王衛(wèi)鋼,岳磊（.河南省周口市公共檢驗檢測中心（周口市食品藥品檢驗所）,河南 周口 466000;2.鄭州市食品藥品檢驗所,河南 鄭州 450000）

雌激素和孕激素是由女性卵巢分泌的最基本的兩個激素，也是直接導(dǎo)致女性在生理體征上有別于男性的最本質(zhì)的激素[1-2]。常見用于輔助治療青春期子宮異常出血、痛經(jīng)；更年期抑郁癥、心律失常、骨質(zhì)疏松等疾病[3-7]。針對于檢測雌激素及孕激素類的非法添加的分析方法中，液質(zhì)聯(lián)用法是近期研究的一種主要方向[8]。在此基礎(chǔ)上，我們在質(zhì)譜端采用線性離子阱（QTrap）技術(shù)，利用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）的定量數(shù)據(jù)，在質(zhì)譜方法中添加相關(guān)信息掃描（IDA）與增強離子掃描（EPI），在濃度更低的樣品基礎(chǔ)上，提取更多的質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)，為更準(zhǔn)確的定性提供有效參考。

1 材料

1.1 儀器 超高效液相色譜儀，型號：ACQUITY UPLC（美國Waters）；線型離子阱質(zhì)譜分析儀，型號：4000 QTrap（美國Sciex）；電子分析天平，型號：XS205DU（瑞士Mettler Toledo）；超聲波清洗機，型號：SB-800DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑 對照品：黃體酮（批號：10027-201209，純度：99.7%），雌二醇（批號：100182-201205，純度：96.3%），雌三醇（批號：100934-201302，純度：97.6%），雌酮（批號：100949-200501，純度：100.0%），己烯雌酚（批號：10033-201308，純度：99.5%），戊酸雌二醇（批號：100063-200904，純度：99.6%）、苯甲酸雌二醇（批號：100006-200504，純度：100.0%）、尼爾雌醇（批號：100239-200702，純度：99.4%）、炔諾孕酮（批號：100028-199907，純度：99.4%）、庚酸炔諾酮（批號：100988-200901，純度：99.4%）均來自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件 色譜柱：C O R T E C S U P L C C18（2.1mm×50mm，1.6μm）；流動相：乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫程序（0-3min，20%→90%A；3-4min，90%A；4-4.1min，90%→20%A；4.1-5min，20%A）；流速：0.3ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μl。電噴霧離子源（ESI）；正離子模式，MRM-IDA-EPI模式掃描。

2.2 對照品溶液的配制

2.2.1 對照品儲備液 分別稱取上述所有對照品各10mg（精確到0.01mg），分別置于100mL容量瓶，加少量甲醇，震搖使其溶解后再加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制 取上述各對照品儲備液適量，制成濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0以及50.0μg·mL-1的對照品溶液。

2.3 樣品處理 膠囊劑取10粒，將內(nèi)容物完全倒出，研細(xì)混勻，備用；片劑取10粒，研碎后混勻，備用。取樣品約1g（精確到0.0001g）置于50mL容量瓶中，精密加入甲醇20.0mL，超聲處理30min后放置至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4 結(jié)果 10種對照品的采樣離子對及相關(guān)質(zhì)譜信息參數(shù)見表1，其總離子流色譜圖（TIC）見圖1，各化合物增強離子掃描（EPI）子離子全掃圖見圖2。在檢測樣品擁有目標(biāo)對照品時，可提取出樣品的二級子離子圖與對照品進(jìn)行比對，能夠提供對比出峰時間、離子豐度比之外的另一種驗證方式。

表1 10種對照品質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果與方法學(xué)考察

圖1 10種對照品的TIC色譜圖。01.雌三醇；02.雌二醇；03.雌酮；04.己烯雌酚；05.炔諾酮；06.黃體酮；07.尼爾雌醇；08.苯甲酸雌二醇；09.戊酸雌二醇；10.庚酸炔諾酮

圖2 10種對照品的EPI子離子圖。01.雌三醇；02.雌二醇；03.雌酮；04.己烯雌酚；05.炔諾酮；06.黃體酮；07.尼爾雌醇；08.苯甲酸雌二醇；09.戊酸雌二醇；10.庚酸炔諾酮

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍 取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液與對照品儲備液按上述條件測定，以待測物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以待測物質(zhì)濃度（x，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)作定量工作曲線，得到線性回歸方程，結(jié)果表明，10種雌激素及孕激素對照品的溶液濃度與測得的峰面積呈良好的線性關(guān)系，相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999。具體結(jié)果詳見表2。

表2 10種化合物的檢出限、定量限、線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.5.2 精密度試驗 取“2.2”項下各對照品儲備溶液各5mL，置于50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，照“2.1”項下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示10種化合物（按表1中順序）峰面積的RSD分別為3.0%、3.2%、3.0%、3.8%、1.9%、3.2%、3.1%、2.8%、2.1%、3.6%，表明儀器的精密度符合要求。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 隨機選取“2.5.2”項下一份混合溶液，避光放置0、2、4、6、8、12h后分別進(jìn)樣，結(jié)果各成分的RSD分別為4.1%、4.8%、4.3%、2.1%、3.5%、3.2%、2.3%、2.6%、2.1%、2.1%，表明該供試品溶液樣品在室溫下12h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.5.4 回收率 取同一批健字號膠囊，精密稱取其顆粒細(xì)粉0.50g，精密加入2.2項下各標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.30ml，制備6份加標(biāo)供試品溶液的平行樣，計算加樣回收率，結(jié)果顯示，各成分的平均加樣回收率分別為98.7%、99.5%、102.7%、96.4%、97.9%、96.3%、105.7%、101.5%、99.6%、102.1%，其RSD分別為2.4%、2.9%、3.6%、4.6%、5.9%、2.7%、3.1%、2.4%、4.5%、3.3%。

2.6 結(jié)果判斷 若供試品色譜圖出現(xiàn)與對照品對應(yīng)離子對信號保留時間均一致的色譜峰，判斷其離子豐度比是否與對照品一致，再調(diào)用二者EPI圖譜確認(rèn)二者碎片離子分布及強度均一致，則可準(zhǔn)確定性供試品中的添加成分并予以定量分析。

2.7 實際樣品測定 按照“2.3”所述方法對2018-2020年度鄭州市安全評價性抽樣的72批抽檢樣品進(jìn)行處理，按照“2.6”項下方法進(jìn)行判斷，結(jié)果顯示各樣品中這10種化合物均未檢出，說明抽檢的保健食品及中成藥中暫時未發(fā)現(xiàn)這10種化合物的非法添加安全隱患。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 流動相：考察甲醇-水、乙腈-水體系在不同梯度下的表現(xiàn)。其中乙腈-水體系可以在最終檢測時取得更好的峰型與分離度；采用梯度洗脫使得在總檢測時間5min內(nèi)保證目標(biāo)化合物全部出峰，并基本實現(xiàn)基線分離，有效的減少了檢測時間，提高了工作效率。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 在儀器自動優(yōu)化的前提下，選擇適當(dāng)?shù)臐舛炔捎檬謩觾?yōu)化的方法對各化合物的質(zhì)譜條件進(jìn)行了進(jìn)一步的調(diào)整。利用儀器的線性離子阱（Q-Trap）功能在第三重四級桿處進(jìn)行離子富集掃描，可以在較低濃度條件下生成二級子離子全掃描圖，在定性時可以進(jìn)行有效的輔助判斷。以此為基礎(chǔ)，未來可以在選擇更多的激素類化合物對檢測方法進(jìn)行補充，以進(jìn)一步擴大該檢測方法的適用范圍。