陳雨晴, 呂 峰, 馬志洲

(福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

植物多酚具有優(yōu)異的抑菌活性，但其種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，抑菌效果各不相同[1].如從苦蕎麥麩乙酸乙酯提取物中可分離出蘆丁、槲皮素、異槲皮素等多種酚類物質(zhì)，其中，槲皮素的抗痤瘡丙酸桿菌和抗表皮葡萄球菌性能分別是異槲皮素的16、8倍，而蘆丁僅對表皮葡萄球菌有抑制作用.這可能是槲皮素具有游離的C3-OH結(jié)構(gòu)及高度的親脂性而表現(xiàn)出更強的抑菌性能[2].由于不同研究中多酚的種類、結(jié)構(gòu)及供試菌種有所差異，使得幾乎每種酚類物質(zhì)都具有其獨特的抑菌作用.

石莼(Ulvalactuca)別名海白菜、海萵苣等，主要分布于黃海西區(qū)、東海西區(qū)、南海北區(qū)、南海南區(qū)，是我國資源極為豐富的野生藻類之一[3-4].據(jù)報道，石莼多酚具有廣譜的抑菌性能，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細菌及鏈格孢菌、青霉菌等真菌具有良好的抑制作用；經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析發(fā)現(xiàn)，其主要抑菌作用成分為兒茶酚和表兒茶素等酚類物質(zhì)[5].基于此，本研究以石莼醇提物為試材，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌為供試菌，著重考察其基于細胞膜損傷的抑菌作用，以期為石莼功能性成分的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

石莼粉(80目)為福建海興保健食品有限公司產(chǎn)品；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)由福建農(nóng)林大學食品科學學院微生物實驗室提供；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptone soya broth, TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(tryptone soya agar, TSA)為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；碘化丙啶(propidium iodide, PI) 為美國Sigma公司產(chǎn)品；0.1 mol·L-1(pH 7.4)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；氯化鈉、考馬斯亮藍G250、乙醇、磷酸、戊二醛等均為分析純，為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品.

儀器有LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司)、SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、MIKRO 220R立式高速冷凍離心機(德國Hettich公司)、SepectraMax i3X酶標儀(美谷分子儀器有限公司)、DDS-11AT電導(dǎo)率儀(上海雷磁儀器廠)、Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)、Nova NanoSEM 230場發(fā)射掃描電鏡(美國FEI公司)、HITACHI H-7650透射電鏡(日本日立高新技術(shù)公司).

1.2 方法

1.2.1 石莼醇提物樣液的制備 以實驗室自制的石莼乙醇粗提物為試材，按文獻[6]的方法，采用超聲輔助乙醇溶液提取、鋅離子螯合法分離純化制備石莼醇提物.采用福林酚法[7]測定所得樣品中多酚含量為251.8 mg·g-1(以沒食子酸計).將石莼醇提物用無菌去離子水配制成一定質(zhì)量濃度的樣液，經(jīng)0.22 μm濾菌器過濾除菌后備用.

1.2.2 供試菌液的制備 分別將凍存于-80 ℃的供試菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌)采用劃線法在TSA平板上活化，挑取單菌落接種于10 mL TSB培養(yǎng)基中，將供試菌于37 ℃培養(yǎng)18 h至對數(shù)生長期，于5 000 r·min-1離心10 min收集菌體.菌體用無菌生理鹽水洗滌3次，重懸于無菌生理鹽水中，制成濃度約為108cfu·mL-1的菌液，均在24 h內(nèi)使用.

1.2.3 最低抑制濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)、最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)的測定 參考Wilson et al[8]的方法并稍作修改.按“1.2.1”的方法分別配制質(zhì)量濃度為200 mg·mL-1的石莼醇提物樣液，采用二倍稀釋法將其用TSB液體培養(yǎng)基稀釋成不同質(zhì)量濃度的待測樣液.另取采用“1.2.2”的方法制備的4種菌液加入TSB液體培養(yǎng)基進行稀釋，使其菌液濃度均為106cfu·mL-1.分別取上述各待測樣液100 μL加入96孔無菌培養(yǎng)板中，并分別加入上述稀釋后的各供試菌液100 μL，使各組培養(yǎng)液中石莼醇提物樣液的最終質(zhì)量濃度分別為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg·mL-1，最終的菌液濃度均為5×105cfu·mL-1.混勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以肉眼未見渾濁的最小質(zhì)量濃度為MIC.取100 μL未見渾濁的培養(yǎng)液涂布于TSA平板上，并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以無菌生長的最小質(zhì)量濃度為MBC.同時以不加菌液的培養(yǎng)液為陰性對照，以生理鹽水代替待測樣液為陽性對照進行試驗，每組處理均重復(fù)3次.

