閆雷，丁工堯，楊鳳霞，阮蓉，韓秉君，支蘇麗*，張克強(qiáng)*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191；3.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

由于抗生素具有提高畜禽生長(zhǎng)速度、預(yù)防和治療畜禽疾病的作用，因此其在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中的使用較為廣泛，據(jù)專(zhuān)家統(tǒng)計(jì)，我國(guó)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)方面的抗生素占全國(guó)抗生素總使用量的52%[1]。但大量與長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)增加畜禽腸道中耐藥菌的產(chǎn)生與累積，耐藥菌與糞便共同進(jìn)入環(huán)境，使畜禽糞便成為環(huán)境中抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的重要來(lái)源[2]。此外，由于ARGs 不僅在垂直轉(zhuǎn)移方式上可親代傳遞，其還具有水平轉(zhuǎn)移的能力，可在養(yǎng)殖場(chǎng)周邊的環(huán)境介質(zhì)微生物中傳播和擴(kuò)散[3]，甚至?xí)U(kuò)散到致使人類(lèi)患病的細(xì)菌中，從而威脅到人類(lèi)健康[4]。已有很多學(xué)者對(duì)不同畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)及周邊環(huán)境中ARGs 的污染狀況進(jìn)行了研究，研究主要集中在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便、污水以及糞肥還田后土壤中ARGs 的污染豐度和種類(lèi)方面。例如，閆書(shū)海[5]對(duì)浙江和杭州不同規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)（豬、雞和鴨）的糞便和污水中2 類(lèi)典型ARGs 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類(lèi)的tetA、tetG、tetM、tetO、tetQ、tetW 與磺胺類(lèi)的sul1、sul2 在所有樣品中均有檢出，且磺胺類(lèi)ARGs 的相對(duì)豐度普遍高于四環(huán)素類(lèi)；彭晶等[6]在施糞肥后的土壤中檢出了大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)中的erm35、ermB、ermT、ermX、ermF 和erm36，其中豐度最高和最低的分別為ermB 和erm36；MCKINNEY等[7]在豬場(chǎng)和雞場(chǎng)氧化塘沉積物中檢測(cè)出磺胺類(lèi)ARGs（sul1 和sul2）和四環(huán)素類(lèi) ARGs（tetO 和tetW），且含量為豬場(chǎng)高于雞場(chǎng)；YUAN 等[8]在武漢畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的廢水中檢測(cè)到了四環(huán)素類(lèi)tetA、磺胺類(lèi)sul1 以及喹諾酮類(lèi)oqxB 等常見(jiàn)的ARGs。

綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外研究主要聚焦于ARGs 的污染水平和種類(lèi)等污染特征分析。然而，隨著集約化養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)展和在環(huán)保要求下，畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)采用的不同糞污處理工藝，糞污中污染物的轉(zhuǎn)歸和降解日益受到重視，但是這些糞污處理工藝對(duì)ARGs 的去除效果仍不太清楚，尤其是完全針對(duì)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便和污水不同處理工藝中ARGs 的賦存規(guī)律與去除效果的研究十分有限。因此，本文以天津市豬場(chǎng)、牛場(chǎng)、雞場(chǎng)中典型糞污處理工藝為研究對(duì)象，研究目的：（1）分析不同畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)新鮮糞污中ARGs 的總體污染特征；（2）探討不同養(yǎng)殖場(chǎng)污水處理工藝對(duì)ARGs 的總體去除效果，以及不同處理單元中ARGs 的賦存規(guī)律；（3）比較不同糞便處理工藝對(duì)ARGs 的去除效果，以及關(guān)鍵環(huán)節(jié)中ARGs 的賦存規(guī)律。從而為控制我國(guó)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中ARGs 污染與減少周邊環(huán)境耐藥性傳播提供科學(xué)依據(jù)，為養(yǎng)殖場(chǎng)糞污中ARGs 的消減提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖場(chǎng)的基本信息

