黃在興, 宋昭昭, 梅 蘭, 李 曼, 劉朋虎, 蘇德偉, 林占熺, 魯國(guó)東,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002)

巨菌草(Pennisetumgiganteumz.x.lin)屬于禾本科狼尾草屬多年生植物，為典型的碳四植物，其分蘗速度快、根系發(fā)達(dá)、生物量大、營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好、內(nèi)生菌豐富[1-2].因此，巨菌草不僅被廣泛應(yīng)用于栽培食藥用菌，制作青貯飼料、微生物菌肥，還被用于發(fā)電、崩崗和沙漠生態(tài)環(huán)境治理、生產(chǎn)沼氣和乙醇及造紙等領(lǐng)域[3].

玉蜀黍平臍蠕孢(Bipolarismaydis)是玉米小斑病的致病菌，會(huì)對(duì)玉米生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[4].近年來(lái)，玉米小斑病在我國(guó)大部分地區(qū)均有發(fā)生，輕則降低千粒重，重則導(dǎo)致果穗腐爛、種子發(fā)黑、發(fā)芽率降低，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-6].目前，對(duì)玉米小斑病的防治主要采用化學(xué)藥劑和選育抗病品種等手段，但病原菌容易產(chǎn)生變異，防治效果不理想[4].為了解決糧食生產(chǎn)和環(huán)境安全問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，采用內(nèi)生菌拮抗玉蜀黍平臍蠕孢成為防治玉米小斑病的一個(gè)重要研究方向.內(nèi)生菌可以作為生防菌，防治多種病害，植物內(nèi)生真菌的防病作用機(jī)制主要包括分泌抗菌物質(zhì)、與病原物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位、誘導(dǎo)植物抗性等.

本課題組前期已證實(shí)巨菌草內(nèi)生鏈霉菌(Streptomycessp.)對(duì)玉蜀黍平臍蠕孢有較好的拮抗作用[7]，但具體的作用機(jī)制尚不明確.因此，本研究采用RNA-seq對(duì)玉蜀黍平臍蠕孢在鏈霉菌發(fā)酵液脅迫和無(wú)發(fā)酵液條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，對(duì)表達(dá)差異基因進(jìn)行Gene Ontology(簡(jiǎn)稱GO)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，結(jié)合表達(dá)量和表達(dá)倍數(shù)的差異以及關(guān)鍵途徑，挖掘關(guān)鍵基因，分析巨菌草內(nèi)生鏈霉菌拮抗玉蜀黍平臍蠕孢的機(jī)制，為今后玉米小斑病的生物防治奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為巨菌草內(nèi)生鏈霉菌的抗菌機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

巨菌草內(nèi)生鏈霉菌由福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心從巨菌草健康葉片中分離保存，采用改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)5 d.

玉蜀黍平臍蠕孢由福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心分離保存，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)3 d.

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液的制備 將內(nèi)生鏈霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖水(PDB)培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)5 d.使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液，旋轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)每次添加發(fā)酵液約瓶容積的1/3，壓強(qiáng)0.09 MPa，溫度55 ℃，將內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液300 mL減壓蒸餾濃縮至10 mL.用0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾消毒，4 ℃冰箱避光保存.

1.2.2 內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液脅迫處理 將病原菌接種于100 mL PDB培養(yǎng)基中，每瓶加入2 mL滅菌的鏈霉菌發(fā)酵液(S組).以沒(méi)加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對(duì)照(CK組)，每組3個(gè)重復(fù).28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)3 d.無(wú)菌條件下收集菌絲后立刻采用液氮速凍，后保存于-80 ℃冰箱.

1.2.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 使用Omege soil RNA Kit提取總RNA，分別通過(guò)Nanodrop和Agilent 2100檢測(cè)RNA純度(D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm)及RNA片段長(zhǎng)度.RNA樣品檢測(cè)合格后用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，隨后以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA.

1.2.4 cDNA文庫(kù)構(gòu)建 利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA，然后進(jìn)行末端修復(fù)、加A、加接頭.再通過(guò)AMPure XP beads選擇雙鏈cDNA片段大小，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增以構(gòu)建cDNA文庫(kù).每個(gè)處理取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的RNA樣品進(jìn)行混合，用于RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.

