yīng)濃度的PM2.5懸濁液,成功后用2.5 mL針管向氣道內(nèi)注入一管空氣。拔出滴注針,觀察大鼠狀態(tài)良好后放回飼養(yǎng)籠。

        1.4 SD大鼠去勢造模

        在PM2.5氣道滴注的第5個月末,行去勢手術(shù)。去勢術(shù)前禁食禁水8 h,手術(shù)器械高壓滅菌。麻醉后取背部切口,逐層切開皮膚、肌肉,分離脂肪后可見粉色卵巢,結(jié)扎輸卵管并切除卵巢后逐層縫合、消毒,觀察出血情況。同法摘除另一側(cè)卵巢。術(shù)后密切觀察大鼠皮膚切口情況,精神狀態(tài)等,在術(shù)后3天內(nèi)定期消毒傷口,肌注青霉素預(yù)防感染,如有傷口裂開則二次縫合。確保手術(shù)成功去卵巢,在取材時檢查卵巢是否缺失。

        1.5 取材

        乙醚吸入麻醉處死SD大鼠后,用高壓滅菌后的手術(shù)器械取出其右側(cè)股骨、脛骨以及腰椎,剔除周圍結(jié)締組織及血管神經(jīng)組織等,用生理鹽水浸潤紗布包裹標本后放入病理袋中,存于-20 ℃冰箱以待micro-CT掃描。

        1.6 micro-CT掃描

        用micro-CT掃描儀(MCT-Sharp,中國)掃描時,將脛骨、股骨、腰椎分別沿長軸固定于固定器內(nèi),設(shè)置電壓為70 kV,功率7 W,100 μA,4幀疊加,角度增益0.72 °,曝光時間100 ms,分辨率為20 μm。掃描得到prj格式圖像,重建后生成IMO文件,通過Medproject軟件處理,得到三維圖像及分析結(jié)果。其中選取脛骨距生長板遠端2 mm,層厚1.5 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域進行三維重組定量分析;選取股骨Ward三角區(qū),層厚0.5 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域進行三維重組定量分析;選取與上下椎間面等距的,層厚為1.6 mm的椎體骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域進行三維重組掃描定量分析。相關(guān)參數(shù)如下:骨小梁骨密度(trabecular bone mineral density,Tb.BMD)、骨體積(bone volume,BV)、松質(zhì)骨感興趣區(qū)域(region of interest,ROI )、總體積(total volume,TV)、相對骨體積或骨體積分數(shù)(BV/TV)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(structure model index,SMI)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation/spacing,Tb.Sp)[5]。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

        2 結(jié)果

        2.1 PM2.5暴露組與對照組脛骨、股骨Ward三角區(qū)、腰椎骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

        2.1.1PM2.5暴露對雌性SD大鼠脛骨的影響:與對照組相比,PM2.5暴露組脛骨骨小梁的Tb.BMD減小、BV/TV減小、SMI增大、Tb.Th減小、Tb.N減少、Tb.Sp增加;其中相較于對照組,脛骨骨小梁的BV/TV、Tb.Th、Tb.N 、Tb.Sp的改變差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Tb.BMD、SMI的改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表1。

        表1 各組脛骨骨參數(shù)改變Table 1 The changes of tibial bone parameters in each

        2.1.2PM2.5暴露對雌性SD大鼠股骨Ward三角區(qū)的影響:與對照組相比,PM2.5暴露組股骨Ward三角區(qū)骨小梁的Tb.BMD減小、BV/TV減小、SMI增大、Tb.Th減小、Tb.N減少、Tb.Sp增加;其中相較于對照組,股骨Ward三角區(qū)骨小梁的Tb.BMD、BV/TV、SMI、Tb.N 、Tb.Sp的改變差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Tb.Th的改變以及低劑量組BV/TV的改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

        表2 各組股骨骨參數(shù)改變Table 2 The changes of femoral bone parameters in each

        2.1.3PM2.5暴露對雌性SD大鼠腰椎的影響:與對照組相比,PM2.5暴露組腰椎骨小梁的Tb.BMD減小、BV/TV減小、SMI增大、Tb.Th減小、Tb.N減少、Tb.Sp增加;其中相較于對照組,腰椎骨小梁的SMI、Tb.Th、Tb.N 、Tb.Sp的改變差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Tb.BMD、BV/TV的改變以及低劑量組Tb.Th的改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表3。

