張凱軍，王靜安，倪康達(dá)，陳海紅，陳曉雯，王 軍，王成輝

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)，俗稱(chēng)河蟹，是重要經(jīng)濟(jì)甲殼類(lèi)[1]，近年來(lái)其養(yǎng)殖產(chǎn)量逐漸增加[2-3]。中華絨螯蟹屬于變溫動(dòng)物，受溫度影響較大。有研究表明，中華絨螯蟹的生物學(xué)零度為6.91 ℃[4]，只有在適宜的溫度范圍內(nèi)，中華絨螯蟹才能正常進(jìn)行生長(zhǎng)和發(fā)育，當(dāng)高于或低于適宜溫度范圍時(shí)，其生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到影響，甚至不攝食、不蛻殼[5]。

中華絨螯蟹體質(zhì)量及體積的增加是通過(guò)蛻殼來(lái)完成的，溫度是影響中華絨螯蟹蛻殼生長(zhǎng)最重要的因子之一。有研究表明，在不同水溫下(18、22、28、30 ℃)中華絨螯蟹仔蟹的蛻殼間隔會(huì)隨著水溫的升高顯著縮短[6]，溫度長(zhǎng)時(shí)間低于10 ℃，中華絨螯蟹正常蛻殼生長(zhǎng)就會(huì)受阻；溫度長(zhǎng)時(shí)間高于30 ℃，就會(huì)停止蛻殼生長(zhǎng)[7]。水溫在10～26 ℃范圍內(nèi)，中華絨螯蟹幼蟹的生長(zhǎng)率與水溫成正相關(guān)[8]。中華絨螯蟹通過(guò)攝食獲得生長(zhǎng)發(fā)育所需要的能量，當(dāng)水溫升至10 ℃時(shí)，河蟹開(kāi)始正常攝食；水溫升至15 ℃時(shí)，攝食開(kāi)始增加；20～26 ℃時(shí)攝食最旺盛；超過(guò)35 ℃時(shí)，河蟹一般不攝食；水溫在5～10 ℃時(shí)僅有少量攝食[9]。雖然已有對(duì)中華絨螯蟹蛻殼生長(zhǎng)的相關(guān)研究，但對(duì)不同溫度下河蟹的蛻殼生長(zhǎng)率、蛻殼間隔仍缺少實(shí)驗(yàn)性數(shù)據(jù)支持和控溫條件下的個(gè)體驗(yàn)證，也缺乏溫度對(duì)河蟹攝食率的影響研究。因此，本研究應(yīng)用恒溫的河蟹個(gè)體養(yǎng)殖系統(tǒng)，分析了5種飼養(yǎng)水溫條件下(10、15、20、25、30 ℃)的中華絨螯蟹幼蟹蛻殼增長(zhǎng)率、蛻殼間隔和攝食率等差異，為了解幼蟹生長(zhǎng)和蛻殼的最適溫度提供了較為詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為生產(chǎn)實(shí)踐提供了有價(jià)值的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)河蟹為處于蛻殼間期的中華絨螯蟹“江海21”蟹種，來(lái)自上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)試驗(yàn)站(上海市浦東新區(qū)新場(chǎng)鎮(zhèn))，規(guī)格為8～15 g/只，且附肢健全。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用本實(shí)驗(yàn)室與上海某公司合作開(kāi)發(fā)的自動(dòng)控溫循環(huán)水全封閉的中華絨螯蟹個(gè)體養(yǎng)殖系統(tǒng)，分別設(shè)定溫度為10、15、20、25、30 ℃，每個(gè)溫度一套系統(tǒng)。每套系統(tǒng)共有72個(gè)養(yǎng)殖盒(9行×8列)，最上面一行種植綠蘿用以?xún)艋|(zhì)，剩余64個(gè)養(yǎng)殖盒各放養(yǎng)一只實(shí)驗(yàn)蟹，雌雄各32只。放養(yǎng)前用SARTORIUS AG型電子天平(精確到0.01 g)稱(chēng)量體表無(wú)水分的河蟹重量，用游標(biāo)卡尺(精度為0.01 mm)測(cè)量每只河蟹的頭胸甲長(zhǎng)、頭胸甲寬和體高。待實(shí)驗(yàn)蟹在個(gè)體養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)暫養(yǎng)一周后正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.3 蛻殼與生長(zhǎng)情況