1.2.5 測(cè)序片段的組裝與功能注釋 利用Illumina HiSeq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.下機(jī)數(shù)據(jù)(raw data)一般含有少量低質(zhì)量的reads，會(huì)對(duì)后面分析造成影響，所以去除帶有測(cè)序接頭(adapter)、N(不確定堿基)含量≥10%和低質(zhì)量堿基(Q≤20)含量大于50%的reads.用Tophat2軟件比對(duì)測(cè)序序列和轉(zhuǎn)錄組參考序列，隨后利用Cufflinks軟件組裝比對(duì)結(jié)果[8]，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行RNA-Seq相關(guān)性檢查.采用HTSeq軟件分析各樣品的基因表達(dá)水平(以FPKM=1作為判斷基因是否表達(dá)的閾值，只分析FPKM>1的基因)，并使用DESeq分析差異表達(dá)基因(差異基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)為q<0.05)[9-10].通過(guò)GOseq軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，將測(cè)序結(jié)果與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以分析其Pathway顯著性，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和分類[11].

1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證 通過(guò)兩個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)定與KEGG通路查找，隨機(jī)分析氨基酸生物合成、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路中5個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)情況，利用相對(duì)定量qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果.用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物(引物見(jiàn)表1).將各RNA樣品采用第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板、18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用全式金公司的SYBR Green RT-PCR試劑盒，通過(guò)CFX ConnectTMOptics module qPCR系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)對(duì)各基因進(jìn)行熒光定量檢測(cè).反應(yīng)體系為20 μL：正、反引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，2×TaqRT-PCRMix 10 μL，ddH2O 8 μL.擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃最終延伸5 min.各樣品中每個(gè)基因重復(fù)3次.按2-ΔΔCt定量計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[12].

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物Table 1 Primers used in real-time quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序共測(cè)得133 060 305個(gè)raw read pairs，經(jīng)過(guò)質(zhì)控，得到128 613 786個(gè)clean read pairs.從12個(gè)樣本中均獲得了至少2.8 G容量的原始數(shù)據(jù)，堿基GC含量都在54%左右，錯(cuò)誤率指標(biāo)Q20和Q30分別在95%和90%以上(表2).這說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲數(shù)據(jù)的質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析.

表2 兩組樣品測(cè)序數(shù)據(jù)及質(zhì)量檢驗(yàn)1)Table 2 Sequencing data and quality test of 2 groups of samples

樣品之間表達(dá)模式的相似度越高，相關(guān)系數(shù)(R2)就越接近1.由表3看出，CK與S間的相關(guān)系數(shù)在0.974左右，說(shuō)明結(jié)果可靠且樣本選擇合理.

表3 兩組樣品間的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients between 2 groups of samples

將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與選擇的參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如表4所示.兩組樣品轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的序列，能定位到基因組上的序列片段有200 121 858 bp，占比76.81%～78.93%；參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的序列片段有6 691 576 bp，占比2.39%～2.92%；參考序列上有唯一比對(duì)位置的序列片段有193 430 282 bp，占比74.08%～76.53%；比對(duì)到基因組上正鏈和負(fù)鏈的序列片段均有96 715 141 bp，占比均為37.04%～38.27%.能定位到基因組上的序列片段中，分段比對(duì)到兩個(gè)外顯子上的序列片段有36 371 164 bp，占比13.90%～14.42%；整段比對(duì)到外顯子上的序列片段有157 059 118 bp，占比60.08%～62.12%.結(jié)果說(shuō)明所選取的參考基因組合適.

表4 測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)Table 4 Comparison on sequencing data and reference genome

2.2 差異表達(dá)基因篩選

S組和CK組比較，共篩選出4 559個(gè)差異表達(dá)基因.其中，S組相對(duì)于CK組上調(diào)基因2 276個(gè)(圖1)，占總差異表達(dá)基因數(shù)的49.9%；下調(diào)基因2 283個(gè)，占總差異表達(dá)基因數(shù)的50.1%.上調(diào)基因和下調(diào)基因數(shù)量相當(dāng)，說(shuō)明內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液對(duì)玉蜀黍平臍蠕孢相關(guān)基因表達(dá)有顯著的影響.