本次試驗(yàn)選取天津市具有較為常見(jiàn)、通用和完整的糞污處理工藝的3 類(lèi)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)為研究對(duì)象，其中牛場(chǎng)糞便的處理方式主要是堆肥和滅菌晾曬作墊料，兩者基本原理均為好氧發(fā)酵，區(qū)別主要是滅菌作墊料處理是為了保護(hù)牛的健康增加滅菌流程；雞場(chǎng)糞便的處理方式為堆肥；豬場(chǎng)使用異位發(fā)酵床對(duì)畜禽糞便進(jìn)行處理，異位發(fā)酵床與堆肥基本原理均為好氧發(fā)酵，但異位發(fā)酵床中有芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌等多種菌株參與。牛場(chǎng)和豬場(chǎng)對(duì)污水的處理方式都主要以厭氧發(fā)酵為主。三家養(yǎng)殖場(chǎng)糞污處理工藝流程如圖1所示。

牛場(chǎng)，豬場(chǎng)和雞場(chǎng)的地理位置分別為39°14′29″N、117°34′12″E，39°21′31″N、117°46′01″E 和39°44′33″N、117°14′18″E；存欄量分別為2 000、1 500 頭和600 000 只；糞便日排放量分別為4 000、30 000 kg·d-1和60 000 kg·d-1，牛場(chǎng)和豬場(chǎng)污水日排放量分別為20 000 L·d-1和72 000 L·d-1。

1.2 樣品的采集、運(yùn)輸和保存

試驗(yàn)樣品采集于2019年7月上旬，采集的樣品為畜禽新鮮糞污，以及各處理單元中糞污，具體采樣點(diǎn)如圖1 所示。采集液體樣品時(shí)，均設(shè)置多點(diǎn)采集，然后混合均勻?yàn)? 份樣品，連續(xù)采樣3 d，作為每個(gè)采樣點(diǎn)的3 個(gè)平行樣品，共計(jì)27 個(gè)樣品（豬場(chǎng)12 個(gè)和牛場(chǎng)15 個(gè)）；固體樣品為多點(diǎn)采集并混合為均一樣品，不同采樣點(diǎn)采集3 個(gè)平行樣品，共計(jì)45 個(gè)樣品（豬場(chǎng)9個(gè)、牛場(chǎng)15 個(gè)和雞場(chǎng)21 個(gè)）。采集后的樣品放到含有冰袋的白色泡沫箱中，低溫儲(chǔ)存，5 h 內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室-20 ℃的冰箱保存，等待處理。

1.3 樣品的預(yù)處理

固體樣品放入冷凍干燥機(jī)中去除水分，并將得到的干樣磨碎，混合，過(guò)2 mm 的網(wǎng)篩，液體樣品過(guò)5μm濾膜以去除漂浮的雜質(zhì)。在提取DNA 前，將樣品于-20 ℃冷凍儲(chǔ)存。

1.4 基因組DNA的提取與PCR反應(yīng)

試驗(yàn)使用的Fast DNA SPIN Kit for soil 試劑盒購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)MP Biomedicals 生物醫(yī)藥公司，對(duì)樣品DNA的提取嚴(yán)格遵守試劑盒的操作指南，提取出DNA 的純度采用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)。以目標(biāo)DNA 模板進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，包括12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix（0.1 U·μL-1Taq DNA Polymerase、2×PCR buffer、3 mmol·L-1MgCl2和0.4 mmol·L-1dNTPs），前后端引物各0.5 μL（10 μmol·L-1），0.5 μL DNA 模板和 11 μL ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 30 s，退火 30 s 后，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)?；蛞锏脑敿?xì)信息如表1所示。反應(yīng)結(jié)束后，采用DNA 凝膠電泳檢測(cè)，觀察條帶是否有目的基因存在。

表1 PCR引物的詳細(xì)信息Table 1 The detail information of PCR primer

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR）檢測(cè)

試驗(yàn)檢測(cè)目標(biāo)包含四環(huán)素類(lèi)（tetX、tetW、tetQ、tetO 和tetL）、磺胺類(lèi)（sul1 和sul2）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（ermB和ermC）、喹諾酮類(lèi)（oqxB、qnrB 和qnrS）、鏈霉素類(lèi)（strA）抗性基因以及基因元件intI1，PCR 引物的詳細(xì)信息如表 1 所示。qPCR 的反應(yīng)體系為 20 μL：TB Green Premix Ex Taq 10.0 μL、前后端引物各0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、ddH2O 6.8 μL 和DNA 模板（已稀釋10 倍）2 μL（對(duì)照以ddH2O 為模板），3 個(gè)平行，用7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems美國(guó)）進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR 檢測(cè)。qPCR 擴(kuò)增過(guò)程：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 34 s，40 個(gè)循環(huán)。在60~95 ℃之間進(jìn)行熔點(diǎn)曲線(xiàn)分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[9]計(jì)算出目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，隨后計(jì)算出目的基因的相對(duì)豐度（ARGs 拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù)）。抗性基因去除率計(jì)算公式：

