李柯懋，簡(jiǎn)生龍，王國(guó)杰，賈銀濤，馮 秀，關(guān)弘弢，高桂香，陳靜影，張秀茜，李得康，李英欽，龍存敏

(1.青海省漁業(yè)技術(shù)推廣中心，青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，西寧 810012；2.青海省高原水生生物及生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810012；3.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢 430072)

黃河上游所處的青海三江源地區(qū)地處青藏高原腹地，是長(zhǎng)江、黃河、瀾滄江三大河流的發(fā)源地，肩負(fù)著涵養(yǎng)水源和維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要功能，是我國(guó)生態(tài)建設(shè)的戰(zhàn)略要地。魚(yú)類是維系生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定平衡的重要組成部分，黃河上游土著魚(yú)類組成簡(jiǎn)單，主要由裂腹魚(yú)亞科、亞科和條鰍亞科的魚(yú)類組成，其中，裂腹魚(yú)亞科以花斑裸鯉(GymnocypriseckloniHerzenstein)、黃河裸裂尻魚(yú)(SchizopygopsispylzoviKessler)、厚唇裸重唇魚(yú)(GymnodiptychuspachycheilusHerzenstein)等為主；亞科以刺(AcanthogobioguentheriHerzenstein)為主；條鰍亞科以高原鰍為主[1]。近年來(lái)，黃河上游涉水工程建設(shè)呈加速態(tài)勢(shì)[2]，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，上游干流地區(qū)已建設(shè)大壩11座，規(guī)劃大壩14座，這些工程已嚴(yán)重破壞了黃河上游土著魚(yú)類資源。大壩建設(shè)不僅影響了河流自然景觀的完整性和連續(xù)性，還使魚(yú)類由連續(xù)性分布向點(diǎn)狀分布改變，魚(yú)類物種遷移和基因流動(dòng)受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致魚(yú)類群體結(jié)構(gòu)趨向簡(jiǎn)單化，種質(zhì)退化，物種多樣性逐步喪失[3]。此外，水利工程建設(shè)形成的各型水庫(kù)推動(dòng)了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，加之以往不規(guī)范的放生活動(dòng)，外來(lái)魚(yú)類有所增加，目前，青海省黃河水域已發(fā)現(xiàn)26種外來(lái)魚(yú)類[4]。

增殖放流是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的補(bǔ)償受各種因素影響的水生生物最有效的手段之一，也是目前緩解各國(guó)漁業(yè)資源衰退[5]、改善水域生態(tài)環(huán)境的一項(xiàng)有效措施。雖然增殖放流對(duì)改善漁業(yè)資源乃至生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義，但是其實(shí)際效果如何一直是管理部門所關(guān)心的核心問(wèn)題。增殖效果評(píng)估是評(píng)價(jià)增殖放流工作有效性的重要環(huán)節(jié)，其中標(biāo)記放流技術(shù)的選擇是關(guān)鍵。標(biāo)記方法的優(yōu)劣也將直接影響標(biāo)記群體回捕率及后續(xù)資源補(bǔ)充評(píng)估的準(zhǔn)確性[6]。標(biāo)記放流技術(shù)在我國(guó)已取得了長(zhǎng)足的發(fā)展[7]。目前，在眾多的標(biāo)記方法中，可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記和金屬線碼標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛，且被證明在多種魚(yú)類中標(biāo)記效果良好[8-10]。

為了補(bǔ)償水利工程建設(shè)對(duì)黃河土著魚(yú)類資源的影響，黃河上游地區(qū)也開(kāi)展了魚(yú)類增殖放流。目前黃河上游地區(qū)持續(xù)開(kāi)展的規(guī)?；帕鞯聂~(yú)類主要為花斑裸鯉?；ò呗沲帪轷幮文?Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚(yú)亞科(Schizothoracinae)裸鯉屬(Gymnocypris)?；ò呗沲幾鳛辄S河上游主要保護(hù)魚(yú)類之一，2009-2020年已累計(jì)放流1 581萬(wàn)尾數(shù)。雖然對(duì)花斑裸鯉開(kāi)展了大規(guī)模增殖放流，但對(duì)放流效果沒(méi)有進(jìn)行較系統(tǒng)的評(píng)價(jià)研究。本研究利用可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記和金屬線碼標(biāo)記對(duì)花斑裸鯉進(jìn)行標(biāo)記，從標(biāo)記對(duì)魚(yú)苗的影響、標(biāo)記保持率、回捕率等方面分析兩種標(biāo)記的效果，以期為花斑裸鯉等高原魚(yú)類的增殖放流標(biāo)記技術(shù)的選擇提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究使用的花斑裸鯉魚(yú)苗為青海省漁業(yè)技術(shù)推廣中心例行放流用魚(yú)苗，體長(zhǎng)規(guī)格5～6 cm，在青海省漁業(yè)技術(shù)推廣中心池塘內(nèi)養(yǎng)殖，經(jīng)檢疫無(wú)病、無(wú)殘、無(wú)異常。