實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019年12月25日-2020年5月5日，總計(jì)133 d。分別統(tǒng)計(jì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間各個(gè)水溫條件下的成活率和蛻殼次數(shù)。以每只實(shí)驗(yàn)蟹每次蛻殼后在第48小時(shí)的體質(zhì)量來(lái)統(tǒng)計(jì)相關(guān)生長(zhǎng)情況，具體公式如下：

RBM=(Wt-W0)/W0×100%

AGR=(Wn-Wn-1)/d

RGR=(Wn-Wn-1)/Wn-1/d

CF=W/L3×100%

式中：RBM為蛻殼增重率(%)；W為體質(zhì)量(g)；Wt與W0分別代表河蟹起始體質(zhì)量與終末體質(zhì)量(g)；L為頭胸甲長(zhǎng)(cm)；d為飼養(yǎng)天數(shù)；n為蛻殼次數(shù)；AGR為絕對(duì)生長(zhǎng)率(g/d)；RGR為相對(duì)生長(zhǎng)率(%/d)；CF為肥滿度(%)。

本實(shí)驗(yàn)采取的蛻殼間隔(MI)計(jì)算方法為：從放養(yǎng)日起至第一次蛻殼為第一次蛻殼間隔，從第一次蛻殼至第二次蛻殼為第二次蛻殼間隔，以此類(lèi)推。平均蛻殼間隔計(jì)算方法為數(shù)次蛻殼間隔相加后取平均值，其他生長(zhǎng)指標(biāo)也按此方法計(jì)算。

1.4 攝食率比較

實(shí)驗(yàn)期間每天18:00時(shí)投喂商業(yè)配合飼料并記錄好投喂量，飼料組成中的水分12.0%、粗蛋白質(zhì)32.0%、粗脂肪4.0%、粗纖維6.0%、粗灰分17.0%、總磷1.0%、賴(lài)氨酸1.2%，次日8:00撈取飼料殘餌放入玻璃皿中置于60 ℃烘箱中烘干，待完全烘干后稱(chēng)取重量，由此計(jì)算攝食量與攝食率。公式如下：

FG=FA-SLR×RFW

ADFI=FG/n

FR=ADFI/W×100%

式中，F(xiàn)G為日攝食量(g)；FA為投喂量(g)；RFW為剩余飼料重(g)；ADFI為日均攝食量(g)；n為實(shí)驗(yàn)蟹個(gè)數(shù)；FR為日均攝食率(%)；W為河蟹蛻殼后體質(zhì)量(g)。

殘餌的溶失率[10](SLR)測(cè)定方法：向無(wú)河蟹的缸中投入與實(shí)驗(yàn)期間投喂相同重量的飼料重m0，1 h后用虹吸管收集飼料，在60 ℃下烘干至恒重，稱(chēng)取重量為m1。相關(guān)公式如下：

SLR=m0/m1

1.5 肌纖維觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取各個(gè)水溫組體質(zhì)量在均值附近的六只活體河蟹的第二步足肌肉，放入Bouin氏液固定24 h，然后浸泡于70%酒精保存。將保存的樣品送賽維爾生物公司(上海)進(jìn)行切片觀察。具體操作按賽維爾生物公司(上海)HE染色步驟執(zhí)行。用Image J軟件測(cè)量肌纖維直徑，具體為測(cè)量各個(gè)水溫下的肌纖維長(zhǎng)軸直徑，每個(gè)水溫組測(cè)量不少于20個(gè)長(zhǎng)軸直徑，取其平均值作為該水溫下河蟹肌纖維的直徑。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS20.0、EXCEL軟件對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析及回歸性分析，顯著性設(shè)置為P<0.05 。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水溫的蛻殼與生長(zhǎng)分析