        表3 各組腰椎骨參數(shù)改變Table 3 The changes of vertebral bone parameters in each

        2.2 Micro-CT 重建

        2.2.1PM2.5暴露對脛骨骨微結(jié)構(gòu)micro-CT的影響:如圖1所示,各組脛骨髓腔內(nèi)容物稀疏,相比對照組,脛骨髓腔隨著PM2.5懸濁液濃度的增高而變得更稀疏,甚至高劑量組已完全空虛。從圖1中A2~D2可見,對照組的骨小梁有少許斷裂不完整,桿狀結(jié)構(gòu)少,多數(shù)為片狀結(jié)構(gòu),而隨著PM2.5懸濁液暴露濃度增高,骨小梁愈來愈不連續(xù)和缺損,數(shù)量減少,骨小梁之間的間隙變大,骨小梁多數(shù)為桿狀結(jié)構(gòu)。

        注:A 對照組;B 低劑量組;C 中劑量組;D 高劑量組圖1 各組大鼠脛骨及其骨小梁結(jié)構(gòu)的micro-CT三維重建圖Fig.1 Three-dimensional micro-CT reconstruction of the tibia and its trabecular structure in rats of each group。

        2.2.2PM2.5暴露對股骨Ward三角區(qū)骨微結(jié)構(gòu)micro-CT的影響:如圖2所示,股骨近端其股骨頭內(nèi)骨小梁相對完整,對照組與低劑量組股骨髓腔內(nèi)骨小梁分布稀疏、相差不大;隨著PM2.5懸濁液暴露濃度的增加,髓腔內(nèi)骨小梁分布稀疏、間隙變大。股骨解剖Ward三角區(qū)的micro-CT三維重建圖2中A4~D4可見,各組骨小梁均為松散不連續(xù)的、間隙變大,但整體上相差不大。

        注:A 對照組;B 低劑量組;C 中劑量組;D 高劑量組。圖2 各組大鼠股骨近端及股骨ward三角區(qū)骨小梁的micro-CT三維重建圖Fig.2 Three-dimensional micro-CT reconstruction of bone trabeculae of the proximal femur and Ward triangle of the femur in rats of each group

        2.2.3PM2.5暴露對腰椎骨微結(jié)構(gòu)micro-CT的影響:如圖3所示,各組腰椎椎體變得稀疏;相對于對照組,隨著PM2.5懸濁液暴露濃度增高,腰椎椎體骨間隙變大,完整性破壞甚至斷裂。從圖3中A6-D6可見,隨著PM2.5懸濁液暴露濃度增高,骨小梁變得更加不連續(xù),間隙增大、數(shù)量減少甚至缺損,桿狀結(jié)構(gòu)增多。

        注:A 對照組;B 低劑量組;C 中劑量組;D 高劑量組。圖3 各組大鼠腰椎及其骨小梁的micro-CT三維重建圖Fig.3 Three-dimensional micro-CT reconstruction of the lumbar vertebrae and its trabeculae in rats of each group

        3 討論

        絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的特征是骨量減少,骨組織微結(jié)構(gòu)惡化,導(dǎo)致骨脆性增加,繼而增加骨折的風(fēng)險,因此早期識別其發(fā)生具有重要意義。有研究者通過對去卵巢后的SD大鼠腰椎骨微結(jié)構(gòu)動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),去勢后SD大鼠的骨吸收大于骨形成,骨微結(jié)構(gòu)開始改變且在去卵巢后的第12周后才顯現(xiàn)出骨質(zhì)疏松癥狀[6]。本研究參照此方法,在去勢前后都對雌性SD大鼠行氣道滴注PM2.5懸濁液,旨在觀察PM2.5是否會加重雌性SD大鼠絕經(jīng)后骨量減少。

