儲蘭璐，高建操，宋黎黎，孫 毅，邵乃麟，李全杰，聶志娟，徐鋼春,，徐 跑,

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹、大閘蟹，是我國最重要的淡水甲殼類養(yǎng)殖品種之一。然而，在集約化人工養(yǎng)殖模式發(fā)展的過程中，多次爆發(fā)由細(xì)菌、病毒、立克次體等引起的多種疾病，導(dǎo)致慘重的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重威脅河蟹養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。河蟹完全依靠先天免疫防御病原體[1]，其先天免疫系統(tǒng)由細(xì)胞免疫和體液免疫組成[2]，其中細(xì)胞免疫包括包囊、吞噬作用和結(jié)節(jié)形成，而體液免疫包括蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)、抗菌肽(AMPs)合成和酚氧化酶激活系統(tǒng)(proPO系統(tǒng))；在河蟹抗感染免疫中細(xì)胞免疫與體液免疫相輔相成，共同發(fā)揮免疫作用[3]。河蟹的免疫系統(tǒng)在抵抗外源性病原體或污染物時會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，過量的ROS會導(dǎo)致機體的氧化損傷?？寡趸赶到y(tǒng)能夠消除機體內(nèi)過量的ROS，防止或減輕機體的氧化損傷。同先天免疫一樣，抗氧化酶系統(tǒng)在維持河蟹的機體健康中也發(fā)揮著重要作用[4]。

河蟹肝胰腺是先天免疫反應(yīng)的重要器官，可以合成和分解許多參與免疫防御的蛋白質(zhì)[5]，如NF-κB通路成分、抗菌肽和抗氧化酶等。Toll樣受體作為一種模式識別受體，能直接識別病原相關(guān)分子模式。當(dāng)Toll信號通路被革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌激活時，Toll受體蛋白活化，通過Tube蛋白，使MyD88和Pelle結(jié)合成異源三聚體復(fù)合物，然后將信號傳遞給Dorsal/Cactus復(fù)合物，Dorsal(NF-κB轉(zhuǎn)錄因子)通過磷酸化轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，調(diào)控某些抗菌肽基因的表達[6]。作為細(xì)胞內(nèi)蛋白成熟過程中的分子伴侶，Hsp90通過調(diào)節(jié)其受體蛋白的活性與維持受體蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定間接參與細(xì)胞內(nèi)多條信號通路的調(diào)控[7]。

近年來微生態(tài)制劑類因其安全、高效、無污染的特點成為水產(chǎn)健康養(yǎng)殖研究的熱點。其中， EM菌作為一種益生菌制劑最初被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物、蔬菜的種植和畜牧的養(yǎng)殖中，是一種以乳酸菌、酵母菌、光合細(xì)菌、放線菌和發(fā)酵真菌通過發(fā)酵工藝培養(yǎng)的復(fù)合菌劑,其主要利用有益微生物之間的協(xié)同作用，通過競爭排斥抑制病原菌和有害細(xì)菌的生長，從而使得有益菌占優(yōu)勢[8]。據(jù)報道，日糧添加EM菌不僅可以優(yōu)化哺乳動物消化道中細(xì)菌菌群的組成，通過調(diào)控宿主基因表達提高飼料利用率，促進宿主生長發(fā)育，還能夠激活細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)[9]，提高其免疫力。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，EM菌能夠改良養(yǎng)殖水質(zhì)，顯著提高水體中藻類和輪蟲密度，促進皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)、刺參(Apostichopusjaponicusare)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)和淇河鯽(Carassiusauratus)等生長及增強抗病能力[10]。

目前，EM菌對河蟹養(yǎng)殖影響的研究主要集中在養(yǎng)殖水質(zhì)的改良和河蟹的營養(yǎng)風(fēng)味上[11]，在對河蟹免疫力影響方面仍是空白。本研究以河蟹為試驗對象，在養(yǎng)殖過程中定期使用EM菌，從血液細(xì)胞學(xué)、基因表達和酶活等多層面評估EM菌對河蟹抗氧化能力和非特異性免疫力的影響，以期為EM菌的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用河蟹苗種購自江蘇諾亞方舟農(nóng)業(yè)科技有限公司。養(yǎng)殖池塘位于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心揚中基地，長×寬=75 m×23 m，水深0.5～1.0 m。實驗用蟹初始體重為(27.78±1.44) g。飼養(yǎng)期間水溫14.0～32.8 ℃，溶解氧>2 mg/L，氨氮<0.025 mg/L，亞硝酸鹽<0.004 mg/L，pH7.8～9.0。