式中：j表示特定的基因?yàn)榛騤處理前的相對(duì)豐度為基因j處理后的相對(duì)豐度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

相對(duì)豐度、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和lg 值在Excel 2007中計(jì)算；使用R 軟件的Pheatmap 制作熱圖；堆積柱狀圖使用Origin2017繪制；采樣流程圖使用Word繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)原始糞污中ARGs的污染特征

新鮮糞污中ARGs 的豐度和種類(lèi)如圖2 所示，13種ARGs 與intI1 在被檢測(cè)樣品中全部檢出，這表明目標(biāo)ARGs 在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞污中普遍存在。值得注意的是，在養(yǎng)殖場(chǎng)糞污的5 類(lèi)ARGs 中，喹諾酮類(lèi)ARGs的相對(duì)豐度最低，為10-7~10-5，四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)ARGs 的相對(duì)豐度普遍較高，分別為10-4~10-1和10-4~10-2，其原因可能是養(yǎng)殖場(chǎng)糞污中四環(huán)素和磺胺類(lèi)抗生素殘留水平較高。例如，阮蓉等[18]在檢測(cè)天津市20家牛場(chǎng)、豬場(chǎng)和雞場(chǎng)糞污中的抗生素殘留情況后，發(fā)現(xiàn)3 種畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中四環(huán)素類(lèi)抗生素污染水平較高，這可能是導(dǎo)致四環(huán)素類(lèi)ARGs 污染水平較高的原因。對(duì)于不同畜禽糞便，3 個(gè)畜種養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中ARGs 的污染特征有較大差異，雞場(chǎng)和豬場(chǎng)糞便中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ARGs 的相對(duì)豐度（10-4~10-2）明顯高于牛場(chǎng)（10-6~10-5）；雞場(chǎng)和牛場(chǎng)中磺胺類(lèi)ARGs 的相對(duì)豐度（4.85×10-4~1.36×10-3）低于豬場(chǎng)（1.36×10-3~3.63×10-3）。此外，雞場(chǎng)和豬場(chǎng)糞便中目標(biāo)四環(huán)素類(lèi)ARGs 的相對(duì)豐度普遍較高（10-4~10-1），這與鄒威等[19]對(duì)華北地區(qū)雞場(chǎng)和豬場(chǎng)糞便中ARGs 的相對(duì)豐度比較后的結(jié)果相似，這可能與四環(huán)素類(lèi)抗生素使用量大以及該類(lèi)ARGs較高的水平擴(kuò)散能力有關(guān)。豬場(chǎng)和牛場(chǎng)污水中ARGs 的污染特征如圖 2 中 PW 和 CW 所示，除喹諾酮類(lèi)外，其他類(lèi)ARGs 污染水平普遍較高，這說(shuō)明養(yǎng)殖污水同樣是ARGs 的儲(chǔ)存庫(kù)。值得注意的是，豬場(chǎng)污水中四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ARGs 的相對(duì)豐度（10-3~10-2）明顯高于牛場(chǎng)的（10-6~10-4），這與ZHANG 等[20]對(duì)豬場(chǎng)和牛場(chǎng)污水中ARGs 豐度的對(duì)比結(jié)果一致。

2.2 豬場(chǎng)和牛場(chǎng)污水處理工藝對(duì)ARGs的去除效果

2.2.1 豬場(chǎng)污水中ARGs的去除效果

豬場(chǎng)污水各處理單元中13 種ARGs 和基因元件intI1 的相對(duì)豐度如圖3（A）所示，除在氧化塘中未檢出qnrB 外，其余ARGs 均在所有處理單元中檢出。5類(lèi)目標(biāo)ARGs 中，喹諾酮類(lèi)ARGs 的相對(duì)豐度最低，為4.31×10-7~9.61×10-5，其余 ARGs 的相對(duì)豐度普遍較高，其中四環(huán)素類(lèi) ARGs 中tetO 和tetL（10-3~10-2）普遍高于tetX 和tetQ（10-4~10-3），大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermB 的相對(duì)豐度（10-3~10-2）普遍高于ermC（10-4~10-2）。

