許 娜，劉馨璐，湯 蓉，張 曦，李 莉，李大鵬

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程試驗(yàn)室，長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢430070)

在有限的水體空間內(nèi)使養(yǎng)殖魚類生長(zhǎng)的更快更好，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)普遍追求的目標(biāo)。目前許多研究關(guān)注日糧、養(yǎng)殖密度、流速等因子對(duì)養(yǎng)殖魚類生長(zhǎng)的影響[1-3]，以期指導(dǎo)魚類生產(chǎn)，從而達(dá)到促進(jìn)魚類健康快速生長(zhǎng)的目的。魚類普遍存在逆水流游泳的生理現(xiàn)象，在魚類的生命活動(dòng)過程中，水流速度是一個(gè)重要的環(huán)境影響因子。研究表明，適當(dāng)?shù)乃魉俣?0.75～2 bl/s)會(huì)對(duì)魚類的攝食、生長(zhǎng)、新陳代謝等生命活動(dòng)產(chǎn)生積極的影響[1，4，5]等。進(jìn)一步的研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)魚體生長(zhǎng)可能與多種因素有關(guān)，例如食物轉(zhuǎn)換效率、甲狀腺激素(THs)以及生長(zhǎng)激素(GH)等[6]，然而相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

THs包括甲狀腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)[7]。THs在機(jī)體代謝生理過程發(fā)揮重要作用，并且是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子[8,9]。在魚類中，THs的分泌由下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸調(diào)節(jié)，垂體前葉釋放的促甲狀腺激素(TSH)經(jīng)血液運(yùn)輸至甲狀腺濾泡，刺激其合成釋放THs到血液中以發(fā)揮作用[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物在運(yùn)動(dòng)后，血清T4和T3濃度顯著降低[13-14]。而魚類在不同流速的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，血清T3顯著升高[15-16]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)THs的代謝可能是通過影響其合成、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。硬骨魚甲狀腺濾泡主要合成分泌T4，而T3主要是在外周組織中，通過脫碘酶(IDs)去除T4外環(huán)上的碘轉(zhuǎn)化而來[17-18]。T3是機(jī)體中發(fā)揮生物活性的主要THs形式，通過與血清中的甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TTR)結(jié)合運(yùn)輸至靶組織器官，與甲狀腺激素受體(TR)結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，影響機(jī)體的生殖、生長(zhǎng)、發(fā)育等過程[19-20]。在血液中，大部分T3和T4與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，形成結(jié)合態(tài)的THs，少部分T3和T4不與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，呈游離態(tài)THs(FT3和FT4)[21]。兩種狀態(tài)的THs之間可以相互轉(zhuǎn)化，以保持機(jī)體中THs的穩(wěn)態(tài)[22]。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國(guó)最主要的淡水養(yǎng)殖魚類。據(jù)2020年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒[23]報(bào)道，草魚的養(yǎng)殖總產(chǎn)量在2019年已超過553萬(wàn)噸，位居我國(guó)魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量第一。目前，流道養(yǎng)殖、工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖模式通過創(chuàng)造水流或環(huán)流環(huán)境，誘導(dǎo)魚類進(jìn)行逆流游泳，但多大流速的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)草魚的促生長(zhǎng)效應(yīng)最為顯著，不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)草魚甲狀腺生理代謝有何影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，通過對(duì)草魚幼魚進(jìn)行不同水流刺激的長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，探討其對(duì)草魚幼魚生長(zhǎng)和甲狀腺激素代謝的影響，旨在確定草魚適宜流速范圍，為草魚流道養(yǎng)殖模式提供基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)魚與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)以健康草魚幼魚為試驗(yàn)對(duì)象，試驗(yàn)魚購(gòu)自湖北省黃岡市團(tuán)風(fēng)縣百容良種場(chǎng)。試驗(yàn)前置于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院基地循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)。

試驗(yàn)采用自行設(shè)計(jì)的環(huán)流水養(yǎng)殖裝置(圖1)。在內(nèi)徑1 m，水深80 cm的圓形養(yǎng)殖缸內(nèi)部中央放置一直徑25 cm，高80 cm的PVC管。養(yǎng)殖缸右側(cè)用吸盤吸附一可調(diào)節(jié)水流量的潛水泵，潛水泵出水口安裝PVC直通管(長(zhǎng)50 cm)，側(cè)面同一直線上鉆孔出水(8～12個(gè))。試驗(yàn)裝置通電后，依據(jù)不同功率(25 W、100 W和150 W;型號(hào) HJ-1500HJ-5500HJ-6000,森森集團(tuán)股份有限公司)的潛水泵造成不同水流速度的訓(xùn)練環(huán)境。

