王彥權，張鴻翰，呂 鴻，李彩琳，Najib Mohammerd，彭 芳，吳定宇

（1. 大理大學藥學院，云南大理 671000；2. 大理大學資產與實驗室管理處，云南大理 671000）

肝癌是世界上高發(fā)病率的腫瘤之一，據國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》，原發(fā)性肝癌是全球導致死亡的第二大癌癥，86%的肝癌發(fā)生于發(fā)展中國家，我國2018年肝癌死亡率占世界的46.71%，晚期肝癌患者的總體5年生存率低于10%〔1-2〕。肝癌患者對全身化療的腫瘤應答率低，容易誘導腫瘤細胞產生多藥耐藥性〔3〕。多藥耐藥性指腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，是導致腫瘤化學治療失敗的最重要原因，對肝癌的轉移和復發(fā)具有重要影響〔4〕。人體內一旦獲得了多藥耐藥性，化學治療藥物的抗腫瘤作用就會降低，而現(xiàn)有的抗晚期肝癌藥物大部分都容易產生多藥耐藥性作用〔5〕。索拉非尼是首個被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于治療人肝細胞癌（HCC）晚期的分子抑制劑，因為耐藥性的產生而使其在臨床上的應用受阻〔6〕。用于改善多藥耐藥的化學藥品種類較多，但往往只能針對其中的一種機制進行逆轉，逆轉效率不高，臨床應用受到限制。中草藥具有多靶點、多階段性作用的特點，可針對腫瘤多藥耐藥性的多種機制進行有效逆轉。本課題組在前期研究中構建了HepG2/ADM細胞株，在細胞凋亡實驗中證明了美洲大蠊粗提物脫脂膏和CⅡ-3的抗HCC作用〔7〕，并發(fā)現(xiàn)其對多藥耐藥性有一定的逆轉作用，主要是通過促進耐藥細胞株細胞凋亡，使P-gp mRNA表達量下降，抑制耐藥蛋白表達從而增加細胞內藥物聚集發(fā)揮作用。同時，我們明確了美洲大蠊中抗腫瘤活性成分主要為小分子肽類，并從中分離得到了一系列小肽，命名為PAE系列多肽，其中美洲大蠊多肽PAE2的抗腫瘤效果較好〔8〕。但是PAE2對HCC多藥耐藥的作用尚未見研究報道。

本研究以耐藥細胞株BEL-7402/5-FU為研究對象，使用美洲大蠊多肽PAE2進行體外干預，觀察PAE2是否具有抗HCC細胞多藥耐藥的作用。

1 材料

1.1 儀器CKX41SF型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；SN255939型酶標儀、核酸濃度分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；7500型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 藥品與試劑美洲大蠊多肽PAE2（純度98.06%）為實驗室制備；索拉非尼（批號：1017R021）及長春新堿（批號：070603C）均購于北京索萊寶科技有限公司；5-氟尿嘧啶（5-FU，批號：WXBC2167V）購于國藥集團化學試劑有限公司；阿霉素（批號：021411010）、噻唑藍溶液（MTT，批號：C0009-2）、PCR逆轉錄試劑盒（批號：070618190813）及PCR熒光試劑盒（批號：032919200421）均購于上海碧云天生物科技有限公司；環(huán)磷酰胺（批號：980910）購于中國食品藥品鑒定研究院；奧沙利鉑（批號：20090202）購于美國Target Mol公司；胎牛血清（FBS，批號：18050302）購于美國Gibco公司；RMPI 1640培養(yǎng)基（批號：8120199）、Trizol試劑（批號：15596-026）均購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 細胞HCC敏感細胞株BEL-7402（批號：MXC050）、耐5-FU HCC細胞株BEL-7402/5-FU（批號：MXC049）均購于上海美軒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥液的制備用超純水將5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺、奧沙利鉑5種抗腫瘤藥分別配制成1 mg/mL的藥物母液，美洲大蠊多肽PAE2溶液配制成50 mg/mL的母液，于4 ℃保存?zhèn)溆?，試驗時用RPMI 1640培養(yǎng)基等比例稀釋至試驗所需的不同濃度。

