謝允東，王小平，何世鵬

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 西咸新區(qū)712046；2.上海大學(xué)，上海200444）

黃藥子為薯蕷科薯蕷屬黃獨(dú)Dioscorea bulbiferaL.多年生草質(zhì)纏繞藤本植物的地下塊莖，藥用歷史悠久，味辛、苦，性涼，有小毒，歸肝、胃、心、肺經(jīng)，具有解毒消腫、化痰散結(jié)、涼血止血功效［1－2］。內(nèi)服用于治療甲狀腺腫大、淋巴結(jié)結(jié)核、咽喉腫痛、吐血、咯血、百日咳、癌腫；外用可治療瘡癤［3－4］。黃藥子療效確切，但隨著其臨床應(yīng)用的增加，主要不良反應(yīng)肝損傷［5－7］逐漸顯現(xiàn)，從而限制了其臨床應(yīng)用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃藥子誘導(dǎo)的肝損傷與氧化應(yīng)激和炎性損傷有關(guān)。芝麻酚是芝麻中的有效成分，具有較好的抗氧、抗炎等作用［8－10］。本研究中探討了芝麻酚對黃藥子誘導(dǎo)小鼠肝損傷的改善作用及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：DYY－PAGE型電泳儀、DYCP－40C型轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠）；WD－9405F型水平搖床（北京六一儀器廠）；Smart Plus－N型超純水系統(tǒng)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；H1850型超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；ELX808型全波長酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；DH43L型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

試藥：黃藥子（陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號為20190920）；芝麻酚（批號為D050385），水飛薊素（批號為D110160），購自上海安耐吉試劑公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為20201211），過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號為20201128），還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（批號為20201105），丙二醛（MDA）試劑盒（批號為20201208），均購自南京建成生物工程研究所；全蛋白提取試劑盒（批號為WLA019），核蛋白和漿蛋白提取試劑盒（批號為WLA020a），BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號為WLA004），SDS－PAGE凝膠快速制備試劑盒（批號為WLA013），ECL發(fā)光液（批號為WLA003），核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF－κB）p65抗體（批號為WL01273b），p－NF－κBp65抗體（批號為WL02169），核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）抗體（批號為WL012135），血紅素加氧酶－1（HO－1）抗體（批號為WL02400），腫瘤壞死因子－α（TNF－α）抗體（批號為WL01581），白細(xì)胞介素6（IL－6）抗體（批號為WL02841），羊抗兔IgGHRP（批號為WL023），內(nèi)參抗體Histone H3（批號為WL0984a），內(nèi)參抗體β－actin（批號為WL01372），均購自沈陽萬類生物科技有限公司；PVDF膜（美國Millipore公司，批號為IPVH00010）。

動物：SPF級健康KM小鼠48只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2020－030，動物使用許可證號SYXK（陜）2017－004，實(shí)驗(yàn)動物合格證號0043206。飼養(yǎng)條件，SPF級實(shí)驗(yàn)室，溫度22～24℃，相對濕度45%～65%。本動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審批，按要求開展。

1.2 方法

黃藥子提取物制備：取黃藥子飲片適量，粉碎得粗粉，浸泡2 h后用8倍量75%乙醇溶液回流提取，每次4 h，提取3次，合并醇提液，濃縮并減壓干燥，得干粉，備用。

分組及給藥：將48只小鼠分為正常對照組（等體積0.2%CMC－Na溶液）、模型組（等體積0.2%CMC－Na溶液）、水飛薊素組（200 mg／kg）及芝麻酚低、中、高劑量組（6，12，24 mg／kg）。正常對照組小鼠僅灌胃等體積0.2%CMC－Na溶液，其余各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物及黃藥子75%乙醇提取物（18 g／kg），每日1次，持續(xù)30 d。

1.3 檢測指標(biāo)

血漿生化指標(biāo)：給藥30 d后，小鼠禁食不禁飲12 h，之后眼眶取血，置帶抗凝劑的EP管中，冰浴靜置30 min，4℃條件下4 000 r／min離心10 min，取上層血漿，－20℃保存，待測。采用全自動生化分析儀測定小鼠血漿中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBiL）水平。檢測小鼠血漿中SOD，CAT，GSH，MDA水平。

組織病理學(xué)：小鼠眼眶取血后處死，解剖，取肝臟，去除多余的瘀血和結(jié)締組織，將部分肝臟組織固定于4%多聚甲醛溶液中，72 h后依次進(jìn)行包埋切片、切片脫蠟至水、蘇木素－伊紅（HE）染色、脫水、透明、封片，光鏡下觀察肝組織病理變化。

肝組織分子生物學(xué)：取肝臟，在液氮中研磨，加入1mL RIPA蛋白裂解液，冰上勻漿，每隔5 min超聲20 s。裂解30 min后，4℃條件下12 000 r／min離心20 min，取上清液，以BCA法檢測蛋白含量。各組取20 μg上樣，10% SDS－PAGE電泳后濕法電轉(zhuǎn)，恒流250 mA冰上轉(zhuǎn)膜90 min至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST清洗3次，加入NF－κBp65，p－NF－κBp65，Nrf2，HO－1，TNF－α，IL－6（1∶500），Histone H3，β－actin一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜?；厥找豢梗琓BST清洗3次，加入二抗（1∶5 000）37℃條件下孵育45 min，用TBST清洗3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，將PVDF膜放入暗盒中，壓上X膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。然后，通過Gel－Pro－Analyzer軟件將條帶灰度值數(shù)字化，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad Prism 8.0軟件繪制檢測結(jié)果的柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織病理學(xué)

