申安平 王炳森 李 桓 李松偉

(河南中醫(yī)藥大學2019級碩士研究生，河南 鄭州 450000)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以累及四肢小關(guān)節(jié)為主的自身免疫性關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率高，致殘性較大，易合并多種疾病(如肺間質(zhì)纖維化、干燥綜合征等)[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學治療RA主要以改善臨床癥狀，延緩病情進展為主，然而其骨髓抑制及胃腸道不適等副作用導致患者依從性不高。

RA屬中醫(yī)學“痹證”范疇，《素問·痹論》將其分為“痛痹”“行痹”“著痹”。隨著對痹證認識的不斷發(fā)展，人們已逐漸完善其病因病機，形成了活血為主兼健脾化痰、滋補肝腎等療法[3-5]。隨著現(xiàn)代化的不斷發(fā)展，中醫(yī)藥的研究也逐漸與當今主流信息技術(shù)相結(jié)合，并在用藥規(guī)律、名老中醫(yī)經(jīng)驗傳承及藥理研究開發(fā)等方面取得了重要的成果[6-8]。基于此，本研究運用現(xiàn)代信息技術(shù)對古代中醫(yī)痹證用藥規(guī)律進行研究總結(jié)，以期發(fā)現(xiàn)其用藥規(guī)律和配伍特點，并通過構(gòu)建“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型，闡釋其治療RA的具體機制，為臨床中藥治療RA提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 在《中華醫(yī)典》中搜索“痹證”“痹病”“痹痛”“痛痹”“歷節(jié)”“鶴膝風”等關(guān)鍵詞，共檢索到1456首方劑。

1.2 納入標準 治療上具有完整的功能主治，并且組方完整的方劑。

1.3 排除標準 ①具體組方藥物相同，但方劑名稱不同；②摘選同一方書，方劑名稱相同、主治相同，但藥味較少的方劑；③明確用于外敷的方劑。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理 共收集585首方劑，將上述方劑以0和1的方式輸入Excel表中，建立中藥數(shù)據(jù)庫。對藥物的名稱和分類按照《中華人民共和國藥典》2015年版進行規(guī)范統(tǒng)一。

1.5 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS Statistics 26軟件對納入的藥物進行統(tǒng)計描述及系統(tǒng)聚類，采用SPSS Modeler 18.0中的Apriori建模進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。

1.6 成分及靶點的收集 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫篩選得到當歸-川芎的活性成分[9]，整理TCMSP、瑞士靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫(Swiss Target Prediction)、人類基因和網(wǎng)絡(luò)功能分析數(shù)據(jù)庫(GenCLiP 3.0)中的藥物疾病靶點[10]，用Venny平臺進行藥物和疾病靶點映射，獲得當歸-川芎治療RA的作用靶點。

1.7 通路富集分析及模型構(gòu)建 將上述作用靶點導入注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(DAVID)中[11]，獲得富集通路，運用功能蛋白協(xié)作網(wǎng)絡(luò)(STRING)數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-通路”模型和蛋白互作模型[12]。

1.8 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路可視化 將作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫KEGG模塊中，選擇Search&Color Pathway功能，導出整合并可視化相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 藥物使用情況 將585首方劑中出現(xiàn)的中藥進行排序，共出現(xiàn)中藥156味，累計出現(xiàn)6165次。其中出現(xiàn)頻數(shù)≥50次的藥物共34種(總頻數(shù)3656次)，排名靠前的為當歸263次(7.19%)、防風203次(5.55%)、羌活179次(4.90%)、川芎175次(4.79%)。依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015版將藥物規(guī)范化后，將高頻藥物(≥50次)進行分類，使用較多的為解表和活血化瘀藥。使用頻數(shù)≥50次的藥物見表1，藥物分類見圖1。

圖1 藥物分類

表1 使用頻數(shù)≥50次藥物

2.2 高頻藥物系統(tǒng)聚類分析 采用SPSS Statistics 26軟件對高頻藥物(≥50次)進行系統(tǒng)聚類，由圖可知，其中1類為當歸-川芎，2類為防風-羌活，聚類分析樹狀圖見圖2。

圖2 聚類分析樹狀圖

2.3 高頻藥物關(guān)聯(lián)分析 采用SPSS Modeler 18.0軟件對高頻藥物(≥50次)進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，選擇Apriori建模得出藥物之間的配伍關(guān)系，設(shè)定支持度>10%，置信度>70%，獲得核心藥對10個，有當歸-川芎、牛膝-杜仲等。見表2。

表2 高頻藥物的關(guān)聯(lián)表

2.4 成分及靶點的收集 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中設(shè)定口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18篩選得到當歸-川芎的活性成分9個。整理TCMSP、Swiss Target Prediction、GenCLiP 3.0數(shù)據(jù)庫中靶點后獲得9個治療RA的作用靶點，具體成分見表3。

表3 當歸-川芎的主要活性成分及其OB和DL值

2.5 蛋白互作模型構(gòu)建 將當歸-川芎治療RA的9個作用靶點導入String數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape軟件中可視化。圖中前3位的靶點蛋白主要為STAT3、JUN、MAPK14，該網(wǎng)絡(luò)提示當歸-川芎的作用靶點在治療RA過程中存在著相互協(xié)同，而靶點的相互協(xié)同恰恰可能是當歸-川芎增強治療的作用機制。見圖3。

2.6 富集通路分析 KEGG結(jié)果顯示當歸-川芎的富集通路主要在腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路、B細胞受體信號等通路上，結(jié)果表明當歸-川芎的作用靶點富集在多個通路內(nèi)，并可通過協(xié)調(diào)多條通路來發(fā)揮治療RA的作用。見圖4。