在133 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)中，各水溫組的河蟹成活率均達(dá)89%以上，但蛻殼間隔差異顯著：10 ℃和15 ℃水溫的實(shí)驗(yàn)蟹只有1次蛻殼，平均蛻殼間隔分別為109.39 d和67.92 d；20 ℃和25 ℃水溫的實(shí)驗(yàn)蟹發(fā)生了2次蛻殼，平均蛻殼間隔分別為46.63 d和43.69 d；30 ℃水溫的實(shí)驗(yàn)蟹完成了3次蛻殼，平均蛻殼間隔為38.01 d。隨著水溫升高，蛻殼增重率呈總體增加的趨勢(shì)；平均絕對(duì)生長(zhǎng)率和相對(duì)生長(zhǎng)率均隨著水溫的升高而逐步增加，且各水溫組的生長(zhǎng)率差異顯著。肥滿度隨著水溫的升高而逐漸下降，10 ℃和15 ℃水溫組的肥滿度顯著高于20 ℃、25 ℃和30 ℃水溫組。具體結(jié)果如表1所示。

表1 不同飼養(yǎng)水溫下的中華絨螯蟹蛻殼與生長(zhǎng)

2.2 水溫與蛻殼、生長(zhǎng)的相關(guān)性

在本實(shí)驗(yàn)中，蛻殼間隔隨著水溫的升高逐漸縮短，回歸方程為Y=-3.923X+135.80，各水溫組的蛻殼間隔存在顯著性差異；蛻殼增重率隨著水溫的升高呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，回歸方程為Y=0.918X+68.90，30 ℃水溫組的蛻殼增重率顯著高于其他水溫組，20 ℃和25 ℃水溫組的蛻殼間隔顯著高于10 ℃和15 ℃水溫組；絕對(duì)生長(zhǎng)率和相對(duì)生長(zhǎng)率均隨著水溫的升高而增加，回歸方程為(Y=0.007X-0.034，Y=0.06X-0.07)，各水溫組的生長(zhǎng)率存在顯著性差異；肥滿度隨著水溫的升高而降低，回歸方程為Y=-0.175X+63.10，10 ℃和15 ℃水溫組的肥滿度顯著高于20、25及30 ℃水溫組。具體結(jié)果如表2所示。

表2 不同飼養(yǎng)水溫下的中華絨螯蟹水溫與蛻殼間隔、生長(zhǎng)率及肥滿度的回歸分析

2.3 不同水溫的攝食率分析

試驗(yàn)期間，10 ℃和15 ℃水溫組的攝食率分別為1.58%和1.97%。20 ℃水溫組在第一個(gè)蛻殼周期的攝食率為3.48%，第二個(gè)蛻殼周期的攝食率為3.54%，平均為3.51%。25 ℃水溫組在第一個(gè)蛻殼周期的攝食率為4.88%，第二個(gè)蛻殼周期的攝食率為4.71%，平均為4.79%。30 ℃水溫組在第一個(gè)蛻殼周期的攝食率為5.54%，第二個(gè)蛻殼周期的攝食率為5.65%，第三個(gè)蛻殼周期的攝食率為4.55%，平均為5.25%。回歸方程為Y=0.203X-0.64，R2=0.963 2，各水溫組的攝食率存在顯著性差異(圖1)。

圖1 不同飼養(yǎng)水溫下中華絨螯蟹的攝食率

2.4 不同水溫的肌肉組織顯微結(jié)構(gòu)觀察

通過(guò)對(duì)5個(gè)水溫組河蟹的肌肉切片觀察發(fā)現(xiàn)，10 ℃水溫的河蟹肌纖維直徑為(451.69±113.45) μm(圖2a)，15 ℃為(431.10±124.35) μm(圖2b)，20 ℃為(407.57±101.54) μm(圖2c)，25 ℃為(295.80±58.48) μm(圖2d)，30 ℃為(347.14±70.99) μm(圖2e)，即隨著水溫升高河蟹肌纖維直徑在逐漸減小，但是30 ℃又有所增加。10、15與20 ℃三個(gè)水溫組間肌纖維直徑無(wú)顯著性差異，25 ℃與30 ℃兩個(gè)水溫組間也無(wú)顯著性差異，但前面三個(gè)水溫組(10、15、20 ℃)與后面兩個(gè)水溫組(25、30 ℃)存在顯著性差異。