2.2 MTT法檢測細胞的多藥耐藥性取培養(yǎng)至對數生長期的BEL-7402細胞和BEL-7402/5-FU細胞，接種于96孔板上。按照MTT實驗操作，分別加入5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺、奧沙利鉑溶液，其中5-FU、長春新堿、環(huán)磷酰胺、奧沙利鉑的濃度為5、10、20、40、80 μg/mL，阿霉素的濃度為0.162 5、 0.375 0、0.750 0、1.500 0、3.000 0 μg/mL，并設置溶劑對照孔和空白對照孔（只含細胞，不加藥物），按以下公式計算藥物對細胞生存率和耐藥倍數（resistance index，RI）：細胞生存率 = （不同濃度藥物的OD值-溶劑對照孔的OD值）/（空白對照孔的OD值-溶劑對照孔的OD值）×100 %，RI=（BEL-7402/5-FU細胞株IC50）/（BEL-7402敏感細胞株IC50）。

2.3 MTT法檢測美洲大蠊多肽PAE2的細胞毒性作用將BEL-7402/5-FU細胞株接種于96孔板上，按照MTT實驗操作，各孔加入不同濃度的美洲大蠊多肽PAE2溶液，進行MTT檢測，確定美洲大蠊多肽PAE2發(fā)揮細胞毒性作用的藥物劑量區(qū)間和有效作用時間。選取IC20的美洲大蠊多肽PAE2進行藥物逆轉多藥耐藥試驗，計算細胞生存率和美洲大蠊多肽PAE2的逆轉指數（reversal factor ，RF）。RF =（PAE2處理后BEL-7402/5-FU細胞株IC50）/（未處理BEL-7402/5-FU細胞株IC50）。

2.4 熒光定量聚合酶鏈式反應（real time-polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測多藥耐藥相關蛋白mRNA的表達水平試驗設置6個試驗組，分別為敏感組、耐藥細胞組、索拉非尼（陽性藥物）對照組和美洲大蠊多肽PAE2低、中、高劑量組。在培養(yǎng)皿中對耐藥細胞進行接種與給藥培養(yǎng)。給藥結束后，每皿中加入Trizol試劑1 mL，冰浴放置5 min后，用細胞刮刀收集細胞至1.5 mL EP管中，按照Trizol法提取總RNA。用焦碳酸二乙醇水20～50 μL溶解RNA樣品，在核酸濃度分析儀上進行RNA濃度檢測。取總RNA按照逆轉錄反應體系逆轉錄成cDNA，反應條件為42 ℃，60 min；80 ℃，10 min。將cDNA 置于實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增反應。蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）上游序列為5′-CCCAAACATTGACAAATCCTAACC-3′，下游序列為5′-CAACCAAGGAGGGTACCAGATG-3′；DNA拓撲異構酶Ⅱ（topo-isomerase typeⅡ, TopoⅡ）上游序列 為5′-GAAACGGAATCCTTGGTCAGAT-3′，下游序列為5′-TTTCGGCTGCTGCTCTCCTA-3′；谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione S-transferase-π, GST-π）上游序列為5′-CTGGAAGGAGGAGGTGGTG-3′，下游序列為5′-GACGCAGGATGGTATTGGAC-3′；β-actin上游序列為5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游序列為5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。擴增條件為95 ℃ 2 min預變性，隨后95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s延伸。以β-actin為內參，采用2-△△Ct法計算各目的基因的相對表達量。