EM菌購自江蘇恒泰環(huán)保科技發(fā)展有限公司，pH3.0～4.0，乳酸菌數(shù)1.0×107～1.0×108CFU/mL，酵母菌數(shù)1.0×104～1.0×105CFU/mL，光合菌數(shù)1.0×103～2.0×103CFU/mL，放線菌數(shù)1.0×103～3.0×103CFU/mL，菌種數(shù)>80種，代謝產(chǎn)物>10%。

1.2 實驗分組

挑選個體大小均勻、附肢完整的健康扣蟹隨機分為實驗組(EM菌組)和對照組，每組3個池塘重復(fù)，每個池塘放養(yǎng)1 100只扣蟹；EM菌組池塘在常規(guī)管理的基礎(chǔ)上每7 d使用一次EM菌，每666.67 m2水體使用7 500 g EM菌；對照組按常規(guī)管理。

1.3 樣品采集

采樣時間點處于河蟹蛻殼間期，共進行5次采樣，依次為4月15日(1殼)、6月3日(2殼)、7月19日(3殼)、8月27日(4殼)、10月21日(5殼)。每個采樣時間點從每個池塘中用地籠捕撈6只雄蟹，于冰上麻醉后采樣。取河蟹第3步足基關(guān)節(jié)膜處血淋巴，4 ℃靜置過夜，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清液(血清)用于血清抗氧化和免疫酶活的測定；取5殼蟹肝素抗凝血，用于各類血細(xì)胞數(shù)量的測定；采集肝胰腺，液氮凍存運回實驗室后，于-80 ℃冰箱保存。

1.4 抗氧化酶系統(tǒng)指標(biāo)檢測

血清的超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，貨號依次為：A001-3-2、A007-1-1、A003-1-2和A005-1-2。

1.5 非特異性免疫力檢測

1.5.1 血細(xì)胞組成

取5殼河蟹的抗凝血，用瑞氏-姬姆薩染色法制作血涂片，油鏡下隨機選取視野共計200個細(xì)胞進行觀察，進行透明細(xì)胞(HC)、半顆粒細(xì)胞(SGC)和顆粒細(xì)胞(GC)的分類鑒定和計數(shù)[12]。

1.5.2 相關(guān)基因的表達量分析

肝胰腺RNA使用離心柱法(TaKaRa)提取，cDNA合成使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒進行。河蟹內(nèi)參基因β-actin、Gapdh和免疫相關(guān)基因引物序列見表1。qRT-PCR分析使用TB GreenTM Fast qPCR Mix(TaKaRa)在CFX96(Bio-rad)上進行。qRT-PCR程序為：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為40。用2-ΔΔCT方法計算各基因的相對表達量。

表1 中華絨螯蟹免疫相關(guān)基因熒光定量引物

1.5.3 免疫相關(guān)酶活的測定

血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)含量采用全自動血清生化分析儀(Mindray BS-400)測定，所用試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。溶菌酶(LZM)活力采用南京建成生物工程研究所的試劑盒(貨號A050-1-1)進行測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 26.0(IBM Inc.,Chicago,IL,USA)軟件進行。數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性分別采用Shapiro-Wilk和Levene(α=0.05)方法進行，對不符合上述要求的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換；隨后基于全因子模型進行雙因素方差分析，主效應(yīng)之間的差異分析選用LSD方法；P<0.05表示差異顯著，統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 EM菌對中華絨螯蟹血清抗氧化酶系統(tǒng)的影響

不同處理組河蟹血清抗氧化指標(biāo)見表2。分析發(fā)現(xiàn)EM菌對不同發(fā)育階段河蟹的MDA和CAT有不同的影響。與對照組相比，EM菌在河蟹生長過程中能夠降低MDA含量，尤其在1殼和3殼時期，EM菌組的MDA含量顯著低于對照組；對照組MDA含量表現(xiàn)為先降低后升高的變化趨勢，3殼時對照組血清中MDA含量顯著低于1殼、4殼和5殼；EM菌組血清中MDA含量的變化與對照組相似，3殼時血清中MDA含量顯著低于其他各生長階段。5殼時，EM菌能顯著提高河蟹血清中CAT活力；在河蟹的生長過程中對照組血清中CAT活力保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，但EM菌組血清中CAT呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，4殼時達到最低值。