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano diagram of differentially expressed genes

2.3 差異表達(dá)基因功能注釋

2.3.1 GO富集分析 結(jié)果顯示，共有2 605個(gè)差異表達(dá)基因被富集到1 976個(gè)GO term.對(duì)富集最顯著的30個(gè)GO term作圖(圖2)，可以看出在細(xì)胞組分(cellular component)類別中，富集到細(xì)胞(cell)、細(xì)胞內(nèi)部分(cell part)、細(xì)胞成分組織 (cellular component organization)等的差異表達(dá)基因較多；生物過(guò)程(biological process)類別中，富集到細(xì)胞蛋白代謝(cellular protein metabolic process)、細(xì)胞通訊(cell communication)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)等的差異基因較多；分子功能(molecular function)類別中，富集到核酸結(jié)合(nucleic acid binding)、核苷酸結(jié)合(nucleotide binding)、基質(zhì)特異性透膜運(yùn)輸活性(substrate specific transmembrane transporter activity)、底物特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(substrate specific transporter activity)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(transmembrane transporter activity)等的差異基因較多.

*代表顯著富集的GO.圖2 差異基因的GO富集柱狀圖Fig.2 GO functional classification of differentially expressed genes

2.3.2 KEGG富集分析 玉蜀黍平臍蠕孢CK組和S組差異表達(dá)基因中共有456個(gè)基因被注釋到105條KEGG代謝通路中.圖3顯示了20條富集最顯著的通路，主要是次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)，氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)，酵母促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)途徑(MAPK signaling pathway-yeast)，抗生素的生物合成(biosynthesis of antibiotics)，嘌呤代謝(purine metabolism)，氨酰-tRNA的生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(RNA transport)，賴氨酸的生物合成(lysine biosynthesis)，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)，內(nèi)吞作用(endocytosis)，維生素B6代謝(vitamin B6 metabolism)等.這些通路大多與玉蜀黍平臍蠕孢生長(zhǎng)代謝及其對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)相關(guān).

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG功能歸類Fig.3 KEGG functional classification of differentially expressed genes

2.4 關(guān)鍵基因的確定及其功能描述

在差異表達(dá)基因中，選擇表達(dá)量高且表達(dá)倍數(shù)差異顯著的基因(read count>20，至少在一個(gè)樣品中FPKM≥50)，結(jié)合代謝通路，確定了22個(gè)擬關(guān)鍵基因(表5)，絕大部分為假定蛋白，主要涉及多個(gè)氨基酸的生物合成和代謝.8個(gè)涉及氨基酸的合成和降解(其中僅有1個(gè)基因表達(dá)下調(diào))，6個(gè)涉及抗生素的合成；gene9313和gene5020涉及RNA運(yùn)輸，gene1147則與氨酰-tRNA的合成有關(guān)；下調(diào)表達(dá)的關(guān)鍵基因主要編碼糖苷水解酶與糖基轉(zhuǎn)移酶.此外，本研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)未被注釋到的新基因，編號(hào)為Novel00002，其read count在S組中達(dá)20 981個(gè)，為對(duì)照組的8.55倍，推測(cè)其在玉蜀黍平臍蠕孢響應(yīng)內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液中具有重要的作用，值得更深入的研究.

表5 關(guān)鍵基因功能歸類Table 5 Function classification of key genes

2.5 差異表達(dá)基因的qRCR驗(yàn)證

由圖4可以看出，5個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)盡管有些差異，但qPCR檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組統(tǒng)計(jì)結(jié)果基本一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)較為可靠.

圖4 5個(gè)差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證Fig.4 qPCR verification of 5 differentially expressed genes

3 討論

鏈霉菌屬能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，抑制植物多種病原真菌，在植物病害的生物防治中發(fā)揮著積極的作用[13-14].本研究對(duì)玉米小斑病病原菌玉蜀黍平臍蠕孢在巨菌草內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液脅迫和無(wú)發(fā)酵液條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)4 559個(gè)差異表達(dá)的基因，其中試驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)基因2 276個(gè)，下調(diào)基因2 283個(gè)，差異表達(dá)基因大部分涉及氨基酸生物合成、酵母MAPK信號(hào)通路、嘌呤代謝等通路，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、細(xì)胞交流等生物過(guò)程相關(guān).在GO富集中，富集到細(xì)胞組分的差異基因數(shù)量明顯多于富集到生物過(guò)程和分子功能的數(shù)量，這表明巨菌草內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液對(duì)玉蜀黍平臍蠕孢細(xì)胞相關(guān)基因的影響較大.有研究發(fā)現(xiàn)，青霉TS67菌株的發(fā)酵液和蒼白桿菌屬細(xì)菌YB01的培養(yǎng)液通過(guò)影響細(xì)胞壁、濃縮原生質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)抑制玉蜀黍平臍蠕孢菌的生長(zhǎng)[15-16]；鏈霉菌屬StreptomycesphilanthiRM-1-13產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠通過(guò)破壞立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)PTRRC-9的細(xì)胞壁達(dá)到抑菌效果[17].本試驗(yàn)中，巨菌草內(nèi)生鏈霉菌菌株也可能存在相似的作用機(jī)理.