使用材料有可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記、金屬線碼標(biāo)記(青島海星儀器有限公司)。MS-222麻醉藥、測(cè)量板/尺、電子秤、乙醇、剪刀、紗布、魚(yú)缸、溫度計(jì)、熒光手電筒、磁性金屬探測(cè)器等。

1.2 標(biāo)記方法

1.2.1 熒光標(biāo)記材料的配置及標(biāo)記方法

首先將熒光染色劑和硅油按10∶1比例在20 mL的注射器內(nèi)混合均勻后再注入0.5 mL注射器內(nèi)以備標(biāo)記(60 min內(nèi)全部使用完畢，以免固化)。注射熒光劑時(shí)將針頭緩慢插入花斑裸鯉背鰭基部前緣，挑起背鰭基部前緣皮膚，再將針頭推入約1 cm，在緩慢拔出針頭的同時(shí)推入熒光劑，肉眼可清晰觀察到熒光染色劑，長(zhǎng)度約1 cm，回捕后可用熒光手電筒檢測(cè)(圖1)。

1.2.2 金屬線碼標(biāo)記方法

使用由青島海星儀器有限公司提供的金屬線碼標(biāo)記儀，將有編碼的磁性金屬絲(長(zhǎng)1.10 mm、直徑0.25 mm)植入花斑裸鯉頭部表皮下[11]，回捕后可用磁性金屬探測(cè)器(V-Detector;NMT)檢測(cè)(圖1)。

圖1 熒光標(biāo)記和金屬線碼標(biāo)記位置示意圖

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 魚(yú)苗存活及標(biāo)記保持實(shí)驗(yàn)

2018年4月，選規(guī)格基本一致的花斑裸鯉共900尾，分成對(duì)照組、金屬絲標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組，每組實(shí)驗(yàn)用魚(yú)300尾，下設(shè)三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于對(duì)照組，每100尾魚(yú)直接放入實(shí)驗(yàn)用魚(yú)缸(100 cm×50 cm×20 cm，配充氧過(guò)濾設(shè)備)暫養(yǎng)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，用0.3 mg/L的MS-222丁香芬試劑對(duì)魚(yú)苗進(jìn)行麻醉，采用可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記和金屬絲標(biāo)記對(duì)魚(yú)苗進(jìn)行標(biāo)記，每100尾放入同樣條件的魚(yú)缸內(nèi)，每日給3組9個(gè)魚(yú)缸內(nèi)的魚(yú)苗投喂商品飼料，連續(xù)50 d觀察并記錄死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)量體長(zhǎng)和體重等生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)，并使用熒光手電筒和磁性金屬探測(cè)器對(duì)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 標(biāo)記放流

2018年6月1-6日對(duì)花斑裸鯉魚(yú)苗正式標(biāo)記，除了增加標(biāo)記數(shù)量外，標(biāo)記過(guò)程與對(duì)比實(shí)驗(yàn)標(biāo)記方法相同，標(biāo)記完成后放流到拉西瓦水庫(kù)。通過(guò)計(jì)算相同時(shí)間內(nèi)標(biāo)記的魚(yú)苗尾數(shù)對(duì)兩種方法的標(biāo)記效率進(jìn)行評(píng)估。同一人進(jìn)行兩種方法的標(biāo)記，每種方法各選標(biāo)記30尾，掌握方法后，計(jì)算同一人在10 min內(nèi)用兩種方法標(biāo)記的魚(yú)苗數(shù)量。

1.3.3 回捕檢測(cè)

考慮到回捕監(jiān)測(cè)時(shí)魚(yú)苗較小，魚(yú)苗活動(dòng)區(qū)域主要在水庫(kù)周邊，為避免傷害，采用地籠進(jìn)行回捕。2018-2020年連續(xù)三年在拉西瓦水庫(kù)實(shí)施監(jiān)測(cè)，每年的監(jiān)測(cè)時(shí)間為7-10月。在拉西瓦水庫(kù)周邊的20處淺水水域設(shè)置地籠，地籠長(zhǎng)度20 m，網(wǎng)目0.5 cm,回捕魚(yú)苗放入小網(wǎng)箱2 m×2 m×2 m暫養(yǎng)，檢測(cè)時(shí)用撈海打入盆中，使用熒光手電筒和磁性金屬探測(cè)器進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)方差分析(由于體長(zhǎng)體重?cái)?shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，因此，本研究中采用Kruskal-Wallis方法)檢驗(yàn)標(biāo)記組與對(duì)照組的體長(zhǎng)和體重是否存在顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)記魚(yú)苗存活率和標(biāo)記保持率