表2 EM菌對中華絨螯蟹血清抗氧化指標(biāo)的影響

對照組SOD活力呈現(xiàn)逐步降低的變化趨勢，5殼時SOD活力顯著低于生長初期(1～3殼)；EM菌組變化趨勢與對照組一致，且在生長的各個時期均能提高SOD活力但與對照組之間無顯著差異。EM菌對中華絨螯蟹血清中GPX活力無明顯作用，在各生長時期，EM菌組與對照組之間無顯著差異。

2.2 EM菌對河蟹非特異性免疫的影響

2.2.1 EM菌對中華絨螯蟹血細(xì)胞組成的影響

圖1可知透明細(xì)胞(HC)為圓形，經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后，細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色，細(xì)胞核呈紫色；半顆粒細(xì)胞(SGC)為卵圓形，經(jīng)染色后，細(xì)胞質(zhì)中的小顆粒呈現(xiàn)紫色或藍(lán)色，細(xì)胞核呈深紫色。顆粒細(xì)胞(GC)多呈橢圓形或圓形，細(xì)胞質(zhì)中含有大量具有折光性的顆粒，被染為紫色或藍(lán)色。由圖2可以看出HC在三種細(xì)胞類型中占比較低，對照組HC占20.96%±1.35%，EM菌組占19.40%±0.21%；對照組SGC占54.96%±3.00%，且EM菌組SGC含量比對照組高2.97個百分點；對照組GC占24.08%±1.69%，EM菌組占22.67%±0.10%。

圖1 中華絨螯蟹不同血細(xì)胞類型

圖2 EM菌對中華絨螯蟹血細(xì)胞組成的影響

2.2.2 EM菌對河蟹肝胰腺免疫相關(guān)基因表達的影響

不同處理河蟹肝胰腺免疫相關(guān)基因表達情況見表3。分析發(fā)現(xiàn)交互作用“處理×發(fā)育階段”顯著影響河蟹免疫相關(guān)基因Tube、Hsp90、Dorsal相對表達量，即不同發(fā)育階段河蟹免疫相關(guān)基因Tube、Hsp90、Dorsal相對表達量對EM菌的響應(yīng)程度不同。在河蟹生長的各個階段，EM菌組Toll2和Tube的表達量均高于對照組，2殼時EM菌組Tube的表達量顯著上調(diào)；在河蟹的生長發(fā)育過程中，Tube、Toll2表達量呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，5殼時表達量最高，顯著高于1～3殼生長階段。

表3 EM菌對中華絨螯蟹肝胰腺免疫相關(guān)基因表達的影響

在河蟹生長的過程中，EM菌能上調(diào)Dorsal的表達，且在4殼時與對照組之間差異顯著；與對照組相比，EM菌組Dorsal的表達量相對穩(wěn)定，各生長階段差異不顯著。EM菌同樣能夠上調(diào)河蟹生長過程中Hsp90的表達，2殼和3殼時EM菌組Hsp90的表達量顯著高于對照組。

2.2.3 EM菌對中華絨螯蟹血清免疫指標(biāo)的影響

不同處理組河蟹血清免疫指標(biāo)見表4。分析發(fā)現(xiàn)交互作用“處理×發(fā)育階段”顯著影響河蟹免疫酶ALT、AST、ALP、LZM活性，即不同發(fā)育階段河蟹血清的ALT、AST、ALP、LZM活性對EM菌的響應(yīng)程度不同。5殼時EM菌組血清ALT活力顯著低于對照組；對照組ALT呈現(xiàn)逐步升高的變化趨勢，5殼時血清中ALT含量顯著高于其他生長時期；EM菌組變化趨勢與對照組一致，但在河蟹生長的各個時期，EM菌組血清中ALT含量均低于對照組，且在5殼時差異顯著。對照組AST活力呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢，5殼時AST活力高于其他生長時期；EM菌組變化趨勢與其一致，且在1殼時河蟹血清中AST活力顯著低于對照組。EM菌組血清中ALP活力呈現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢，3殼時ALP活力達到最低值，顯著低于其他生長時期；除2殼外，其他生長階段，河蟹血清中ALP活力均高于對照組，且在1殼時兩組之間差異顯著。2殼時，與對照組相比，EM菌顯著提高血清中溶菌酶含量；河蟹對照組和EM菌組血清中溶菌酶含量波動較大，1殼和3殼時溶菌酶含量高于其他生長時期。