圖2 不同飼養(yǎng)水溫下中華絨螯蟹肌纖維的顯微觀察

3 討論

溫度作為影響河蟹生長(zhǎng)發(fā)育最重要的外在因子之一，在河蟹的養(yǎng)殖過(guò)程中起著重要作用。有研究表明中華絨螯蟹幼體的大小和蛻皮存活率隨水溫的升高而降低[11]，本研究與此結(jié)果相似，表明溫度對(duì)河蟹的成活有重要影響。在適宜的水溫范圍內(nèi)幼蟹的生長(zhǎng)速度隨著水溫的升高而逐漸增加[12]，同樣，本研究也得到了相同的結(jié)果。高水溫組(25、30 ℃)的蛻殼間隔顯著低于低水溫組(10、15、20 ℃)，這是因?yàn)樗疁氐纳?，河蟹新陳代謝加快，促進(jìn)了河蟹攝食，增加了河蟹體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，從而加速了蛻殼，這與Anger等[13]報(bào)道的能否積累了足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量是幼體進(jìn)入脫皮周期的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)這一觀點(diǎn)相類(lèi)似。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)不同飼養(yǎng)水溫組的河蟹肥滿度均在60%左右，而當(dāng)肥滿度達(dá)到60%左右時(shí)河蟹將會(huì)啟動(dòng)蛻殼，這與陳嬌等[14]、李志華等[15]的研究結(jié)果相吻合。

攝食行為是動(dòng)物與生俱來(lái)的能力，也是機(jī)體能量代謝的主要過(guò)程，水產(chǎn)動(dòng)物通過(guò)攝食獲得生長(zhǎng)發(fā)育、蛻殼的能量，并逐漸形成一系列與之相關(guān)的生理生化及行為生態(tài)學(xué)方面的適應(yīng)特征[16]。本研究中，不同水溫組的河蟹在攝食上表現(xiàn)明顯差異，其中高水溫組(25、30 ℃)河蟹的攝食率尤為顯著，這可能是由于水溫的升高，河蟹體內(nèi)消化酶活性升高，從而促進(jìn)了河蟹的攝食，這與薛素燕等[17]的研究結(jié)果相類(lèi)似。河蟹肌纖維直徑大約在300～450 μm內(nèi)，比牛等動(dòng)物的肌纖維(20～60 μm)[18]大10倍左右。一般情況下肌纖維密度與肌纖維直徑呈負(fù)相關(guān)[19]。本研究中隨著水溫的升高，肌纖維直徑逐漸縮小，但當(dāng)水溫為30 ℃時(shí)，河蟹肌纖維直徑又有所增加。按照肌纖維越小，肉質(zhì)越嫩，肌纖維越大，肉質(zhì)越差這一標(biāo)準(zhǔn)[20]，推測(cè)25 ℃水溫下的河蟹肉質(zhì)可能最好。

本研究中設(shè)定的最低水溫為10 ℃，此水溫下的河蟹也會(huì)攝食與蛻殼，表明啟動(dòng)河蟹蛻殼與生長(zhǎng)的最低水溫可能低于10 ℃。此外，在30 ℃水溫組發(fā)現(xiàn)性早熟現(xiàn)象，這是因?yàn)闇囟仍礁?，河蟹的新陳代謝越旺盛，性腺發(fā)育也越快[21]，后期我們將應(yīng)用個(gè)體養(yǎng)殖系統(tǒng)所具有的恒溫優(yōu)勢(shì)和條件，加強(qiáng)溫度對(duì)性腺發(fā)育等方面的研究。