尹春蕾，王 楠，馬瑩瑩，賈乘一，張 倩，李麗娟

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)瀾湄人類健康研究中心，云南大理 671000）

美洲大蠊Periplaneta americana（L.），俗稱蟑螂，其提取物具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、保肝、促進(jìn)組織修復(fù)，如血管再生和創(chuàng)面愈合等藥理作用〔1-2〕。有實(shí)驗(yàn)表明美洲大蠊對(duì)小鼠的腹瀉有抑制作用〔3〕，提示美洲大蠊可能對(duì)小鼠的腸道菌群起到改善作用。人類腸道菌群中存在著大量的微生物和寄生蟲，健康的菌群環(huán)境有利于維持機(jī)體功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)〔4〕。2008年Romijn等〔5〕提出腦-腸軸這一雙向調(diào)節(jié)軸概念，并有研究證明腦-腸軸的功能紊亂對(duì)人類的健康會(huì)產(chǎn)生很大的影響，對(duì)于精神疾病患者，腦-腸軸調(diào)節(jié)在其病程中發(fā)揮著一定的作用〔6〕。本文以精神疾病患者為研究對(duì)象，通過觀察美洲大蠊提取物對(duì)精神疾病患者發(fā)作期與控制期腸道菌群影響的差異，探索美洲大蠊提取物對(duì)其腸道菌群環(huán)境是否有影響，對(duì)美洲大蠊可能的適應(yīng)證領(lǐng)域進(jìn)行初步探索。

1 材料和方法

1.1 藥品美洲大蠊提取物為云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)編號(hào)：PKA，棕褐色液體，-20 ℃保存。

1.2 試劑與儀器大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）；肉膏酵母葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，含氯霉素）；磷酸鹽緩沖液（PBS）等。超凈工作臺(tái)；電子天平；分析天平；恒溫培養(yǎng)箱；快速全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器；厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)；低溫冰箱（BCD-226ST C,海爾公司）；培養(yǎng)皿；三角瓶；酒精燈；pH試紙；立式超低溫保存箱（DW-86L386,海爾公司）。

1.3 方法

1.3.1 采樣 2018年6月至8月在大理州第二人民醫(yī)院選取19例新住院的精神疾病患者作為研究對(duì)象，包括精神分裂癥（schizophrenia，SCH）和雙相情感障礙（bipolar affective disorder，BPD）兩類患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》（第5版）〔7〕SCH和BPD診斷標(biāo)準(zhǔn)，由兩名精神科醫(yī)生共同認(rèn)定確診，且入院1個(gè)月前均無用藥史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并高血壓、糖尿病、心臟病、胃腸道疾病等其他系統(tǒng)性疾病。對(duì)患者發(fā)作期和控制期的糞便分別進(jìn)行采樣，其中將發(fā)作期的樣本分為空白組和實(shí)驗(yàn)組（向樣本中加入美洲大蠊提取物），控制期為陽性組（臨床用藥）。

1.3.2 微生物共培養(yǎng) 用滅菌棉簽取200 mg新鮮糞便于EP管中，加入1.8 mL滅菌的PBS，立即將EP管封口，在振蕩器上振蕩5 min，使糞便均質(zhì)化，此為初始濃度儲(chǔ)備液。在初始濃度儲(chǔ)備液里吸取200 μL溶液，放入含有1.8 mL滅菌的PBS的EP管中，振蕩均勻，此為10-1濃度溶液。依次類推，按同樣的稀釋方法將上述振蕩好的標(biāo)本進(jìn)行10 倍稀釋至10-8濃度溶液。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇3~4個(gè)適合的稀釋度，分別取100 μL于各選擇性培養(yǎng)基上，用簡單涂板法均勻涂布后培養(yǎng)，每個(gè)稀釋度均設(shè)3個(gè)重復(fù)。待菌落長出后，以菌落形態(tài)、生化反應(yīng)鑒定所需目的菌，對(duì)各培養(yǎng)基上的菌落數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。培養(yǎng)條件及鑒定方法見表1。