表4 EM菌對中華絨螯蟹血清免疫指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 EM菌對中華絨螯蟹血清抗氧化酶系統(tǒng)的影響

SOD和CAT是兩種重要的抗氧化酶，酶活力與機體清除自由基的能力正相關(guān)[19]。GPX有助于將過氧化物轉(zhuǎn)化為毒性較低的羥基化合物，可有效防止活性氧的積累，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)態(tài)[20]。MDA是脂質(zhì)過氧化的毒性產(chǎn)物，它的含量間接反映了機體細(xì)胞的氧化損傷程度[21]。徐貴珠[22]發(fā)現(xiàn)飼料中添加殼寡糖和茶多糖能提高河蟹血清中CAT和SOD活性，同時降低MDA的含量。與之類似，本研究發(fā)現(xiàn)EM菌組MDA含量低于對照組，其中3殼時差異達到顯著水平，分析原因是河蟹于7月進行3殼采樣，此時氣溫較高，在高溫下養(yǎng)殖水體穩(wěn)定性下降，殘餌、糞便、腐敗的水草等容易誘導(dǎo)河蟹產(chǎn)生氧化應(yīng)激。熱應(yīng)激下河蟹MDA含量隨應(yīng)激時間而逐步增加，進而導(dǎo)致自由基代謝紊亂，病害發(fā)生[23]，而本實驗中EM菌的添加能顯著降低MDA含量，表明EM菌對緩解或者抑制河蟹夏季高溫天氣時應(yīng)激損傷有一定效果。5殼時河蟹有上岸的習(xí)性，該階段河蟹常處于空氣暴露等缺氧環(huán)境下。而在缺氧條件下，蝦蟹類能夠調(diào)整體內(nèi)抗氧化酶活性以適應(yīng)不利的環(huán)境，降低氧化應(yīng)激的發(fā)生[24-27]。因此，本研究中EM菌組5殼河蟹血清中CAT活性顯著升高，再次印證了EM菌有助于河蟹緩解或者抑制不利條件下的應(yīng)激損傷。

3.2 EM菌對中華絨螯蟹血細(xì)胞組成的影響

血細(xì)胞在河蟹的非特異性防御中主要具有吞噬、包囊的作用，能有效殺死細(xì)菌，在河蟹血細(xì)胞類群中，半顆粒細(xì)胞能伸出偽足，具有較強的吞噬活動能力，是防御反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞[28]。本研究結(jié)果表明，半顆粒細(xì)胞是河蟹血細(xì)胞的主要類群，占總血細(xì)胞數(shù)的50%以上，且EM菌組SGC含量比對照組高2.97個百分點，這一結(jié)果與洪宇航等[29]的結(jié)果一致。已有研究結(jié)果表明EM菌能夠降低水體中亞硝酸鹽和氨氮含量[11]，維持良好的水體環(huán)境，水體中病原微生物變少，河蟹血細(xì)胞吞噬活動頻率較低，半顆粒細(xì)胞數(shù)量略高于對照組。