1.2.4 生長曲線的繪制 參考Diao et al[9]的方法并稍作修改.將按“1.2.1”的方法配制的石莼醇提物樣液添加到TSB液體培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度為1/2×MIC、1×MIC，以不加石莼醇提物樣液的TSB培養(yǎng)液為空白對照.取上述各組培養(yǎng)液20 mL于無菌離心管中，分別加入按“1.2.2”的方法制備的4種菌液100 μL，使菌液濃度均為5×105cfu·mL-1，混勻后置搖床(280 r·min-1、37 ℃)中振蕩培養(yǎng).每隔2 h各取200 μL培養(yǎng)液加入96孔無菌培養(yǎng)板中，測定其在600 nm波長處的光密度(D).以培養(yǎng)時間為橫坐標，D600 nm為縱坐標，繪制供試菌的生長曲線，每組處理均重復(fù)3次.

1.2.5 供試菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的測定 分別移取按“1.2.2”的方法制備的4種菌液20 mL于無菌離心管中，各加入等體積不同質(zhì)量濃度的石莼醇提物樣液，使其終質(zhì)量濃度均為0、1×MIC、2×MIC，混勻后置于搖床(280 r·min-1、37 ℃)中振蕩，每隔1 h測定其電導(dǎo)率[10].每組處理均重復(fù)3次.

1.2.6 菌體核酸、蛋白質(zhì)泄露量的測定 按“1.2.5”的方法制備4種菌培養(yǎng)液，置搖床(280 r·min-1、37 ℃)中振蕩4 h.分別取上述4種菌培養(yǎng)液10 mL，于10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液.各取200 μL上清液加入96孔無菌培養(yǎng)板中，測定其D260 nm，考察菌體核酸泄露量；分別再取上清液1 mL，用考馬斯亮藍法[11]測定其D595 nm，考察菌體蛋白質(zhì)泄露量.每組處理均重復(fù)3次.

1.2.7 金黃色葡萄球菌菌體損傷率的測定 參考寧亞維等[12]的方法并稍作修改.取按“1.2.2”的方法培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌，用PBS調(diào)節(jié)菌液濃度約為108cfu·mL-1，分別加入等體積不同質(zhì)量濃度的石莼醇提物樣液，使其終質(zhì)量濃度為0、1×MIC、2×MIC，于37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h.向上述各培養(yǎng)液中分別加入PI染液，控制其最終質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1，避光染色20 min后，用PBS洗滌菌體3次，采用流式細胞儀(激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長650 nm)測定菌體損傷率.

1.2.8 細菌超微結(jié)構(gòu)的觀察 按“1.2.7”的方法制備金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液，置搖床培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)4 h.取上述培養(yǎng)液于5 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，用PBS洗滌3次，重懸于2.5%戊二醛-PBS溶液中，于4 ℃下固定12 h.按掃描電鏡、透射電鏡生物樣品制備法[13]進行前處理，在電鏡下觀察菌體超微結(jié)構(gòu).

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件對試驗數(shù)據(jù)進行作圖分析；采用DPS 7.05軟件以Duncan新復(fù)極差法對各單因素的平均值進行顯著性檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 石莼醇提物的抑菌活性

由表1可知，石莼醇提物對4種菌的MIC、MBC均為1.56～6.25 mg·mL-1，尤其對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強，其MIC、MBC分別為1.56、3.13 mg·mL-1，而對枯草芽孢桿菌的抑制能力最弱，兩指標值均為6.25 mg·mL-1.推測可能是由于菌體細胞結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致敏感性差異[14].金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌(G+)，其細胞壁主要成分為肽聚糖，并結(jié)合磷壁酸，而多酚易與二者結(jié)合進而破壞細胞壁致菌體死亡.大腸桿菌、沙門氏菌是革蘭氏陰性菌(G-)，其細胞壁外壁含脂蛋白、脂多糖，內(nèi)壁肽聚糖含量少，不易與多酚結(jié)合.因此，多酚對G+的抑制效果通常優(yōu)于G-.而枯草芽孢桿菌雖然也是G+，但其能夠產(chǎn)生抗逆性很強的芽孢，這可能是石莼醇提物中的多酚對枯草芽孢桿菌抑制效果不佳的原因.

表1 石莼醇提物對4種菌MIC、MBC的影響Table 1 MIC and MBC of U.lactuca ethanol extracts against 4 bacteria

2.2 4種菌的生長曲線

圖1顯示：4種菌的對照組均具有正常的生長曲線，即有明顯的對數(shù)生長期，均在18 h后進入穩(wěn)定期；而加入石莼醇提物后，4種菌的生長曲線均發(fā)生明顯變化.當石莼醇提物的濃度為1/2×MIC時，枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別依次延遲至第6、10、12、14小時才開始緩慢生長，且進入穩(wěn)定期后菌體數(shù)目均分別極顯著低于對照組(P<0.01)，表明菌體生長受到明顯抑制；當石莼醇提物濃度為1×MIC時，4種菌均無生長曲線，即D600 nm無變化，表明無菌體生長現(xiàn)象，證實了石莼醇提物對4種菌均具有優(yōu)異的抑制作用.同樣，董曉敏[15]制備的葡萄籽原花青素也具有高效抑制菌體生長的作用，推測是由于在培養(yǎng)初期加入抑菌液，其分子吸附在細菌表面，形成分子膜，阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)進入細菌體內(nèi)從而抑制了細菌為增殖期準備的相關(guān)產(chǎn)物的合成.