蛋白質(zhì)是組成生命體的重要成分，是維持機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)，而氨基酸是大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，又是許多重要代謝途徑的重要中間體，機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的需求本質(zhì)上是對(duì)氨基酸的需求[18-19].鏈霉菌屬是產(chǎn)抗生素的最大一類屬[20]，Svidritskiy et al[21]從產(chǎn)色鏈霉菌(S.griseochromogenes)培養(yǎng)液中提取的抗生素能夠作用于稻瘟菌的核糖體，干擾核糖體肽鍵的形成，使稻瘟菌的蛋白質(zhì)合成受阻，從而抑制稻瘟菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng).本研究中，在氨基酸生物合成通路中82個(gè)基因?qū)Πl(fā)酵液脅迫具有響應(yīng)，占比69.5%，其中78個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，僅4個(gè)下調(diào)表達(dá)；挑選出的22個(gè)擬關(guān)鍵基因中，上調(diào)表達(dá)的關(guān)鍵基因主要涉及多種氨基酸的生物合成與代謝，而下調(diào)表達(dá)的關(guān)鍵基因主要編碼糖苷水解酶蛋白家族和糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白家族.糖基轉(zhuǎn)移酶的主要功能是催化生物體內(nèi)的活性糖與不同受體連接，以形成各種生物學(xué)功能的糖基化產(chǎn)物[22].由此推測(cè)玉蜀黍平臍蠕孢可能通過(guò)激活氨基酸生物合成途徑相關(guān)基因和減少糖苷分解的方式來(lái)響應(yīng)內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液的脅迫，同時(shí)，內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液可能通過(guò)干擾玉蜀黍平臍蠕孢的氨基酸合成而實(shí)現(xiàn)抑制作用.有學(xué)者認(rèn)為，低濃度抗真菌活性物質(zhì)會(huì)引起病原真菌的代償性應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路基因緩解外源物對(duì)自身的毒害[23].本研究結(jié)果顯示，氨基酸相關(guān)通路的基因絕大部分表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明玉蜀黍平臍蠕孢也存在代償性應(yīng)激反應(yīng).

MAPK信號(hào)通路中有43個(gè)基因?qū)Πl(fā)酵液脅迫具有響應(yīng)，占比75.4%，其中37個(gè)下調(diào)表達(dá)，僅6個(gè)上調(diào)表達(dá)，這說(shuō)明內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液對(duì)玉蜀黍平臍蠕孢M(jìn)APK信號(hào)通路的影響較大.MAPK級(jí)聯(lián)途徑是真核生物中普遍存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式，可參與調(diào)控真菌的菌絲生長(zhǎng)和致病性等多種生命過(guò)程，并在不同的過(guò)程中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[24].本課題組前期證實(shí)巨菌草內(nèi)生鏈霉菌菌株的發(fā)酵液能夠有效抑制玉蜀黍平臍蠕孢的菌絲生長(zhǎng)[7]，因此，推測(cè)內(nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)而抑制菌絲生長(zhǎng).

從研究結(jié)果來(lái)看，玉蜀黍平臍蠕孢眾多基因?qū)?nèi)生鏈霉菌發(fā)酵液的脅迫有不同程度的響應(yīng)，說(shuō)明不同基因?qū)γ{迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)方式不同，但關(guān)鍵基因涉及的途徑或功能相對(duì)集中.今后可從發(fā)酵產(chǎn)物的分離鑒定，發(fā)酵液脅迫對(duì)病原菌形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，關(guān)鍵基因全長(zhǎng)克隆和功能驗(yàn)證等方面進(jìn)行更深入的研究.