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，未標(biāo)記組花斑裸鯉魚(yú)苗生長(zhǎng)狀況良好，存活率為100%?？梢?jiàn)植入熒光標(biāo)記組的花斑裸鯉魚(yú)苗的生長(zhǎng)狀況良好，平均存活率為(96.58±2.42)%，經(jīng)熒光手電筒檢測(cè)，標(biāo)記保持率為100%。金屬線碼標(biāo)記組的花斑裸鯉魚(yú)苗的生長(zhǎng)狀況良好，平均存活率為(83.22±0.62)%，經(jīng)磁性金屬探測(cè)器檢測(cè)，標(biāo)記保持率為85%。

2.2 標(biāo)記對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)的影響

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組平均體長(zhǎng)為(53.02±4.56) mm,平均體重為(2.07±0.56) g。金屬線碼組的平均體長(zhǎng)為(54.30±5.13) mm,平均體重為(2.04±0.78) g。熒光標(biāo)記組的平均體長(zhǎng)為(53.80±4.71) mm,平均體重為(1.94±0.58) g。Kruskal-Wallis方法對(duì)比顯示，標(biāo)記組與對(duì)照組間的體長(zhǎng)和體重均沒(méi)有顯著差異，表明兩種標(biāo)記均未對(duì)花斑裸鯉的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響(圖2)。

圖2 不同標(biāo)記方法及對(duì)照組魚(yú)類體長(zhǎng)體重變化

2.3 標(biāo)記數(shù)量和效率

通過(guò)6 d標(biāo)記，利用可見(jiàn)植入熒光累計(jì)標(biāo)記魚(yú)苗15 695尾，利用金屬線碼累計(jì)標(biāo)記魚(yú)苗6 565尾。可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記方法相對(duì)簡(jiǎn)單，可多人同時(shí)標(biāo)記，標(biāo)記速度5～10秒/(尾·人)，金屬線碼標(biāo)記操作難度相對(duì)較高，標(biāo)記速度20～25秒/(尾·人)，單人標(biāo)記速度可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記法是金屬線碼標(biāo)記法的約3倍。

2.4 回捕檢測(cè)

共標(biāo)記花斑裸鯉魚(yú)苗22 260尾，在拉西瓦水域共計(jì)放流20萬(wàn)尾，標(biāo)記魚(yú)苗約占11.13%。2018年7月，共回捕花斑裸鯉3 802尾，熒光標(biāo)記177尾，回捕率為1.13%；金屬線碼標(biāo)記26尾，回捕率為0.40%。熒光標(biāo)記回捕率顯著高于金屬線碼標(biāo)記。2019年回捕到2018年熒光標(biāo)記魚(yú)類30尾，金屬線碼標(biāo)記魚(yú)類1尾，2020年回捕到2018年熒光標(biāo)記魚(yú)類3尾，金屬線碼標(biāo)記魚(yú)類0尾。2019年金屬線碼可檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)烈，2019-2020年度回捕熒光標(biāo)記個(gè)體標(biāo)記顯示清晰。