表2 為豬場(chǎng)污水中13 種ARGs 及基因元件intI1在各處理單元中的去除效果和總?cè)コЧ?。首先分析豬場(chǎng)污水處理系統(tǒng)對(duì)ARGs 的總體去除情況，其中tetX、tetW、tetQ、tetO、tetL、ermC、ermB 和sul1 總體呈現(xiàn)正去除效果，相對(duì)豐度（lg 值）下降了0.06（tetO）~1.53（tetW），而sul2、qnrS、qnrB、oqxB 和strA 的相對(duì)豐度（lg值）上升了 0.03（strA）~1.19（qnrB）。CHEN 等[21]發(fā)現(xiàn)厭氧發(fā)酵處理對(duì)江蘇省豬場(chǎng)污水中四環(huán)素類(lèi)tetW、tetQ、tetO 與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermC、ermB 有良好的去除效果，同時(shí)未能有效去除喹諾酮類(lèi)qnrS、oqxB 與磺胺類(lèi)sul1、sul2，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。intI1 相對(duì)豐度（lg值）增加了0.09。此外，不同處理單元對(duì)ARGs的去除效果不同，ARGs 去除效果最好的主要集中在厭氧發(fā)酵池和貯存池，其中貯存池為該處理工藝的最后一環(huán)，污水儲(chǔ)存的時(shí)間較長(zhǎng)，可繼續(xù)進(jìn)行厭氧或兼性厭氧等發(fā)酵反應(yīng)，此外，污水中微生物群落的變化，同樣可能對(duì)ARGs 產(chǎn)生一定的降解作用。tetX、tetW、tetQ、tetO、sul1、ermC 和ermB 在厭氧發(fā)酵單元中降低較多，其中tetW 的去除效果最好，相對(duì)豐度（lg 值）下降了1.12；tetQ、sul2、qnrS、oqxB 和ermC 的相對(duì)豐度在貯存池單元中下降較多，其中sul2 和oqxB 的去除效果最好，相對(duì)豐度（lg值）均下降了0.59。

表2 豬場(chǎng)污水中ARGs在不同處理單元中的去除效果（lg值）Table 2 Removal effect of ARGs in pig farm sewage in different treatment units（lgs）

2.2.2 牛場(chǎng)污水中ARGs的去除效果

如圖 3（B）所示，在對(duì)牛場(chǎng)污水中 13 種 ARGs 及基因元件intI1 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，除了oqxB 和ermB 外，其余目標(biāo)ARGs 在所有處理單元中均有檢出，其中磺胺類(lèi)ARGs 相對(duì)豐度最高，為6.83×10-4~1.73×10-2；喹諾酮類(lèi)ARGs 相對(duì)豐度最低，為3.92×10-7~2.45×10-6，此外，四環(huán)素類(lèi) ARGs 中tetX、tetW、tetQ 和tetO（10-4~10-3）的相對(duì)豐度高于tetL（10-5~10-3），大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermB（10-4）的相對(duì)豐度高于ermC（10-6）。

表3 為牛場(chǎng)廢水中13 種ARGs 及基因元件intI1在各處理單元中的去除效果和總?cè)コЧ渲衪etX、tetW、tetQ、tetO、tetL 和ermC 總體呈現(xiàn)正去除效果，相對(duì)豐度（lg 值）降低了0.002（tetX）~2.09（tetL）；其余ARGs 均表現(xiàn)出富集現(xiàn)象，其中相對(duì)豐度升高最多的為qnrS 和qnrB，lg 值均升高了0.76，這可能與這幾種ARGs 的宿主微生物在不同環(huán)境條件下具有較強(qiáng)的生存能力有關(guān)。此外，ARGs 在調(diào)節(jié)池單元中的去除效果優(yōu)于其他處理單元，tetX、tetW、tetQ、te?tO、sul2、qnrB 和strA 在該處理單元中相對(duì)豐度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其 lg 值下降了 0.22（sul2）~0.63（tetQ）。分離池中 ARGs 去除效果最差，13 種 ARGs 中有 9 種（除qnrB 和qnrS 外）出現(xiàn)富集現(xiàn)象，其中tetO 的相對(duì)豐度增加最多（0.72），另外在該單元中，基因元件intI1 雖有所去除，但相對(duì)豐度（lg值）僅下降了0.01。