表1 3類微生物的培養(yǎng)條件及菌落計(jì)數(shù)方法

1.3.3 菌落計(jì)數(shù) 培養(yǎng)好的菌落經(jīng)鑒定后計(jì)算糞便中菌落數(shù)量（CFU/g）。需氧菌、厭氧菌的培養(yǎng)選擇菌落數(shù)范圍在30~300個(gè)菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，真菌的培養(yǎng)選擇菌落數(shù)范圍在10~150個(gè)菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。選擇在菌落數(shù)范圍內(nèi)的稀釋度溶液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，按下式計(jì)算出同一稀釋度溶液的平均菌落數(shù)（X）。標(biāo)本菌落數(shù)量（CFU/g）=（10X×稀釋倍數(shù)）/標(biāo)本質(zhì)量（g）。結(jié)果用lg（CFU/g）表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS 23.0 和 Excel 2003 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各檢測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)量資料用表示。各組數(shù)據(jù)比較依據(jù)資料的性質(zhì)，對(duì)符合正態(tài)方差齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對(duì)不符合正態(tài)方差齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌落計(jì)數(shù)

2.1.1 不考慮人口特征對(duì)菌落計(jì)數(shù)的影響 在不考慮人口特征的情況下，需氧菌空白組的菌落數(shù)為（8.39±1.06） CFU/g，實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)為（10.18±0.80）CFU/g，陽性組的菌落數(shù)為（9.77±0.76）CFU/g；厭氧菌空白組的菌落數(shù)為（8.83±0.86）CFU/g，實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)為（10.62±0.39）CFU/g，陽性組的菌落數(shù)為（10.30±0.38）CFU/g；真菌空白組的菌落數(shù)為（4.41±0.92）CFU/g，實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)為（6.48±0.80）CFU/g，陽性組的菌落數(shù)為（6.16±0.80）CFU/g。

2.1.2 不同人口特征對(duì)菌落計(jì)數(shù)的影響 按照性別、疾病分期和疾病類型將19例患者進(jìn)行分類，對(duì)需氧菌、厭氧菌和真菌的不同組別分別計(jì)數(shù)。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見表2。

表2 不同人口特征分組中菌落計(jì)數(shù)結(jié)果（）

表2 不同人口特征分組中菌落計(jì)數(shù)結(jié)果（）

分組性別 疾病分期 疾病類型男性（n=14） 女性（n=5） 首發(fā)（n=10） 再發(fā)（n=9） BPD（n=10） SCH（n=9）需氧菌空白組 8.30±0.91 8.66±1.50 8.60±0.90 8.17±1.23 8.59±1.15 8.04±1.10需氧菌實(shí)驗(yàn)組 10.04±0.82 10.57±0.62 10.22±0.64 10.14±0.98 10.34±0.72 9.92±1.06需氧菌陽性組 9.66±0.79 10.10±0.61 9.88±0.64 9.65±0.89 9.91±0.66 9.50±1.02厭氧菌空白組 8.97±0.79 8.46±1.01 8.87±0.75 8.79±1.01 8.95±0.86 8.85±0.86厭氧菌實(shí)驗(yàn)組 9.89±1.08 10.60±0.38 10.62±0.32 10.63±0.47 10.69±0.28 10.46±0.45厭氧菌陽性組 10.63±0.41 10.44±0.36 10.26±0.37 10.34±0.39 10.32±0.38 10.24±0.44真菌空白組 4.61±0.91 3.83±0.75 4.14±0.76 4.70±1.04 4.41±0.98 4.45±0.96真菌實(shí)驗(yàn)組 6.59±0.83 6.16±0.67 6.45±0.46 6.51±1.09 6.60±0.63 6.56±1.00真菌陽性組 6.23±0.86 5.98±0.66 6.06±0.63 6.28±0.98 6.29±0.54 6.17±1.12