2.5 免疫細胞化學染色法檢測多藥耐藥相關蛋白的表達水平取處于對數生長期的所有組別耐藥細胞株，給藥處理48 h后，4%的多聚甲醛避光處理20 min，將3%過氧化氫溶液與甲醇溶液按一定比例（1∶4）滴于爬片上，封閉10 min后加入一抗孵育過夜，PBS清洗后加入二抗，室溫孵育30 min，隨后根據DAB顯色試劑盒進行操作，于倒置相差顯微鏡下觀察。采用Image J軟件計算出相對光密度值（ROD），其中陽性指標為棕色顆粒團塊，陰性指標為紫藍色團塊，并進行統(tǒng)計學分析。

2.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件處理試驗數據，數據分析選擇最低顯著性t檢驗（LSD-t），數據以表示，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 耐藥性檢測

3.1.1 細胞的多藥耐藥性檢測結果 5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑對HCC敏感細胞株BEL-7402的IC50分別為（12.60±2.48）、（1.58±0.26）、（26.73±1.54）、（28.12±2.61）、（21.21±4.02） mg/mL；5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑對HCC耐藥細胞株BEL-7402/5-FU的IC50分別為（7 398.27±330.77）、（6.44±0.39）、（78.01±4.90）、（177.74±4.29）、 （122.75±4.94） mg/mL。計 算 得BEL-7402/5-FU細胞對5-FU的耐藥倍數為587.16，對阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑的耐藥倍數分別為4.08、2.92、6.32、5.79。結果表明，BEL-7402/5-FU細胞對5-FU顯示出較強的耐藥性，對阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑產生了交叉耐藥性，即BEL-7402/5-FU細胞株為多藥耐藥細胞。

3.1.2 美洲大蠊多肽PAE2對敏感細胞和耐藥細胞的毒性作用 美洲大蠊多肽PAE2對敏感細胞株 BEL-7402的IC5、IC10、IC20、IC50分別為（53.73±2.91）、 （109.46±6.46）、（332.22±8.32）和（2 155.84±29.05） mg/mL，對耐藥細胞株BEL-7402/5-FU的IC5、IC10、IC20、IC50分 別 為（11.48±1.05）、（56.35±5.11）、 （105.23±4.34）和（1 165.53±63.01）mg/mL。結果顯示，耐藥細胞株BEL-7402/5-FU對美洲大蠊多肽PAE2更為敏感。

3.1.3 美洲大蠊多肽PAE2逆轉BEL-7402/5-FU多藥耐藥性的檢測結果 本研究選擇IC20高劑量的美洲大蠊多肽PAE2對BEL-7402/5-FU細胞進行多藥耐藥的逆轉試驗。將PAE2分別與5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑聯(lián)合使用，并計算聯(lián)合用藥后BEL-7402/5-FU的細胞生存率與上述5種藥物的IC50。結果顯示，合用高劑量的美洲大蠊多肽PAE2后，5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑的IC50分別為（12.73±1.19）、（0.90±0.06）、（15.22±2.82）、（12.78±1.42）、（46.68±0.42） mg/mL，逆轉指數分別為581.17、7.16、5.13、13.91、2.63。綜上所述，美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥細胞有較好的逆轉耐藥作用。見表1。

表1 不同藥物對BEL-7402和BEL-7402/5-FU細胞的影響（， n=6 ）

表1 不同藥物對BEL-7402和BEL-7402/5-FU細胞的影響（， n=6 ）

藥物IC50 /（mg/mL）RI RF BEL-7402 BEL-7402/5-FU BEL-7402/5-FU+PAE2 5-FU 12.60 ± 2.48 7 398.27 ± 330.77 12.73 ± 1.19 587.16 581.17阿霉素 1.58 ± 0.26 6.44 ± 0.39 0.90 ± 0.06 4.08 7.16長春新堿 26.73 ± 1.54 78.01 ± 4.90 15.22 ± 2.82 2.92 5.13環(huán)磷酰胺 28.12 ± 2.61 177.74 ± 4.29 12.78 ± 1.42 6.32 13.91奧沙利鉑 21.21 ± 4.02 122.75 ± 4.94 46.68 ± 0.42 5.79 2.63