圖1 環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)設(shè)計(jì)圖

將初始體重和體長(zhǎng)分別為(97.68±3.26) g和(18.18±0.13) cm的168尾健康草魚幼魚隨機(jī)分為靜水對(duì)照組(0 bl/s)和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(0.5、1.0和1.5 bl/s)，每組3個(gè)平行養(yǎng)殖缸，每缸14尾魚。為了減少應(yīng)激，在正式試驗(yàn)前3 d，逐步增加訓(xùn)練時(shí)間，直至達(dá)到正式訓(xùn)練時(shí)長(zhǎng)16 h/d(17:00～9:00)。試驗(yàn)歷時(shí)為10周，每2周測(cè)定一次試驗(yàn)魚的體長(zhǎng)體重，根據(jù)體長(zhǎng)的平均值調(diào)節(jié)至試驗(yàn)相對(duì)應(yīng)的流速，利用LS300-A型便攜式流速測(cè)算儀(南京卓瑪機(jī)電有限公司)測(cè)定流速大小。按照草魚幼魚體重的3%投喂飼料[24]，每天投喂2次(9:00和16:00)，投喂期間各組水環(huán)境均保持靜水狀態(tài)。試驗(yàn)期間水溫為(25.56±0.36) ℃，pH為8.06±0.02，溶氧保持在6.0 mg/L以上。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)10周，當(dāng)天訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)行采樣。每缸隨機(jī)選擇9尾魚，MS-222(200 mg/L)麻醉后用注射器自尾靜脈取血2～3 mL，3 000 r/min離心20 min，取上層血清，保存于-80 ℃下用于激素測(cè)定。取肝臟樣品用凍存管迅速放入液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱用于脫碘酶和基因檢測(cè)。

1.3 血清皮質(zhì)醇測(cè)定

采用放射性免疫測(cè)定法測(cè)定血清皮質(zhì)醇含量，使用皮質(zhì)醇放射性免疫試劑盒(北京北方生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20191019)進(jìn)行測(cè)定。具體方法參考文獻(xiàn)[17]。

1.4 血清葡萄糖測(cè)定

葡萄糖(GLU)試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司(批號(hào)193681)，在Selectra XL型全自動(dòng)生化分析儀(荷蘭威圖科學(xué)公司)上測(cè)定。

1.5 血清甲狀腺激素與促甲狀腺激素含量的測(cè)定

血清甲狀腺激素(T3、T4、FT3和FT4)和促甲狀腺激素(TSH)含量采用酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)依次為201907001、201907001、201909001、201908001和201907001)測(cè)定。

1.6 脫碘酶含量的測(cè)定

脫碘酶(ID1、ID2和ID3)含量采用酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技，批號(hào)202007)測(cè)定。用純化的魚脫碘酶(ID1、ID2和ID3)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入脫碘酶(ID1、ID2和ID3)，再與HRP標(biāo)記的脫碘酶(ID1、ID2和ID3)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色,TMB在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品中的脫碘酶(ID1、ID2和ID3)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中魚脫碘酶(ID1、ID2和ID3)濃度。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用總RNA提取試劑(武漢科爾普生物科技有限公司，批號(hào)130318)提取肝臟總RNA；使用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR(gDNA digester plus)試劑盒(YEASEN，批號(hào)H0901221)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；使用HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(Low Rox Plus)試劑盒(YEASEN，批號(hào)H6004040)并在Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR Detection System(Applied Biosystems,USA)上進(jìn)行熒光定量反應(yīng)?；蛱禺愋砸镄蛄?表1)參考本試驗(yàn)室已驗(yàn)證引物[17]。具體方法參考文獻(xiàn)[25]。

1.8 數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan法多重比較分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Graphpad Prism.v 6.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 草魚幼魚生長(zhǎng)曲線

不同流速的訓(xùn)練下，草魚幼魚的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)如圖2所示。增長(zhǎng)最快的是0.5 bl/s和1.0 bl/s訓(xùn)練試驗(yàn)組，其次是1.5 bl/s訓(xùn)練試驗(yàn)組，增長(zhǎng)速度最慢的是0 bl/s對(duì)照組。

圖2 不同流速下草魚幼魚的生長(zhǎng)曲線

2.2 血清葡萄糖和皮質(zhì)醇含量

草魚幼魚在不同水流刺激下運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練10周后，各組血清中葡萄糖和皮質(zhì)醇含量均保持穩(wěn)定水平，并未觀察到顯著性變化(表2)。