3.3 EM菌對河蟹肝胰腺免疫相關(guān)基因表達的影響

河蟹主要通過模式識別蛋白識別病原體，引起胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，通過下游的信號通路激活NF-κB,進入細(xì)胞核調(diào)節(jié)抗菌肽等免疫因子基因的表達,從而啟動先天免疫[30,31]。Toll信號通路是河蟹主要的先天免疫信號通路之一，Toll2、Tube和Dorsal均為該通路中的重要組件[16,32]。研究表明，Toll通路相關(guān)基因表達的上調(diào)與機體非特異性免疫能力提高有關(guān)。張盛靜等[33]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加地衣芽孢桿菌可一定程度上提高Toll受體的相對表達量，有效提高凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)抗哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)感染的能力。本研究中，EM菌組雄蟹的Toll2、Tube、Dorsal相對表達量均顯著高于對照組，表明EM菌在一定程度上能提高機體對異物的識別能力，進而實現(xiàn)免疫機能的提高。Toll2和Tube表達量在5殼時最高，表明5殼時河蟹上岸后，識別外源病原體的能力最強。3殼時，河蟹Dorsal的表達量則低于其他各生長時期，表明高溫季節(jié)下，Toll信號通路受到一定的抑制，但EM菌能在一定程度上緩解高溫對河蟹免疫力的影響。本實驗中添加EM菌能提高河蟹2殼LZM活性和5殼CAT活力，降低3殼MDA含量和5殼ALT活性，綜合以上結(jié)果說明LZM、CAT、MDA、ALT、TubemRNA、DorsalmRNA有一定的相關(guān)性，這與文英等[34]認(rèn)為Toll通路能提高抗氧化酶類及免疫酶類的活性，清除過多的氧自由基 的結(jié)果一致。HSP90是一種熱休克蛋白，機體在應(yīng)激原的誘導(dǎo)下，激活熱休克蛋白基因，合成HSPs，HSPs能使動物迅速適應(yīng)環(huán)境的變化，保護細(xì)胞免受損傷，其可誘導(dǎo)激活多種免疫因子，參與免疫反應(yīng)[35]。研究表明高溫應(yīng)激下蝦蟹類HSP90 mRNA的相對表達量顯著提升，提升甲殼動物的耐受性，抵抗高溫帶來的應(yīng)激損害，對機體起保護作用[36]。此外，研究表明HSP90除了與機體免疫相關(guān)，在應(yīng)激原的誘導(dǎo)下，參與機體的炎癥反應(yīng)過程，使動物迅速適應(yīng)環(huán)境的變化，緩解氧化應(yīng)激帶來的組織損傷，保護細(xì)胞免受損傷[36,37]。本研究中，EM菌的添加顯著提高了2殼時血清中溶菌酶活性，降低了3殼時MDA含量，同時2殼時EM菌組雄蟹HSP90的表達量顯著上升，推測HSP90與河蟹的細(xì)胞免疫和抗氧化酶系統(tǒng)有關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)2殼、3殼階段河蟹肝胰腺HSP90的表達量顯著高于其他發(fā)育階段，同時EM菌組3殼雄蟹HSP90基因的相對表達量顯著高于對照組，提示EM菌可能通過誘導(dǎo)HSP90表達的上調(diào)，對機體在高溫條件下的應(yīng)激損傷有一定的防御作用。

3.4 EM菌對中華絨螯蟹血清免疫指標(biāo)的影響

由于河蟹體內(nèi)缺乏免疫球蛋白，因此其體液免疫主要依靠血淋巴中一些非特異性的酶或因子來進行免疫反應(yīng)。AST和ALT是重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，在機體蛋白質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用，其血清中含量與機體肝臟等器官損傷負(fù)相關(guān)[38]。LZM是一種堿性蛋白，能水解革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，血清中較高的LZM活性表明機體的免疫能力較強。ALP是溶酶體的組成成分之一，直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移與磷酸酯的代謝，促進體內(nèi)異物的清除，是動物體內(nèi)重要的解毒酶。Mohammadian等[39]發(fā)現(xiàn)益生菌的添加能提高鯉血清溶菌酶、堿性磷酸酶活性。本研究也發(fā)現(xiàn)水體添加EM菌后2殼時雄蟹ALP活性和LZM活性顯著高于對照組；EM菌組5殼雄蟹血清ALT和1殼雄蟹AST含量顯著低于對照組；以上結(jié)果表明EM菌組河蟹具有較強的免疫解毒能力和較低的器官損傷水平。

4 結(jié)論

總體來說，在水體中添加EM菌有助于提高中華絨螯蟹抵抗氧化應(yīng)激的能力，也可通過調(diào)控河蟹免疫基因的表達和相關(guān)酶活性，增強其非特異性免疫力。然而，成蟹養(yǎng)殖周期較長，不同發(fā)育階段處于不同的季節(jié)，外界環(huán)境條件(如溫度、光照等)對養(yǎng)蟹池塘生態(tài)系統(tǒng)的影響較大，相比之下EM菌的調(diào)控作用微弱，所以不同發(fā)育階段河蟹的抗氧化和先天免疫對EM菌的響應(yīng)存在差異。因此，如何科學(xué)合理地使用EM菌，最大程度發(fā)揮EM菌的作用，還需要進一步的研究。