李 捷，陳依春，李舉發(fā)，陳臨濤，王嘉喆，姜伊娜，張斌濤

（1.西藏民族大學醫(yī)學院，陜西咸陽 712082；2.陜西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，陜西咸陽 712046；3.咸陽市中心醫(yī)院麻醉手術部，陜西咸陽 712000）

肝硬化是一種或多種慢性肝病長期反復發(fā)展,導致肝臟炎癥、持續(xù)纖維化、假小葉、再生結節(jié)以及血管增殖為主要病理特征，并且持續(xù)惡化而形成的一種疾病〔1-2〕，該病早期需及時有效地控制，否則容易引發(fā)肝腹水和肝癌，嚴重者將威脅患者生命〔3〕。

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）又稱“蟲草”，生于蟲草蝙蝠蛾等的幼蟲體上，主要分布于我國西藏、青海、四川、云南、甘肅等海拔4 000 m以上的高山灌叢和高寒草甸等地，是我國重要的名貴藥材之一。有研究顯示，冬蟲夏草對肝纖維化、肝硬化等不同程度肝損傷具有明確的治療作用，但其治療肝硬化具體的物質基礎和作用機制尚不明確〔4-5〕。

網絡藥理學是在計算機網絡迅速發(fā)展的背景下，基于系統(tǒng)生物學理論，對藥物多成分作用靶點以及疾病靶點間相互關系構建藥物-靶點-疾病網絡，進行系統(tǒng)的網絡分析，進而對藥物作用的機制和物質基礎進行預測的一種現代化研究手段〔6-7〕。本研究運用該方法篩選冬蟲夏草治療肝硬化作用靶點及活性成分，建立成分-靶點網絡、蛋白相互作用網絡（PPI），分析冬蟲夏草治療肝硬化的作用機制和相關物質基礎。

1 方法

1.1 數據建立在TCMSP數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“冬蟲夏草”為關鍵詞，檢索該藥物的化學成分，以類藥性（DL）≥0.14，口服生物利用度（OB）≥30%為篩選條件，通過篩選，收集化學成分及對應靶點信息。將查找條件設置為“Homo Sapiens”“Reviewed”靶基因，利用Uniprot數據庫（http://www.uniprot.org/）進行規(guī)范化處理；將疾病靶點查找條件設置為“l(fā)iver cirrhosis”，通過GeneCards數據庫（https://www.genecards.org）進行檢索。

1.2 網絡的構建利用上述各檢索結果，將所得疾病與成分間靶點進行映射，獲取冬蟲夏草治療肝硬化作用靶點，通過Cytoscape 3.2.1軟件構建成分-靶點相關網絡。為進一步獲取關鍵靶點，將篩選出的交集蛋白信息輸入STRING數據庫，蛋白相互作用信息選取置信度≥0.9，并剔除游離點，將篩選數據導入Cytoscape 3.2.1軟件，通過計算匯總，構建PPI。

1.3 GO功能和KEGG通路富集分析本研究通過DAVID 6.8數據庫對靶蛋白進行GO功能和KEGG通路富集分析，在PPI網絡中說明靶蛋白在通路和基因功能中的相關作用。

2 結果

2.1 冬蟲夏草主要活性成分篩選通過TCMSP數據庫篩選出冬蟲夏草化學成分共12個，將無靶點成分去除，共得到6個活性成分。見表1。

表1 冬蟲夏草活性成分參數

2.2 構建冬蟲夏草活性成分治療肝硬化的成分-靶點網絡圖進一步對冬蟲夏草活性成分進行靶點檢索，共獲得87個對應靶點，GeneCards數據庫獲得肝硬化相關的靶點4 350個。二者映射后獲得冬蟲夏草治療肝硬化相關靶點56個，分別為HTR2A、ALDH3A1、ALDH2、ADRA1B、ADRA2A、MAOB、BAX、BCL2、ALOX5、ABCA1、ADRB2、GLB1、CASP3、CASP8、CASP9、CDK4、CETP、F7、F10、COL1A2、C1R、PLA2G4A、DRD1、CCND1、GABRA1、GABRA2、GABRA6、G6PD、IGHG1、UCP2、MAPK1、PRKACA、ABCC4、CHRM3、OPRM1、NOS2、PPARG、PTEN、PIK3CG、PECAM1、EGF、PGR、PTGS1、PTGS2、PRKCA、SELP、RXRA、RXRB、PON1、SLC6A3、SLC6A4、JUN、TGFB1、TRPM5、TNFRSF1A和TNFRSF1B。

2.3 成分-靶點網絡構建將冬蟲夏草治療肝硬化的56個靶點數據及6個活性成分導入Cytoscape 3.2.1軟件，構建成分-靶點網絡圖，圖中清晰直觀地呈現疾病靶點與藥物成分之間的網絡關系，其中，深色圓圈代表化合物，淺色圓圈代表靶點。見圖1。

圖1 冬蟲夏草治療肝硬化的成分-靶點網絡圖

2.4 成分-靶點網絡拓撲結構分析成分-靶點網絡分析結果顯示，圖中可見62個節(jié)點，形成82個關系對?！白杂啥取贝韴D中某一節(jié)點直接作用的節(jié)點數，值的大小說明該節(jié)點在網絡中的重要性。本研究中，成分-靶點網絡平均自由度為2.65，這表明冬蟲夏草成分中存在成分與靶點間相互作用的情況。成分-靶點網絡拓撲結果分析顯示，6個活性成分的靶點數在均值以上，其中自由度≥11 的活性成分共3個，分別是花生四烯酸、十八烯酸、β-谷甾醇，由此表明，這些活性成分均能通過作用于多個靶點而對疾病產生治療作用；自由度≥3 的靶點有 RXRA、PTGS2、PTGS1 ，存在于多個活性成分中，這說明冬蟲夏草成分-靶點間存在著復雜的作用關系。見表2。