圖4 KEGG富集通路圖

2.7 “藥物-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建 將上述數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件中進行可視化，結(jié)果表明當歸-川芎的9個活性成分與作用靶點有關(guān)聯(lián)的共7個，活性成分排名較前的為β-谷甾醇、楊梅酮，靶點排名較前的為PTGS2、PIK3D、MAPK14，主要的通路為TNF信號通路、JAK-STAT信號通路、VEGF信號通路。見圖5。

圖5 藥物-成分-靶點-通路-疾病圖

2.8 通路的可視化 將當歸-川芎的9個作用靶點導入KEGG數(shù)據(jù)庫中進行通路可視化，圖中描述了TNF信號通路、JAK-STAT信號通路、VEGF等信號通路分布情況，結(jié)果表明作用靶點大多集中在發(fā)揮功效的關(guān)鍵之處。見圖6。

圖6 部分KEGG通路富集結(jié)果

3 討論

RA早期的病理改變主要為滑膜炎及血管翳的形成，晚期常會導致四肢關(guān)節(jié)的腫脹、侵蝕[13]。RA屬中醫(yī)學“痹證”范疇，痹者，閉塞不通也，其病名最早可追溯至《內(nèi)經(jīng)》[14]。中醫(yī)學認為，痹證為感受淫毒邪氣, 或勞倦、情志失調(diào)導致臟腑、氣血、陰陽失衡所致。痹證日久則形成瘀滯痰停、肝腎虧虛之證，治法常以活血化瘀兼補肝腎為主。中醫(yī)在痹證治療方面經(jīng)驗豐富，對RA的認識和治療也具有其獨特的優(yōu)勢，然而目前傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療RA的用藥規(guī)律和具體機制尚不清楚。現(xiàn)代信息技術(shù)具有大數(shù)據(jù)分析處理和藥物分子對接能力，因此借助這一特性可以系統(tǒng)了解其治療RA的用藥規(guī)律和作用機制。

本研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)古代痹證的治療中使用頻數(shù)較多的藥物為當歸、防風、羌活、川芎等，運用最多的藥物類別是解表藥、活血化瘀藥和補虛藥，聚類分析樹狀圖可以分為當歸-川芎、防風-羌活等幾類。提示在RA的辨證中要考慮是否合并血瘀證和風寒表證，治療中可適當多選用當歸-川芎、防風-羌活等藥對。其次，本研究還發(fā)現(xiàn)在臨床用藥選擇方面，除祛風解表、活血化瘀藥外，多隨證配伍祛風濕、補虛類藥物，提示RA治法著重祛風解表、活血化瘀，兼顧祛風濕、補肝腎。

Modeler關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)古方關(guān)聯(lián)度較強的藥對有10對，提示臨床用藥時應(yīng)注重當歸、川芎、羌活、防風等藥物之間的配伍。從關(guān)聯(lián)度較強的藥對組合當歸-牛膝-川芎(活血化瘀藥-活血化瘀藥-活血化瘀藥)、牛膝-杜仲-當歸(活血化瘀藥-補虛藥-活血化瘀藥)可以看出，對于RA的研究未來應(yīng)注重從活血化瘀和補肝腎等相互配伍進行研究。

本研究通過設(shè)定OB和DL值篩選得到當歸-川芎9個活性成分，在與藥物疾病靶點映射后共獲得9個治療靶點，最終富集分析當歸-川芎中治療RA的通路機制主要有9條。RA作為免疫炎性疾病，主要致病炎癥因子為TNF因子，通過阻斷TNF信號通路，可以減輕TNF炎癥因子引起的血管和關(guān)節(jié)的損害[15]，臨床TNF拮抗劑證實有效[16-17]。JAK-STAT信號通路是人體內(nèi)為數(shù)不多的炎癥調(diào)節(jié)通路，在免疫和炎癥過程中具有重要意義[18-19]，該通路主要通過提高基質(zhì)金屬蛋白酶的表達從而造成RA的持續(xù)滑膜炎，因此調(diào)節(jié)該通路可能達到治療RA 的作用[20]，當歸、川芎很可能通過靶點JAK1、JAK2干預(yù)JAK-STAT信號通路進而治療RA。VEGF信號通路與滑膜血管生成有關(guān)，成為近年來治療RA的熱點通路[21-22]，眾多的基礎(chǔ)實驗表明通過調(diào)節(jié)VEGF信號通路治療RA是一個可行之法[23-24]，當歸-川芎靶點在本通路的富集，表明其通過調(diào)節(jié)VEGF信號通路治療RA的潛力。此外，當歸-川芎還可能通過調(diào)節(jié)B細胞受體信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等發(fā)揮治療作用。上述結(jié)果表明，中藥治療RA是多成分、多靶點、多通路過程，在生物制劑時代仍具有不可忽視的治療前景。

本研究通過分析古代中醫(yī)治療痹證的方劑，總結(jié)了傳統(tǒng)中藥治療RA用藥規(guī)律及其潛在藥理機制，為RA臨床辨證治療提供了思路和依據(jù)，為開發(fā)治療RA的藥物提供了一些新的啟發(fā)。但本研究藥理分析部分主要基于信息技術(shù)來進行數(shù)據(jù)的挖掘預(yù)測，因此結(jié)果具有一定的局限性，下一步我們就網(wǎng)絡(luò)藥理學的預(yù)測結(jié)果開展相關(guān)實驗研究，進一步明確當歸-川芎治療RA的機制。