圖1 不同處理下4種菌的生長曲線Fig.1 Effects of U.lactuca ethanol extracts on the growth of bacteria

2.3 石莼醇提物對菌體細胞膜完整性的影響

2.3.1 4種菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率 生物細胞膜受損可使其通透性增大，細胞滲透壓失衡，胞內(nèi)電解質(zhì)外泄，導(dǎo)致其培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升.圖2顯示：4種菌在石莼醇提物的作用下，其培養(yǎng)液中的電導(dǎo)率均極顯著提高(P<0.01)，并在3 h后基本趨于穩(wěn)定；而對照組培養(yǎng)液的電導(dǎo)率僅有略微增加，這可能是由細菌正常死亡所造成的.處理3 h時，1×MIC試驗組中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率比對照組分別提高了1.07、0.85、1.10、0.82倍，2×MIC試驗組比對照組分別提高了1.95、1.77、1.92、1.73倍.綜上，石莼醇提物可極顯著提高4種菌細胞膜的通透性(P<0.01)，且效果與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系.

圖2 石莼醇提物對4種菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effects of U.lactuca ethanol extracts on the conductivity of bacteria

2.3.2 菌體核酸、蛋白質(zhì)的泄露量 正常菌體的核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)存在于細胞內(nèi)，而細胞膜受損則造成膜通透性增大，進而導(dǎo)致胞內(nèi)的生物大分子物質(zhì)外泄，因此通過測定培養(yǎng)液中核酸、蛋白質(zhì)的含量可以了解細菌細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷情況.表2顯示，經(jīng)石莼醇提物處理4 h后，4種菌的核酸、蛋白質(zhì)泄露量呈劑量依賴方式極顯著上升(P<0.01).1×MIC試驗組中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的核酸泄露量分別是對照組的16、13、14、12倍，2×MIC試驗組分別是對照組的34、28、32、26倍；1×MIC試驗組中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的蛋白質(zhì)泄露量分別是對照組的27.91、12.97、17.22、11.13倍，2×MIC試驗組則分別是對照組的46.26、28.81、28.51、26.25倍.表明石莼醇提物可通過提高細菌細胞膜的通透性，促進胞內(nèi)生物大分子外泄，起到抑菌的效果.石莼醇提物對金黃色葡萄球菌細胞膜的破壞效果最好，抑制作用最強，對大腸桿菌的抑制效果次之，而對枯草芽孢桿菌、沙門氏菌的抑制效果較弱，這與本研究對菌體培養(yǎng)液電導(dǎo)率的測定結(jié)果一致.

表2 石莼醇提物對4種菌核酸、蛋白質(zhì)泄露量的影響1)Table 2 Effects of U.lactuca ethanol extracts on nucleic acid and protein leakage of bacteria

2.3.3 菌體損傷率 當菌體細胞膜受損時，熒光探針PI能夠穿過受損細胞膜進入細胞內(nèi)將其核酸染色，利用流式細胞儀可對染色菌體進行定量分析，顯示菌體的損傷率.根據(jù)4種菌對石莼醇提物的敏感性，選取最具代表性的金黃色葡萄球菌進行進一步研究.從圖3可以看出：對照組的金黃色葡萄球菌基本無PI熒光信號(菌體損傷率為0.05%)，表明細胞膜結(jié)構(gòu)完整，PI無法進入細胞內(nèi)；1×MIC試驗組的菌體損傷率為24.67%；2×MIC試驗組的菌體損傷率則高達96.42%，表明該組菌體細胞膜損傷嚴重，絕大部分菌體都被PI染色.

圖3 石莼醇提物對金黃色葡萄球菌細胞損傷率的影響Fig.3 Effect of U.lactuca ethanol extracts on cell damage rate of S.aureus

結(jié)合“2.3.1”、“2.3.2”結(jié)果可知，石莼醇提物呈劑量依賴方式破壞供試菌細胞膜的完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外泄，菌體無法生長繁殖，這與蓮子B型寡聚原花青素對大腸桿菌的作用效果[16]類似.據(jù)報道，多酚可通過多個侵入性靶點破壞細菌細胞膜的完整性，起到抑菌或殺菌的作用：如能螯合細菌細胞外膜的二價陽離子，釋放脂多糖，增大膜通透性；能與細胞膜磷脂雙分子層高度結(jié)合，降低膜的流動性，并在細胞膜上形成孔道，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)滲漏；此外還能與細菌外膜蛋白相互作用，使其沉淀變性，破壞細胞膜物質(zhì)運輸?shù)裙δ躘17-19].