表2 不同流速下草魚幼魚血清葡萄糖和皮質(zhì)醇含量

2.3 血清THs含量和T3/T4比值

隨著流速的增加，草魚幼魚血清T3和T4含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖3)。與對(duì)照組相比，1.0 bl/s和1.5 bl/s試驗(yàn)組草魚幼魚血清T3含量顯著降低，0.5 bl/s試驗(yàn)組降低不顯著，而各試驗(yàn)組(0.5、1.0和1.5 bl/s)T4含量皆顯著降低。10周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后未觀察到血清FT3和FT4的顯著變化(圖3)。對(duì)各流速組的T3與T4的比值進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組(0.5、1.0和1.5 bl/s)T3/T4顯著高于對(duì)照組，分別增加14.00%、20.76%和18.12%(圖4)。

圖3 不同流速訓(xùn)練下的草魚幼魚血清THs含量

圖4 不同流速下草魚幼魚血清T3/T4

2.4 血清TSH含量

10周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改變了草魚幼魚血清中TSH水平(圖5)。0.5 bl/s試驗(yàn)組TSH水平和其他三組無(wú)顯著性差異，而1.0 bl/s和1.5 bl/s試驗(yàn)組草魚幼魚血清TSH含量顯著上升，分別是0 bl/s對(duì)照組的1.56和1.67倍。

圖5 不同流速下草魚幼魚血清TSH含量

2.5 肝臟脫碘酶含量

與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組脫碘酶(ID1、ID2和ID3)含量皆為上升趨勢(shì)(圖6)。ID1在1.5 bl/s試驗(yàn)組草魚幼魚肝臟中含量最高，在0.5和1.0 bl/s試驗(yàn)組中次之，且兩組間無(wú)顯著性差異。試驗(yàn)魚肝臟ID2含量隨著流速的增加而增加，且各組之間皆有顯著性差異。ID3含量在各組間未見顯著性差異。

圖6 不同流速下草魚幼魚肝臟中脫碘酶含量

2.6 甲狀腺激素代謝相關(guān)基因表達(dá)量

1.0 bl/s和1.5 bl/s試驗(yàn)組草魚幼魚肝臟中ttrmRNA水平顯著高于0 bl/s和0.5bl/s組，而0 bl/s和0.5 bl/s組間沒有顯著差異(圖7)。試驗(yàn)組tr-α和tr-β基因表達(dá)量高于對(duì)照組，其中0.5 bl/s試驗(yàn)組tr-α表達(dá)水平和其他三組無(wú)顯著差異(圖7)。

圖7 不同流速下草魚幼魚肝臟中ttr、tr-α和tr-β的基因相對(duì)表達(dá)

3 討論

魚類在發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)會(huì)激活下丘腦-垂體-腎間組織(HPI)軸，導(dǎo)致血清皮質(zhì)醇的含量發(fā)生顯著升高，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體糖異生作用來升高血糖，所以血清皮質(zhì)醇和葡萄糖的含量變化可以被用來評(píng)估魚類是否發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)[26-27]。魚類在處于擁擠脅迫、亞硝酸鹽脅迫和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)，機(jī)體會(huì)升高血清皮質(zhì)醇和葡萄糖等血清生化指標(biāo)[28-30]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)魚類發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)可能和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的強(qiáng)度、時(shí)間等有關(guān)。如虞順年等[31]研究發(fā)現(xiàn)，黑鯛(Sparusmacrocephalus)在適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(2 bl/s)后血清葡萄糖含量下降，而高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(4 bl/s)顯著升高血糖含量，說明較高的訓(xùn)練強(qiáng)度才引起魚類應(yīng)激。本試驗(yàn)中草魚幼魚在1.5 bl/s及以下流速皆未顯示血清葡萄糖含量的顯著變化，表明草魚幼魚能夠適應(yīng)1.5 bl/s及以下流速的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。Nielsen等[32]發(fā)現(xiàn)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在游泳開始時(shí)，血漿皮質(zhì)醇水平以運(yùn)動(dòng)依賴的方式增加，但在24 h內(nèi)恢復(fù)到游泳前的水平，持續(xù)游泳對(duì)此沒有明顯的影響。與王海珊等[16]研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)中草魚幼魚在經(jīng)歷不同流速的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，血清皮質(zhì)醇含量也未發(fā)生顯著性變化，說明長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致草魚幼魚適應(yīng)了運(yùn)動(dòng)的環(huán)境。Hernández等[33]發(fā)現(xiàn)，虹鱒在運(yùn)動(dòng)后，血漿皮質(zhì)醇和葡萄糖濃度均明顯升高，但經(jīng)過訓(xùn)練后訓(xùn)練魚的代謝反應(yīng)能力提高，并減少了強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)的應(yīng)激，能顯著平衡這種升高現(xiàn)象。本試驗(yàn)草魚幼魚每天經(jīng)歷16 h的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，持續(xù)70 d，最后未觀察到血清皮質(zhì)醇和葡萄糖含量的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明草魚幼魚可以適應(yīng)一定流速下的長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，不會(huì)發(fā)生生理應(yīng)激以對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響。我們發(fā)現(xiàn)1.5 bl/s及以下的流速的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)草魚幼魚的生長(zhǎng)均有積極作用，訓(xùn)練后的草魚具有更高的增重率、特定生長(zhǎng)率和更低的餌料系數(shù)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)了草魚幼魚的生長(zhǎng)和食物轉(zhuǎn)化率。根據(jù)生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，0.5～1.0 bl/s流速是促進(jìn)草魚幼魚生長(zhǎng)的最適流速。