表3 牛場(chǎng)污水中ARGs在不同處理單元中的去除效果（lg值）Table 3 Removal effect of ARGs in cattle farm sewage in different treatment units（lgs）

綜上所述，畜禽養(yǎng)殖污水處理各單元中ARGs 普遍存在，豬場(chǎng)污水中ARGs 的檢出率為97%，牛場(chǎng)污水中的檢出率為95%。豬場(chǎng)和牛場(chǎng)污水處理工藝對(duì)ARGs 的去除效果有較大差異，豬場(chǎng)污水在厭氧發(fā)酵后，8種ARGs的相對(duì)豐度下降，lg值平均下降了0.81；牛場(chǎng)污水中6 種ARGs 的相對(duì)豐度下降，lg 值平均下降了0.57，值得注意的是，豬場(chǎng)和牛場(chǎng)的污水處理工藝對(duì)5 種四環(huán)素類(lèi)ARGs 均呈現(xiàn)正去除效果，下降最多的為tetL（2.09）；此外，豬場(chǎng)污水工藝對(duì)tetX、tetW、tetQ、sul1、ermC 和ermB 的去除效果優(yōu)于牛場(chǎng)處理工藝，而對(duì)tetO 和tetL 去除能力，則是牛場(chǎng)優(yōu)于豬場(chǎng)。

2.3 豬場(chǎng)、牛場(chǎng)和雞場(chǎng)糞便處理工藝對(duì)ARGs 的去除效果

2.3.1 豬場(chǎng)糞便處理工藝對(duì)ARGs的去除效果

圖4（A）為豬場(chǎng)糞便處理工藝各單元中ARGs 的污染情況及賦存規(guī)律。13 種ARGs 及基因元件intI1中，除了部分樣品中喹諾酮類(lèi)qnrS、qnrB 和oqxB 未檢出外，其他目標(biāo)ARGs均有檢出，其中tetO相對(duì)豐度最高，為2.42×10-3~1.17×10-1，qnrB 的相對(duì)豐度最低，為6.02×10-6~1.68×10-3，此外，sul1、sul2、strA 和intI1 在不同處理單元中的相對(duì)豐度的數(shù)量級(jí)沒(méi)有變化。

經(jīng)過(guò)糞便處理工藝后，13種目標(biāo)ARGs 以及基因元件intI1 的去除效果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，處理后的糞便與原始糞便相比，13種目標(biāo)ARGs以及intI1的相對(duì)豐度普遍降低，只有tetX、sul1 和sul2 出現(xiàn)富集現(xiàn)象，其中tetX 的富集現(xiàn)象最為明顯，相對(duì)豐度的lg值升高了1.08，該工藝對(duì)其余4 種四環(huán)素類(lèi)ARGs 有良好的去除效果，相對(duì)豐度（lg 值）下降了1.57（tetL）~1.93（tetQ），此外該工藝對(duì)糞便中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermC和ermB的去除效果有較大差異，對(duì)ermC 的去除效果優(yōu)于ermB，基因元件intI1 雖為正去除，但相對(duì)豐度（lg 值）僅下降了0.04。GUO 等[22]發(fā)現(xiàn)在豬糞堆肥后，其中四環(huán)素類(lèi)ARGs和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ARGs的豐度會(huì)降低，其中tetW和ermC的豐度減少90%以上；TAO等[23]對(duì)豬場(chǎng)常溫堆肥的研究發(fā)現(xiàn)，在完成堆肥后磺胺類(lèi)sul1 和sul2的豐度（lg值）上升1.11~2.49，ZHANG等[24]在研究豬糞堆肥樣品時(shí)也得出了類(lèi)似結(jié)果。

表4 豬場(chǎng)糞便中ARGs在各處理單元中的去除效果（lg值）Table 4 Removal effect of ARGs in pig feces in each treatment units（lgs）