2.4 菌體超微結(jié)構(gòu)

掃描電鏡下可觀察到金黃色葡萄球菌體細胞表面形態(tài)的變化.對照組的菌體呈飽滿球狀，表面均一光滑，為典型球菌形態(tài)(圖4a)；1×MIC試驗組中有部分菌體表面粗糙出現(xiàn)褶皺，胞外附有少量內(nèi)容物(圖4b)；而2×MIC試驗組的菌體細胞膜嚴重萎縮，喪失其固有形態(tài)，部分菌體出現(xiàn)孔洞，導(dǎo)致大量胞內(nèi)物質(zhì)外泄(圖4c).

a～c表示與其對應(yīng)區(qū)域A～C的局部放大.圖4 金黃色葡萄球菌的掃描電鏡圖(30 000×)Fig.4 Scanning electron microscope images of S.aureus(30 000×)

透射電鏡下可觀察到金黃色葡萄球菌體細胞膜及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化.對照組的菌體形態(tài)正常，細胞膜完整并與細胞壁界限分明，細胞質(zhì)分布均勻(圖5a)；1×MIC試驗組的菌體仍保持球菌基本形態(tài)，但部分菌體的細胞膜與細胞壁界限開始出現(xiàn)模糊、細胞質(zhì)分布不均勻、局部細胞質(zhì)密度下降，呈逐漸透明等現(xiàn)象(圖5b)；在2×MIC試驗組中，菌體嚴重萎縮，細胞質(zhì)密度顯著下降，部分菌體因細胞膜破裂而崩潰，致使胞內(nèi)物質(zhì)大量泄露(圖5c).

圖5 金黃色葡萄球菌的透射電鏡圖(50 000×)Fig.5 Transmission electron microscope images of S.aureus(50 000×)

結(jié)合圖4、圖5可知，金黃色葡萄球菌在不同質(zhì)量濃度石莼醇提物的作用下，其菌體內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)均受到不同程度的破壞，且石莼醇提物與菌體受損程度呈明顯的量—效關(guān)系，推測石莼醇提物中的多酚可使菌體細胞膜組分溶解與轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)失衡，致使細胞膜疏松粗糙甚至破裂瓦解，胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄，菌體細胞失水萎縮，最終喪失生長、繁殖能力.此結(jié)果與丁香酚對金黃色葡萄球菌的作用[20]類似，可使菌體細胞膜表面出現(xiàn)孔洞，直接導(dǎo)致細胞膜崩潰瓦解；但與石榴皮鞣質(zhì)對金黃色葡萄球菌的作用[21]有所差別，石榴皮鞣質(zhì)僅能改變菌體外膜形態(tài)，使其表面塌陷，并未造成細胞膜破裂.

3 結(jié)論

細胞膜是細菌細胞的重要組織結(jié)構(gòu)，具有保護菌體內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)節(jié)物質(zhì)進出等功能；當細胞膜遭到破壞時，菌體滲透壓失衡、代謝紊亂，最終導(dǎo)致其喪失生長、繁殖的能力.本研究結(jié)果表明，石莼醇提物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有一定的抑制作用，對4種菌的MIC、MBC均為1.56～6.25 mg·mL-1，尤以對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好.進一步研究結(jié)果顯示，2×MIC的石莼醇提物能夠破壞絕大部分供試菌體細胞膜的完整性，致使細胞膜上出現(xiàn)孔道，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)大量外泄，胞外電解質(zhì)濃度增加，電導(dǎo)率顯著上升；PI染料進入破損菌體細胞內(nèi)對核酸染色的結(jié)果顯示，菌體損傷率高達96.42%；通過掃描電鏡、透射電鏡直觀觀察到供試菌體形態(tài)變化顯著，細胞膜嚴重皺縮乃至破裂，胞內(nèi)物質(zhì)大量泄露.因此，本研究認為細胞膜是石莼醇提物發(fā)揮抑菌作用的重要位點.近年來多項研究表明，植物多酚可通過抑制細胞壁、細胞膜及核酸、蛋白質(zhì)的合成，抑制能量代謝等途徑單獨或者協(xié)同發(fā)揮抑菌作用[22].需要說明的是，本研究僅針對細胞膜損傷情況進行探討，尚未對其他作用性靶點進行研究；此外，在后續(xù)研究中可對石莼醇提物的主要成分及結(jié)構(gòu)加以分析、鑒定，以更深入、系統(tǒng)地探討石莼醇提物的抑菌作用.