王曉楠(天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院,天津 300300)
幽門螺桿菌(HP)屬于革蘭陰性螺旋桿菌,主要定植于胃黏膜上皮細胞表面,其感染與消化性潰瘍、胃癌等發(fā)生密切相關[1-2]。免疫組織化學法(IHC)可在組織切片技術的基礎上特異性結合抗體、抗原并通過組織化學顯色技術原理實施檢測,具有高敏感度和特異度,易于判斷陽性,是診斷HP感染的常用手段[3]。熒光定量聚合酶鏈式反應(FQ-PCR)法具有敏感度高、特異度高等特點,還能定量分析病原體核酸,逐漸被應用于微生物感染[4]。本研究分析FQ-PCR法與IHC檢測胃黏膜中HP感染的臨床意義,為臨床診斷方式選擇提供參考。詳情報道如下。
1.1 一般資料 選擇2019年8月-2020年12月我院接診的86例慢性胃炎患者,均采集胃黏膜活檢標本,其中女48例,男38例;年齡26-81歲,平均年齡(56.85±3.45)歲。
1.2 試劑與儀器 徠卡全自動免疫組織化學染色儀(LeicaBONDMAX型);全自動熒光定量PCR儀(ABI7500型);HP免疫組織化學檢測試劑盒(Dako公司);購自北京新基永康生物科技有限公司的HP23SrRNA基因突變核酸檢測與HP分型鑒定試劑盒;購自中山大學達安基因股份有限公司的HP鑒定試劑盒;購自北京厚生博泰科技有限公司的DNA提取試劑盒。
1.3 方法
1.3.1 IHC檢測HP 切取每例患者胃黏膜切片,厚度為4μm,設立陰陽性對照,使用全自動免疫組織化學染色儀染色。陽性判讀標準:鏡下胃黏膜黏液層、腺管上皮、小凹上皮、上皮表面存在著色為棕黃色的HP菌體。觀察鏡下胃黏膜黏液層、腺管上皮、小凹上皮、上皮表面HP判斷感染強度。無:未見HP;輕度感染(+):低于標本全長1/3或偶見有少數HP;中度感染(++):HP分布超過標本全長1/3而低于2/3,或連續(xù)性、薄而稀疏地存在于上皮表面;重度感染(+++):HP基本分布于標本全長,成堆存在。
1.3.2 FQ-PCR檢測HP 切取每例患者石蠟組織切片10張,厚度為10μm,置入潔凈的EP管內,用毛筆刷干凈后,實施DNA提取。石蠟組織樣本內加入緩沖液GA250μL,90℃環(huán)境下孵育60min,離心后,取200μL包含組織的液體,加入至新的EP管內,滴加蛋白酶K40μL,顛倒混勻,水浴,溫度為56℃,過夜消化,待組織完全消化為準。離心處理消化后的液體,吸上清,加入新的EP管內,加入250μL緩沖液GB,震蕩混勻后,水浴10min,溫度為70℃。加入250μL無水乙醇,震蕩混勻、離心。在DNA吸附柱內加入獲取的混合液,放置1min,離心,將濾液去除。加入緩沖液GD500μL,放置1min,離心,將濾液去除。加入500μLPW,放置1min,離心,將濾液去除,重復兩次。在新的收集管內套入吸附柱,離心后開蓋,靜置2min,使乙醇揮發(fā)。加入70℃預熱后的Elution緩沖液50μL,靜置2min,需Elution緩沖液在硅基質膜的中間懸空滴加,以確保洗脫液能完全覆蓋硅基質膜。離心后獲取樣本DNA提取液。以每份TaqDNA聚合酶0.25μL、反應液22.5μL的標準分別配制分型、鑒定反應混合液,震蕩混勻后,離心,按每管樣本2.5μL、反應混合液22.5μL分裝至PCR反應管中。最后加入陰性對照與陽性對照,離心,實施PCR擴增。調整閾值線,計算閾值(Ct值)。根據試劑盒說明書計算樣本的ΔCt值,判讀感染強度。輕度感染(+):ΔCt值>3.00;中度感染(++):ΔCt值為0.01-3.00;重度感染(+++):ΔCt值為0.00-0.01。
1.3.3 23SrRNA基因突變核酸檢測 對IHC與FQ-PCR檢測結果不一致樣本實施HP23SrRNA基因突變核酸檢測。前期操作與FQPCR檢測相同,調整閾值線,計算Ct值。陽性感染:HP23S反應液1和2中存在VIC或FAM通道(23SrRNA反應液1中FAM通道、VIC通道分別為A2142G、AA野生型;反應液2中FAM通道、VIC通道分別為A2143G、AA野生型)且Ct值≤35.00。