2.3.2 牛場(chǎng)糞便處理工藝對(duì)ARGs的去除效果

經(jīng)過(guò)處理工藝后，牛場(chǎng)糞便中ARGs 相對(duì)豐度的變化如圖4（B）所示。在不同處理單元中，磺胺類(lèi)sul1和sul2 的相對(duì)豐度最高，為1.51×10-3~4.42×10-2，喹諾酮類(lèi)qnrS、qnrB 和oqxB 的相對(duì)豐度最低，為 1.68×10-6~3.21×10-5。同類(lèi)型ARGs 的相對(duì)豐度存在較大差異，四環(huán)素類(lèi)tetX、tetW 和tetL（10-4~10-3）的相對(duì)豐度 高 于tetO 和tetQ（10-6~10-3），大 環(huán) 內(nèi) 酯 類(lèi)ermB（10-4~10-2）高于ermC（10-5~10-6），此外，鏈霉素類(lèi)strA和基因元件intI1 在整個(gè)糞便處理過(guò)程中相對(duì)豐度的數(shù)量級(jí)沒(méi)有變化，分別為10-3和10-4。

牛場(chǎng)糞便中13 種目標(biāo)ARGs 以及基因元件intI1的去除效果如表5 所示。通過(guò)比較兩種處理手段下ARGs的去除效果發(fā)現(xiàn)，牛場(chǎng)糞便在經(jīng)過(guò)堆肥處理后，13 種 ARGs 中有 9 種的相對(duì)豐度（lg 值）下降了 0.02（oqxB）~3.05（tetQ）；4 種的相對(duì)豐度（lg 值）上升了0.01（sul1）~0.63（ermC）；intI1 的相對(duì)豐度（lg 值）下降了0.42。而糞便在經(jīng)過(guò)無(wú)菌晾曬處理后，有5 種ARGs的含量降低，相對(duì)豐度（lg值）下降了0.39（tetX）~2.52（ermB）；7 種相對(duì)豐度（lg 值）上升了0.06（ermC）~1.04（tetL）；intI1的相對(duì)豐度（lg值）升高了0.09，值得注意的是，牛糞在經(jīng)過(guò)滅菌處理后，部分ARGs 出現(xiàn)富集現(xiàn)象，其原因可能是高溫滅菌處理（50~60 ℃）雖然可以消除部分致病菌，但是也可能會(huì)促進(jìn)部分細(xì)菌增殖，從而造成耐藥基因豐度升高?？傮w而言，相對(duì)于晾曬處理，堆肥處理可能對(duì)牛糞中ARGs 有更好的去除效果。此外，在堆肥處理后，5 種目標(biāo)四環(huán)素類(lèi)ARGs豐度降低趨勢(shì)明顯，lg值下降了0.35~3.05，這與DIEHL 等[25]對(duì)牛場(chǎng)堆肥發(fā)酵的結(jié)果一致，表明堆肥發(fā)酵處理可能對(duì)大部分四環(huán)素類(lèi)ARGs 有較好的去除效果；磺胺類(lèi)ARGs 和喹諾酮類(lèi)ARGs 的去除效果不理想；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermB 表現(xiàn)出正去除效果，相對(duì)豐度（lg 值）下降了0.97，這與彭晶等[26]對(duì)牛糞堆肥后大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ARGs 豐度變化的研究結(jié)果不一致，這可能與牛糞堆肥原料、堆肥環(huán)境以及微生物群落組成的差異有關(guān)。

表5 牛場(chǎng)糞便中ARGs在各處理單元中的去除效果（lg值）Table 5 Removal effect of ARGs in cattle feces in each treatment unit（lgs）

2.3.3 堆肥處理對(duì)雞糞中ARGs的去除效果

隨時(shí)間變化，好氧堆肥后雞糞中ARGs 相對(duì)豐度的變化規(guī)律及污染特征如圖4（C）所示。在13 種ARGs 中，喹諾酮類(lèi)ARGs 的含量最低，相對(duì)豐度為3.72×10-7~5.04×10-5，其余目標(biāo)ARGs的相對(duì)豐度均在10-5以上，其中同類(lèi)ARGs 的含量也有差異，磺胺類(lèi)的相對(duì)豐度sul2（10-4~10-2）高于sul1（10-4~10-3），大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的相對(duì)豐度ermB（10-4~10-2）高于ermC（10-4~10-3），此外基因元件intI1 的相對(duì)豐度為 4.14×10-5~7.21×10-4。