表2 網絡拓撲分析

2.5 PPI的構建與分析將STRING數據庫分析結果，導入 Cytospase 3.2.1軟件，可得到由45個靶點組成的59個蛋白相互作用關系圖。同時根據節(jié)點的“自由度”設置顏色，顏色越深代表“自由度”越大。結果表明，關鍵蛋白涉及MAPK1、RXRA、CASP8、RXRB、PPARG、BCL2、JUN、PRKCA等，即藥物治療肝硬化，通過這些關鍵蛋白與多個蛋白的相互作用，從而達到治療效果。見圖2。

圖2 相關靶點PPI圖

2.6 GO 功能富集分析GO 功能富集分析是通過生物過程、分子功能和細胞組成對基因進行富集分析，共得到23個條目（FDR<0.01）。見表3。生物過程主要包括藥物反應，雌二醇反應、脂多糖反應以及老化過程的調節(jié)；細胞組成主要影響細胞膜、細胞質等；分子功能主要涉及蛋白同源二聚化、酶結合和藥物結合。根據FDR值由小至大排序，列出前20個GO功能條目。見圖3。

圖3 PPI網絡中靶點的GO富集情況圖（FDR排名前20）

表3 PPI網絡中靶點的GO功能條目（FDR < 0.01）

2.7 KEGG通路富集分析本研究通過DAVID 6.8數據庫，對56個靶點進行KEGG通路富集分析，來分析冬蟲夏草治療肝硬化相關靶點在信號通路中的作用，共得到44條信號通路（P< 0.01），按照FDR由小到大排列，見表4。其中10條直接與肝硬化相關，分別是含血清素的神經突觸、細胞凋亡、p53信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、黏著斑激酶、MAPK信號通路、FoxO信號通路及HIF-1信號通路等 。采用E Chart（http://www.ehbio.com/ImageGP/）對通路富集情況進行可視化處理，結果見圖4。

圖4 KEGG通路富集分析

表4 冬蟲夏草治療肝硬化相關通路（P < 0.01）

3 討論

肝硬化是肝臟疾病長期持續(xù)受損的一種終末臨床期表現，在非傳染性疾病中，晚期肝硬化已成為威脅生命的重要疾病〔8〕。目前治療肝硬化臨床常用藥物主要有抗病毒保肝類藥物、保鉀排鉀利尿類藥物等〔9-11〕，這些藥物只能在一定程度上緩解肝功能失代償，但副作用較大，因此開發(fā)有效治療肝硬化藥物迫在眉睫。本研究結合網絡藥理學對特色藏藥冬蟲夏草治療肝硬化的有效成分及作用靶點進行初步分析，以期為臨床研究提供思路。

本研究從網絡藥理學思路出發(fā)，通過在線數據庫共篩選出6個活性成分，其中，花生四烯酸、十八烯酸、β-谷甾醇等是冬蟲夏草發(fā)揮藥效的主要成分?；ㄉ南┧崾且环N不飽和脂肪酸，也是人體內主要的脂肪酸，具有抗炎和提高免疫的作用〔12〕。十八烯酸為不飽和脂肪酸，分離于貓兒眼塊莖中，具有抑制腫瘤生長的作用〔13〕。β-谷甾醇是幾種廣泛研究的植物甾醇類之一，具有降低血清膽固醇代謝作用〔14〕。有研究發(fā)現，β-谷甾醇可通過誘導腫瘤細胞凋亡，從而顯著降低細胞活力〔15〕。這些成分可能是肝細胞生長因子抵御腫瘤侵襲抗肝癌作用的主要成分〔16〕,從而有效降低肝硬化向肝癌的轉變概率。結合成分靶點、疾病靶點相關數據庫，篩選出56個藥物治療肝硬化的相關靶點，包括PTGS1、PTGS2、RXRA、ADRB2等主要靶點，其中PTGS1和PTGS2即環(huán)氧合酶1（COX1）和環(huán)氧合酶2（COX2），它們在炎癥反應中發(fā)揮著重要作用。PPI網絡拓撲分析表明，MAPK1、RXRA是冬蟲夏草治療肝硬化的潛在靶蛋白，這些靶蛋白主要參與炎癥反應、細胞周期及信號傳導等過程〔17〕。

GO功能分析表明，冬蟲夏草治療肝硬化相關靶點主要富集在藥物反應、脂多糖反應、血管生成、酶結合、細胞增殖正調控等過程。KEGG通路富集表明，這些靶點直接與肝病相關的通路有乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝病等。同時還與炎癥相關通路，如PI3K-Akt、MAPK、腫瘤壞死因子、HIF-1、FoxO、VEGF等信號通路相關聯，從而影響肝硬化的發(fā)生發(fā)展。

冬蟲夏草治療肝硬化的成分-靶點網絡以及GO、KEGG富集分析表明冬蟲夏草有效成分作用于多個靶點，主要通過影響多個生物過程以及信號通路間相互作用，從而起到治療肝硬化的作用。