3.2 RT-PCR法檢測美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關酶mRNA表達水平的影響與敏感細胞株相比，耐藥細胞株的PKC、TopoⅡ及GST-π均呈高表達狀態(tài)，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。使用藥物作用耐藥細胞后，索拉非尼與中劑量（IC10）和高劑量（IC20）的美洲大蠊多肽PAE2可明顯下調PKC mRNA表達（P< 0.05）；索拉非尼能明顯下調TopoⅡ及GST-πmRNA的表達 （P< 0.05），不同劑量組的美洲大蠊多肽PAE2也能明顯下調TopoⅡ及GST-πmRNA的表達（P< 0.05），并且各劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。見表2。

表2 美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關酶mRNA表達水平的影響（，n=5）

表2 美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關酶mRNA表達水平的影響（，n=5）

注：與敏感細胞組比較*P< 0.05；與耐藥細胞組比較#P < 0.05；與索拉非尼（陽性藥物）對照組比較△P< 0.05；與美洲大蠊多肽PAE2低劑量組比較○P < 0.05；與美洲大蠊多肽PAE2中劑量組比較□P < 0.05。

組別 PKC相對含量 TopoⅡ相對含量 GST-π相對含量敏感細胞組 1.00 1.00 1.00耐藥細胞組 4.71±0.69* 1.18±0.16* 10.63±1.34*索拉非尼（陽性藥物）對照組 0.44±0.09# 0.02±0.00*# 4.42±1.31*#美洲大蠊多肽PAE2 低劑量組 7.12±0.69*#△ 0.55±0.14*#△ 6.94±2.13*#△美洲大蠊多肽PAE2 中劑量組 1.83±0.12*#△○ 0.66±0.16*#△ 5.86±0.52*#美洲大蠊多肽PAE2 高劑量組 0.97±0.10#○□ 0.52±0.12*#△ 5.41±1.92*#

3.3 免疫細胞化學法檢測美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關酶蛋白表達水平的影響免疫細胞化學染色法實驗結果表明：敏感細胞株和耐藥細胞株均大量表達PKC，但耐藥細胞的表達量明顯高于敏感細胞（P< 0.05），索拉非尼及美洲大蠊多肽PAE2均能對PKC出現(xiàn)抑制作用，且美洲大蠊多肽PAE2作用呈劑量依賴性。其中，高劑量的美洲大蠊多肽PAE2的作用效果與索拉非尼相當（P> 0.05）。見圖1、表3。

表3 美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關酶相對光密度值（，n=5）

表3 美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關酶相對光密度值（，n=5）

注：與敏感細胞組比較*P< 0.05；與耐藥細胞組比較#P < 0.05；與索拉非尼（陽性藥物）對照組比較△P< 0.05；與美洲大蠊多肽PAE2低劑量組比較○P < 0.05；與美洲大蠊多肽PAE2中劑量組比較□P < 0.05。

組別 PKC TopoⅡ GST-π敏感細胞組 0.34±0.08 0.12±0.01 0.95±0.04耐藥細胞組 0.83±0.10* 0.13±0.00* 1.10±0.05*索拉非尼（陽性藥物）對照組 0.24±0.09*# 0.09±0.01*# 0.71±0.06*#美洲大蠊多肽PAE2 低劑量組 0.44±0.07*#△ 0.12±0.00#△ 0.87±0.07*#△美洲大蠊多肽PAE2 中劑量組 0.41±0.10*#△ 0.12±0.00#△ 0.78±0.10*#△○美洲大蠊多肽PAE2 高劑量組 0.22±0.08*#○□ 0.10±0.00*#△○□ 0.65±0.04*#○□