        眾多研究表明,空氣中的細顆粒物PM2.5可以引發(fā)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多系統(tǒng)疾病而對骨骼系統(tǒng)的影響及其機制研究較少。Micro-CT分辨率高、無創(chuàng),檢測時可以精確定位所觀察區(qū)域,因此是研究骨小梁結(jié)構(gòu)的重要工具。本研究的結(jié)果表明,PM2.5暴露使去勢雌性SD大鼠的脛骨、股骨以及腰椎骨小梁數(shù)量減少和骨小梁分離度增加,脛骨的各組骨微結(jié)構(gòu)差異相對比較明顯;在股骨和腰椎的骨微結(jié)構(gòu)改變中,相對于對照組,中、高劑量組有一定的差異。說明PM2.5暴露對于去勢后雌性SD大鼠脛骨骨微結(jié)構(gòu)的改變較為明顯,使骨量減少,而一定濃度的PM2.5暴露也可以改變股骨和腰椎的骨量。由此可見,對于空氣污染嚴重的城市,關(guān)注絕經(jīng)后人群骨骼健康尤為重要。

        micro-CT三維重建圖中可以更直觀地看出各組間的松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的顯著差異,有研究者對骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折進行micro-CT影像學(xué)分析,結(jié)果提示micro-CT檢測對于骨小梁骨微結(jié)構(gòu)的變化更為敏感和準確,已經(jīng)是一種廣泛應(yīng)用的無創(chuàng)新興技術(shù)[7]。松質(zhì)骨為多孔的疏松結(jié)構(gòu),具有不均一性和各向異性,檢測其骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的改變對于預(yù)測骨強度的改變具有重要意義:骨小梁骨密度反映骨量的多少,骨密度降低即骨量丟失;骨小梁數(shù)量減少、骨小梁分離度變大、骨小梁厚度變小都反映了骨量減少;結(jié)構(gòu)模型指數(shù)反映骨小梁板狀和桿狀梁比值大小,骨量減少時,板狀骨小梁減少,桿狀骨小梁增加,即結(jié)構(gòu)模型指數(shù)數(shù)值增加[8]。本研究中檢測指標符合骨量減少趨勢,說明PM2.5暴露可致絕經(jīng)后脛骨、股骨、腰椎骨量減少。卵巢切除術(shù)可誘導(dǎo)高骨周轉(zhuǎn)率和快速骨量丟失的狀態(tài),在8~9個月內(nèi)建立新的穩(wěn)定的骨量[9]。而我們建模一般選擇去勢后3~4個月檢測相關(guān)指標改變,從結(jié)果看脛骨的大部分指標相對于對照組有明顯改變,股骨和腰椎則不明顯,提示我們,脛骨對于雌激素缺乏以及PM2.5暴露所引起的改變更為敏感。從micro-CT三維重建圖也可發(fā)現(xiàn)脛骨各組結(jié)構(gòu)改變尤為明顯,而股骨和腰椎各組其骨小梁結(jié)構(gòu)改變差異相對不明顯,但是骨小梁片狀結(jié)構(gòu)也是減少,桿狀結(jié)構(gòu)相對增多。

        有學(xué)者[10]通過研究PM2.5影響老年雄性大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的改變,其結(jié)果提示長期暴露于PM2.5環(huán)境中,骨髓中的成骨細胞可能通過RANKL/OPG信號通路途徑,釋放RANKL與破骨細胞上的RANK受體結(jié)合,從而誘導(dǎo)產(chǎn)生更多成熟的破骨細胞,使骨吸收增強,打破了骨吸收和骨形成的平衡過程,導(dǎo)致老年骨質(zhì)疏松的發(fā)生。眾所周知,絕經(jīng)后卵巢功能減退,雌激素水平低下,骨代謝相關(guān)指標發(fā)生異常變化,即發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的概率增加。本研究證明處于PM2.5環(huán)境中,去勢的雌性SD大鼠骨小梁的骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生骨質(zhì)疏松樣改變,證明PM2.5暴露可加重絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展進程。因此,研究PM2.5暴露對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的影響及其相關(guān)發(fā)病機制,通過阻斷和抑制相關(guān)信號途徑來達到治療或者減緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生,對于提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。

        綜上,PM2.5暴露可引發(fā)或者加重絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生,其具體機制還有待于進一步研究。本研究所檢測數(shù)量相對較少,日后還有待收集更多相關(guān)臨床樣本等做進一步的研究和驗證。

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