肝臟組織HE染色顯示，正常對照組小鼠肝臟肝板呈放射狀，肝細(xì)胞正常，邊緣清晰，肝細(xì)胞核正常；模型組小鼠肝細(xì)胞腫脹，炎性因子浸潤，邊緣清晰，部分肝細(xì)胞核溶解。水飛薊素組肝細(xì)胞腫脹、浸潤，損傷等狀況明顯改善。芝麻酚低、中、高劑量組細(xì)胞腫脹降低，浸潤減少，肝細(xì)胞損傷明顯改善，隨著劑量的升高，改善作用更好。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理切片（HE，×200）A.Normal control group B.Model group C.Silymarin group D－F.Low－dose，medium－dose，high－dose sesamol groups Fig.1 Pathological sections of liver tissues of mice in each group（HE，×200）

2.2 肝功能指標(biāo)

與正常對照組比較，模型組小鼠血漿中ALT，AST，TBiL水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊素組和芝麻酚低、中、高劑量組小鼠血漿中ALT，AST，TBiL水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖2。

圖2 各組小鼠肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果（±s ，n＝8）A.ALT B.AST C.ALP D.TBiLNote：group a is normal control group，group b is model group，group c1－c3 are low－dose，medium－dose，high－dose sesamol groups respectively，group d is silymarin group；compared with those in group a，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；compared with those in group b，*P＜0.05，**P＜0.01；as well as the following figures.Fig.2 Test results of the liver function indexes of mice in each group（±s，n＝8）

2.3 抗氧化指標(biāo)

與正常對照組比較，模型組小鼠血漿中SOD，CAT，GSH水平均顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊素組和芝麻酚高劑量組小鼠血漿中SOD和CAT水平均顯著升高，芝麻酚高、中劑量組GSH水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），水飛薊素組和芝麻酚高、中、低劑量組MDA水平均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組小鼠抗氧化指標(biāo)檢測結(jié)果（±s，n＝8）A.SOD B.CAT C.GSH D.MDAFig.3 Test results of the antioxidant indexes of mice in each group（±s，n＝8）

2.4 肝組織勻漿炎性指標(biāo)

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織勻漿中p－NF－κBp65，TNF－α，IL－6蛋白表達(dá)水平均顯著升高，Nrf2和HO－1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，水飛薊素組和芝麻酚低、中、高劑量組小鼠肝組織勻漿中p－NF－κBp65，TNF－α，IL－6蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Nrf2和HO－1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），且呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果見圖4。

圖4 芝麻酚對黃藥子誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織勻漿相關(guān)因子、蛋白表達(dá)水平（n＝3）A.p－NF－κBp65 B.TNF－α C.IL－6 D.Nrf2 E.HO－1Fig.4 Effect of sesamol on the expression of related factors and proteins in liver tissues of mice with liver injury induced by Rhizoma Dioscoreae Bulbiferae（n＝3）

3 討論

黃藥子對甲狀腺疾病等有顯著臨床療效，但長期或大劑量服用會導(dǎo)致肝損傷，其損傷機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)［11］。黃藥子作用于肝細(xì)胞誘發(fā)產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS），并累積于肝細(xì)胞內(nèi)，過量ROS的產(chǎn)生超出了抗氧化體系的抗氧化能力，氧化應(yīng)激還可能通過免疫激活釋放炎性因子直接介導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肝臟炎癥和細(xì)胞壞死［12－13］。本研究結(jié)果表明，小鼠給予黃藥子75%乙醇提取物后，肝功能指標(biāo)ALT，AST，TBiL水平均顯著升高，而給予芝麻酚干預(yù)后能顯著降低上述指標(biāo)水平，說明芝麻酚對黃藥子誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有改善作用。肝臟組織病理切片實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明芝麻酚對黃藥子誘導(dǎo)的肝損傷有改善作用。

NF－κB與機(jī)體炎性反應(yīng)關(guān)系密切［14－15］，磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游系列炎性因子的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，給予黃藥子提取物后，小鼠肝組織中p－NF－κBp65，TNF－α，IL－6蛋白表達(dá)水平均顯著升高，說明肝組織產(chǎn)生了炎性反應(yīng)。給予芝麻酚干預(yù)后，p－NF－κBp65，TNF－α，IL－6蛋白表達(dá)水平均顯著下降，說明芝麻酚對黃藥子誘導(dǎo)小鼠肝臟產(chǎn)生的炎性反應(yīng)有顯著抑制作用，可能與其抑制NF－κB磷酸化有關(guān)。Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可與抗氧化物元件（ARE）結(jié)合調(diào)控抗氧化物的表達(dá)，Nrf2被激活可誘導(dǎo)其下游HO－1的表達(dá)及其他的抗氧化酶的表達(dá)［16－17］。本研究結(jié)果顯示，給予黃藥子75%乙醇提取物后，血漿中抗氧化酶SOD，CAT，GSH水平均顯著降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平顯著增加，肝組織中Nrf2和HO－1表達(dá)水平均顯著下調(diào)，說明黃藥子75%乙醇提取物誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，給予芝麻酚干預(yù)后，抗氧化酶水平顯著升高，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著減少，肝組織中Nrf2和HO－1表達(dá)水平顯著升高，說明芝麻酚對黃藥子誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的氧化應(yīng)激具有改善作用，可能與其激活Nrf2蛋白后增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化酶有關(guān)。

綜上所述，芝麻酚對黃藥子75%乙醇提取物誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有一定防護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Nrf2／NF－κB信號通路而提高機(jī)體的抗氧化和抗炎能力有關(guān)。