2.2 3類微生物樣本菌落數(shù)兩兩比較差異在不考慮人口特征分組的情況下，3類菌群的3組樣本菌落數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F需氧菌=21.463，F(xiàn)厭氧菌=38.803，F(xiàn)真菌=33.384；P均為0.000）。對(duì)各類菌群的3組樣本菌落數(shù)差異進(jìn)行兩兩比較，3類菌群空白組與實(shí)驗(yàn)組，空白組與陽性組的菌落數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均為0.000）；需氧菌實(shí)驗(yàn)組與陽性組菌落數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.478），厭氧菌實(shí)驗(yàn)組與陽性組菌落數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.267），真菌實(shí)驗(yàn)組與陽性組菌落數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.767）。

在考慮性別、疾病分期和疾病類型人口特征分組下，3類菌群的3種樣本菌落數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。進(jìn)一步對(duì)各樣本菌落數(shù)的兩兩比較顯示3類菌群空白組與實(shí)驗(yàn)組、空白組與陽性組（除女性和SCH特征的需氧菌組）的菌落數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組與陽性組的菌落數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

表3 3類菌群的3種樣本菌落數(shù)在不同人口特征下的差異分析

表4 3類菌群的3種樣本在不同人口特征分組下兩兩比較的差異分析

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知3類菌群的3種樣本在不分組和分組情況下其空白組與實(shí)驗(yàn)組、空白組與陽性組的絕大部分菌落數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組與陽性組的菌落數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可認(rèn)為美洲大蠊提取物對(duì)病患腸道菌群有明顯的影響。由表4可知，女性和SCH特征中需氧菌空白組和陽性組的菌落數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這可能與病患治療過程中的用藥劑量、實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組的藥物劑量有所不同和用藥時(shí)長不同有關(guān)。

3.2 腦-腸軸雙向調(diào)節(jié)目前在精神疾病的發(fā)病機(jī)制研究中更多的學(xué)者偏向腸道菌群對(duì)精神疾病的影響。有研究表明腸道菌群可以通過腦-腸軸這一雙相調(diào)節(jié)軸對(duì)精神疾病進(jìn)行調(diào)控，當(dāng)其失調(diào)時(shí)會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)而造成多種精神疾病的發(fā)生〔7-8〕。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知空白組、實(shí)驗(yàn)組與陽性組分別對(duì)比后體現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異說明美洲大蠊提取物對(duì)精神疾病患者的腸道菌群起到了調(diào)節(jié)的作用，而且精神疾病患者本身癥狀的緩解也會(huì)使其腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這個(gè)結(jié)果在一定程度上驗(yàn)證了精神疾病患者的腦-腸軸的互相調(diào)節(jié)功能〔9〕。合理解釋了抗精神病藥物治療后會(huì)對(duì)患者的腸道微生物菌群種類和數(shù)量發(fā)生改變的現(xiàn)象〔10〕。

3.3 藥理作用和疾病治療精神藥物的使用會(huì)造成患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常、流涎、高泌乳素血癥、體溫調(diào)節(jié)障礙以及胃腸功能失調(diào)等副作用〔11〕。從莊紅艷等〔12〕對(duì)精神藥物不良反應(yīng)的調(diào)查分析中可知消化系統(tǒng)的不良反應(yīng)最常見。有實(shí)驗(yàn)證明美洲大蠊提取物對(duì)小鼠的免疫功能有修復(fù)作用，并且不會(huì)損傷其正常的免疫功能〔13〕。根據(jù)美洲大蠊提取物具有調(diào)節(jié)免疫的藥理作用、免疫異常是SCH的病因假說之一、腦-腸軸雙向調(diào)控這三點(diǎn)依據(jù)，可以推測(cè)：在這兩類精神疾病治療中，使用美洲大蠊提取物來源的相關(guān)藥物和常規(guī)治療藥物聯(lián)合使用，可以通過改善人體的免疫功能和腸道菌群的狀態(tài)來治療精神疾病，同時(shí)改善患者的消化系統(tǒng)不良反應(yīng)。

本文僅為美洲大蠊提取物對(duì)精神疾病患者腸道菌群的影響進(jìn)行初探，是對(duì)腸道菌群的整體研究，其具體作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待下一步研究說明。