圖1 美洲大蠊多肽PAE2對PKC蛋白表達的影響（× 200）

敏感細胞株和耐藥細胞株均大量表達TopoⅡ，但耐藥細胞的表達量高于敏感細胞（P< 0.05），索拉非尼及美洲大蠊多肽PAE2均對TopoⅡ有抑制作用。其中，高劑量的美洲大蠊多肽PAE2與索拉非尼相比雖具有統(tǒng)計學差異（P> 0.05），但其抑制效果不如索拉非尼。見圖2、表3。

圖2 美洲大蠊多肽PAE2對TopoⅡ蛋白表達的影響（× 200）

耐藥細胞株與敏感細胞株相比，GST-π蛋白呈高表達狀態(tài)（P< 0.05），經藥物處理后，GST-π蛋白的表達量受到了不同程度的抑制（P< 0.05），其中，索拉非尼與高劑量的美洲大蠊多肽PAE2的下調作用較優(yōu)（P< 0.05），兩者之間的作用差異無統(tǒng)計學意義；美洲大蠊多肽PAE2的下調作用呈現(xiàn)出劑量依賴性（P< 0.05）。見圖3、表3。

圖3 美洲大蠊多肽PAE2對GST-π蛋白表達的影響（× 200）

4 討論

HCC的耐藥機制較為復雜，其中包括多藥耐藥酶介導的多藥耐藥性，包括GST-π、PKC、TopoⅡ等〔9〕。PKC是重要的信號分子家族，具有調節(jié)細胞增殖、分化、轉化和凋亡的作用，并且在腫瘤的促進及發(fā)展過程中也參與表達；GST-π可以保護細胞免受細胞毒性及致癌的危險，被認為是腫瘤發(fā)展的標志酶，并且在腫瘤細胞中呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)；TopoⅡ能促進腫瘤細胞增殖，與惡性腫瘤的進程有著密不可分的關系，并且高表達于肝癌患者中。

試驗證明了美洲大蠊多肽PAE2具有逆轉多藥耐藥的作用。通過RT-PCR法在體外的研究結果表明，與BEL-7402細胞株相比，在BEL-7402/5-FU細胞株體外GST-π、PKC、TopoⅡ的mRNA表達量均明顯上調，差異具有統(tǒng)計學意義，可以初步確定BEL-7402/5-FU細胞株產生多藥耐藥性的作用與GST-π、PKC、TopoⅡ高表達導致藥物外排有關，從而使藥物攝取不足，細胞內的藥物代謝異常，并且在給藥后均呈現(xiàn)出下降的效果，但美洲大蠊多肽PAE2下調作用并沒有隨著濃度呈現(xiàn)出劑量依賴的趨勢，并且各劑量組之間的抑制作用也各有不同，這可能與美洲大蠊多肽PAE2對腫瘤細胞的雙向調節(jié)作用有關，提示了腫瘤細胞活性分子的復雜性，也可能與美洲大蠊多肽PAE2未達到有效治療濃度有關。

在蛋白表達水平，對于多藥耐藥相關酶而言，GST-π、TopoⅡ在BEL-7402和BEL-7402/5-FU細胞株中的表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義；經過不同受試藥物處理后，GST-π、TopoⅡ的表達量也有所下調，存在統(tǒng)計學差異 ；特別是PKC在BEL-7402和BEL-7402/5-FU細胞株中的蛋白表達水平差異明顯，不同受試藥物作用的結果也相對明顯。本研究表明，對于多藥耐藥相關酶PCK、GST-π及TopoⅡ，索拉非尼和高劑量的美洲大蠊多肽PAE2的下調作用相對較優(yōu)；同樣，研究結果也反映出上述參與細胞運轉代謝的酶，對于HCC細胞產生多藥耐藥性可能只是存在調節(jié)，并不一定具有主導作用，在后續(xù)的研究中，需要系統(tǒng)深入地對酶介導的多藥耐藥性作用進行進一步分析，未來仍需進一步尋找上游的調控靶點，才能更好地為美洲大蠊多肽PAE2的臨床前研究、臨床應用和產業(yè)化提供強有力的依據。