不同堆肥時(shí)間下，糞便中ARGs 的相對(duì)豐度變化如表6 所示。在 13 種目標(biāo) ARGs 中，tetW、tetQ、tetO、qnrS、oqxB、ermB和strA的相對(duì)豐度（lg值）下降了0.27（oqxB）~2.85（tetO），而tetX、tetL、sul1、sul2 和ermC 出現(xiàn)富集現(xiàn)象，相對(duì)豐度（lg 值）上升了0.03（tetX）~1.52（sul2），這說(shuō)明堆肥可能成為了部分ARGs 含量增加的良好反應(yīng)器。就去除不同種類(lèi)ARGs 而言，好氧堆肥對(duì)四環(huán)素類(lèi)ARGs 的去除效果高于其余ARGs，其中tetW、tetQ和tetO的去除效果最好，相對(duì)豐度（lg值）下降了1.20~2.85；磺胺類(lèi)sul1 和sul2 呈現(xiàn)負(fù)去除效果，相對(duì)豐度（lg 值）上升了0.96 和1.52；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ARGs 的去除效果有明顯差異，其中ermC 出現(xiàn)富集現(xiàn)象，相對(duì)豐度（lg 值）升高了1.43，而ermB 的相對(duì)豐度（lg 值）下降了1.83。LI 等[27]在對(duì)堆肥26 d 后的雞糞檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，tetW 和ermB 等四環(huán)素類(lèi)與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ARGs 的相對(duì)豐度降低，磺胺類(lèi)sul1 的相對(duì)豐度升高了7.5 倍，與本試驗(yàn)ARGs 的相對(duì)豐度的變化相似。此外，基因元件intI1 的相對(duì)豐度（lg 值）上升了1.24，SELVAM 等[28]研究了高溫條件下雞糞堆肥后ARGs 的變化，發(fā)現(xiàn)intI1 明顯增值，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。值得注意的是，不同堆肥時(shí)間，糞便中ARGs 的相對(duì)豐度呈現(xiàn)波動(dòng)式變化，第2 d，目標(biāo)ARGs 整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，第4 d ARGs 整體出現(xiàn)富集現(xiàn)象，其中ermB 的相對(duì)豐度升高最多，第8 d 所有ARGs 和intI1 的相對(duì)豐度均下降，而第16 d ARGs以及intI1 的相對(duì)豐度（lg 值）上升了0.14~1.03。在堆肥過(guò)程中，ARGs 的相對(duì)豐度出現(xiàn)上下波動(dòng)現(xiàn)象，這可能是由于不同堆肥時(shí)期的微生物群落變化的原因[29]。

表6 雞場(chǎng)糞便中ARGs在堆肥處理中的去除效果（lg值）Table 6 Removal effect of ARGs in chicken feces during composting（lgs）

綜上所述，3 種養(yǎng)殖場(chǎng)處理工藝對(duì)畜禽糞便中ARGs 的去除效果有較大差異，但總體對(duì)ARGs 表現(xiàn)出良好的去除效果，均可以有效去除四環(huán)素類(lèi)ARGs和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermB，但無(wú)法有效去除磺胺類(lèi)ARGs 和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ermC。值得注意的是，豬場(chǎng)糞便在經(jīng)過(guò)異位發(fā)酵床處理后，10 種ARGs 的相對(duì)豐度（lg 值）平均下降了1.11；牛場(chǎng)糞便在堆肥后，9 種ARGs 的相對(duì)豐度（lg 值）平均下降了0.83，在滅菌作墊料后，5 種ARGs的相對(duì)豐度（lg 值）平均下降了1.12；雞場(chǎng)糞便堆肥后，8種ARGs的相對(duì)豐度（lg值）平均下降了1.32。

3 結(jié)論

（1）畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便和污水中抗生素抗性基因普遍存在（10-7~10-1），但不同畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中ARGs的污染程度存在差異，豬場(chǎng)污水中ARGs 的污染水平普遍高于牛場(chǎng)。

（2）經(jīng)過(guò)不同污水處理單元后，豬場(chǎng)和牛場(chǎng)對(duì)四環(huán)素類(lèi)ARGs 的去除效果相對(duì)較好，且相對(duì)于牛場(chǎng)，豬場(chǎng)污水處理工藝對(duì)ARGs 有更強(qiáng)的去除效果；厭氧發(fā)酵單元、貯存池單元和調(diào)節(jié)池單元可能對(duì)ARGs 去除起到較大作用。

（3）3 種養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便處理工藝對(duì)四環(huán)素類(lèi)ARGs 的去除效果較好，對(duì)磺胺類(lèi)ARGs 的去除效果較差。