3 討論

目前，根據(jù)標(biāo)記的性質(zhì)主要分為三類，即物理標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記[6]。物理標(biāo)記包括金屬絲、PIT(Passive Integrated Transponder)芯片、掛牌、切鰭等，此標(biāo)記技術(shù)利用肉眼或掃描器識(shí)別標(biāo)記，是直觀、常用的標(biāo)記技術(shù)。楊德國(guó)等[12]采用外掛銀牌和金屬線碼雙重標(biāo)記，對(duì)中華鱘幼魚(yú)進(jìn)行標(biāo)記，研究了人工繁殖中華鱘的降河洄游特性?；瘜W(xué)標(biāo)記如熒光標(biāo)記等是將化學(xué)物質(zhì)植入魚(yú)的表面或體內(nèi)，通過(guò)肉眼或檢測(cè)器識(shí)別標(biāo)記，也是常用的放流標(biāo)志技術(shù)。胡夢(mèng)紅等[13]在西背嶺潮間帶使用可視嵌入性熒光標(biāo)記對(duì)放流的中國(guó)鱟進(jìn)行標(biāo)志，通過(guò)回捕分析，獲得標(biāo)記稚鱟的分布區(qū)域，并得出稚鱟擴(kuò)散能力。分子標(biāo)記是直接以DNA的形式表現(xiàn)，其技術(shù)原理是子代的等位基因從父母本遺傳獲得，依據(jù)等多個(gè)基因座分析可以對(duì)個(gè)體的父母本進(jìn)行鑒定和區(qū)分。成為為等[14]利用微衛(wèi)星標(biāo)記推算出增殖放流的胭脂魚(yú)對(duì)長(zhǎng)江中上游野生群體的貢獻(xiàn)量為16.92%。但是，各類標(biāo)記都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，物理標(biāo)記中掛牌和PIT芯片等標(biāo)記可能會(huì)隨著魚(yú)類活動(dòng)而脫落，且影響魚(yú)類生長(zhǎng)；切掉的魚(yú)鰭會(huì)隨著魚(yú)類生長(zhǎng)而得到補(bǔ)充；化學(xué)標(biāo)記可能隨著時(shí)間慢慢變淡或消失；分子標(biāo)記的效果與親魚(yú)和自然群體的遺傳背景有關(guān)[15]。因此，應(yīng)根據(jù)魚(yú)類自身特性通過(guò)對(duì)比研究確定合適的標(biāo)記方法。本研究室內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記方法的效率更高，標(biāo)記后在花斑裸鯉上的保持率達(dá)100%，成活率達(dá)(96.58±2.42)%，而金屬線碼標(biāo)記保持率僅為85%，成活率(83.22±0.62)%。金屬線碼標(biāo)記保持率較低和死亡率較高的主要原因可能是受金屬探測(cè)器靈敏度和標(biāo)記儀器操作便利性限制。為便于后期金屬探測(cè)儀探測(cè)，花斑裸鯉金屬線碼標(biāo)記最佳位置位于其頭部很薄的皮膚下，且不宜過(guò)深，標(biāo)記過(guò)程容易對(duì)其造成傷害，且金屬線本身比較光滑，在表皮下容易滑動(dòng)，不利于標(biāo)記的保持。而可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記物有一定粘性在背鰭基部表皮下附著力較好。

兩種標(biāo)記方法的標(biāo)記組與對(duì)照組間的體長(zhǎng)與體重均沒(méi)有顯著差異，表明標(biāo)記未對(duì)花斑裸鯉生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，與其他魚(yú)類標(biāo)記研究結(jié)果相似。兩種標(biāo)記方法均被認(rèn)為是很安全的[9,17]，但如果魚(yú)類個(gè)體很小(體重<1 g)死亡率會(huì)增加[17]。本研究放流的花斑裸鯉魚(yú)苗平均體重在5～10 g，因此標(biāo)記并未對(duì)其生長(zhǎng)或身體狀況產(chǎn)生不利影響。

從放流回捕后識(shí)別度來(lái)看，可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記比金屬線碼標(biāo)記的更容易識(shí)別?；ò呗沲幦砺懵抖鴥H臀鱗及肩帶部分有少數(shù)不規(guī)則的大型鱗片，熒光標(biāo)記在裸露的皮膚下更易觀察。在室內(nèi)光線較暗的情況下，可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記的魚(yú)苗可以通過(guò)肉眼直接觀察，熒光手電筒可一次識(shí)別多尾魚(yú)，并且可以通過(guò)不同顏色的熒光劑區(qū)分不同年份標(biāo)記的魚(yú)類，而金屬線碼需要在低倍顯微鏡下觀察特殊編碼才能予以區(qū)分年份，效率相對(duì)較低。2018-2020年連續(xù)3年監(jiān)測(cè)都可以回捕到可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記的魚(yú)類，且標(biāo)記依然清晰，效果穩(wěn)定?；夭稊?shù)量逐年下降的原因主要是隨著標(biāo)記魚(yú)苗的生長(zhǎng)，其活動(dòng)范圍變廣，多數(shù)進(jìn)入水庫(kù)深水區(qū)，捕捉難度明顯增大，可能也有自然死亡的原因，今后應(yīng)進(jìn)一歩加大標(biāo)記數(shù)量。

以上分析表明，可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記的效率高、成本低、操作便利、成活率高、回捕檢出率高、標(biāo)記保持時(shí)間長(zhǎng)、各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于金屬線碼標(biāo)記方法，較易應(yīng)用于花斑裸鯉增殖放流效果評(píng)估，效果比較好?；ò呗沲幧L(zhǎng)和發(fā)育都比較緩慢，放流稚魚(yú)個(gè)體較小，不適合用掛牌和PIT等較大標(biāo)記[18]；花斑裸鯉為四倍體魚(yú)，較難使用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行親權(quán)關(guān)系鑒定[19]。因此，我們建議采用可見(jiàn)植入熒光標(biāo)記作為花斑裸鯉標(biāo)記方法。此外，鑒于裂腹魚(yú)亞科中裸鯉屬、裸裂尻魚(yú)屬、高原魚(yú)屬、裸重唇魚(yú)屬等具有與花斑裸鯉相似的生物學(xué)特性，因此，此方法也可推廣應(yīng)用于其他裂腹魚(yú)類的標(biāo)記放流，應(yīng)用前景廣闊。