THs的分泌受到HPT軸的調(diào)控[34]。魚類垂體釋放的TSH作用于甲狀腺濾泡，使其合成釋放T4到血液中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等活動(dòng)[35]。研究發(fā)現(xiàn)，微囊藻毒素處理會(huì)顯著降低斑馬魚(Daniorerio)血清T4的濃度，同時(shí)導(dǎo)致肝臟tsh基因表達(dá)量的顯著增加[36]。當(dāng)機(jī)體血液中的T4含量發(fā)生顯著降低時(shí)，一些硬骨魚的HPT軸會(huì)發(fā)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，通過不同途徑刺激T4的合成分泌增加，以維持體內(nèi)T4水平的穩(wěn)定[37]。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組草魚幼魚血清T4水平顯著降低，可能觸發(fā)對(duì)TSH的反饋調(diào)節(jié)而導(dǎo)致血清TSH含量顯著升高。

在機(jī)體中，T3是一種具有生物活性的THs，主要是在脫碘酶的作用下，經(jīng)過T4的外環(huán)脫碘作用轉(zhuǎn)化而來[38]。ID1和ID2可以催化T4外環(huán)脫碘形成T3，其中ID2發(fā)揮主要作用，而ID3催化T3和T4的失活[39-41]。所以在魚類中，ID2和ID3主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)THs代謝中T3的生成和轉(zhuǎn)化速度，即調(diào)控著THs的激活與失活，以維持體內(nèi)THs代謝穩(wěn)態(tài)。脫碘酶的活性可以間接反映機(jī)體外周組織內(nèi)不同形式THs之間相互轉(zhuǎn)化的代謝情況[10]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組草魚幼魚肝臟中ID1和ID2含量顯著升高而ID3含量無(wú)顯著差異，說明未發(fā)生T3和T4的大量失活，而是加快了T4向T3的轉(zhuǎn)化速率，激活THs，促進(jìn)機(jī)體代謝。研究發(fā)現(xiàn)，大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)在游泳運(yùn)動(dòng)后血液T3/T4比值顯著提高[15]。長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的草魚幼魚血清中T3/T4比值的增大說明T4向T3的轉(zhuǎn)化增加，提高了THs活性形式的利用效率。

TTR主要負(fù)責(zé)結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)體內(nèi)THs，T3與其結(jié)合運(yùn)輸至外周組織中，通過與相關(guān)靶細(xì)胞的TR結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[20,42]。甲狀腺激素受體包含兩種類型，即TR-α與TR-β[43]。Liu等[44]發(fā)現(xiàn)斑馬魚幼魚暴露于微囊藻毒素后，全身T3含量發(fā)生顯著性的降低，而ttrmRNA水平顯著上調(diào)。王海珊等[16]發(fā)現(xiàn)異育銀鯽“中科 3 號(hào)”在2 bl/s流速下游泳訓(xùn)練8周后，肝臟tr-α基因表達(dá)量顯著上升，促進(jìn)了與T3的結(jié)合，以發(fā)揮THs生物學(xué)效應(yīng)。THs通過調(diào)控靶組織基因的表達(dá)來影響生理過程[45]。本試驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練顯著上調(diào)草魚幼魚肝臟ttr、tr-α和tr-βmRNA水平，促進(jìn)了T3的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，導(dǎo)致血清T3含量顯著降低。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致T4和T3快速轉(zhuǎn)化，更好地調(diào)控魚類的生長(zhǎng)發(fā)育等代謝活動(dòng)。

經(jīng)過10周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，草魚幼魚能夠適應(yīng)1.5 bl/s及以下的水流環(huán)境，不同流速影響機(jī)體THs的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝各過程，造成了甲狀腺激素水平的變化，進(jìn)而調(diào)控魚類相關(guān)代謝活動(dòng)，最終促進(jìn)了魚體生長(zhǎng)。生長(zhǎng)曲線顯示，0.5～1.0 bl/s的流速是促進(jìn)草魚幼魚生長(zhǎng)的最適流速，此時(shí)魚體的生長(zhǎng)速度最快。