1.4 觀察指標 ①分析IHC與FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP感染情況及其感染強度。②分析FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP分型檢測結果。
1.5 統(tǒng)計學方法 本次實驗研究應用SPSS21.0軟件分析數據,用(±s)表示計量資料,組間比較用t檢驗;以n(%)表示計數資料,組間比較用χ2檢驗,等級資料使用秩和檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 HP感染情況 86份標本經FQ-PCR檢測陽性率為30.23%(26/86),IHC檢測陽性率為25.58%(22/86),兩者檢測HP陰性符合率為93.75%(60/64),陽性符合率為84.62%(22/26),總符合率為95.35%(82/86)。兩種檢查方式對HP陽性檢出率比較,差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.462,P=0.497)。兩種檢查方式中共有4例不一致樣本,均為FQ-PCR檢測出而IHC未檢出HP感染,對其實施HP23SrRNA基因突變核酸檢測,結果顯示均為陽性,可見存在HP感染。
2.2 HP感染強度 IHC與FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP感染強度比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。
表1 HC與FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP感染強度比較[n(%)]
2.3 HP分型檢測結果 FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP陽性標本26例,其中Ⅱ型菌4例(15.38%)。
HP感染后產生多種致病因子,對胃黏膜形成損害,誘發(fā)噯氣、反酸等癥狀,是引發(fā)胃腺癌、慢性胃炎等胃腸疾病發(fā)病的相關細菌感染[5]。HE染色、糞便HP抗原檢測、尿素呼氣試驗等均是檢測HP的常用手段,其中常規(guī)HE染色檢測具有價廉、簡便等優(yōu)點,但菌體有著色差異,可能會發(fā)生染色較淺和無法與其他污染物或雜菌區(qū)分情況[6]。尿素呼氣試驗無創(chuàng)、操作簡便,但需口服放射性同位素,可能會影響環(huán)境、人體,且不適用于胃輕癱、胃下垂、幽門梗阻、晚期胃癌、高位梗阻、十二指腸瘀滯癥等患者[7-8]。糞便HP抗原檢測操作簡便、無需口服任何試劑且無任何不良反應,為完全非侵入性檢查,且無需昂貴儀器,但檢查結果會受到試劑貯藏條件、運輸和操作方法、操作人員技術等因素影響[9]。IHC檢測準確性較高,但檢測依賴于病理醫(yī)師鏡下觀察經驗與判讀經驗,檢查結果會受到人為主觀因素影響,且無法對HP做出分型判斷。
本研究中,兩種檢查方式對HP陽性檢出率、檢測胃黏膜標本中HP感染強度均無明顯差異;共有4例不一致樣本,均為FQPCR檢測出而IHC未檢出的HP感染,對其實施HP23SrRNA基因突變核酸檢測,結果顯示均為陽性;FQ-PCR檢測胃黏膜標本中HP陽性標本26例,其中Ⅱ型菌4例,提示IHC與FQ-PCR檢測HP感染具有較高的符合率。FQ-PCR檢測可靶向標記23SrRNA基因與16SrRNA基因,實行完全閉管式操作,避免擴增產物受到污染。FQ-PCR檢測還能適時定量擴增產物,使反應精確度提高,結果可靠、操作簡便,且能自動讀數,進而避免發(fā)生人為誤差[10]。FQ-PCR檢測還具有取材方便、標本易于保存、檢查耗時短等優(yōu)點,適用于HP感染大規(guī)模篩查。
綜上所述,IHC與FQ-PCR檢測HP感染情況與感染強度符合率較高,FQ-PCR法還能檢測HP基因分型,可將其作為在檢測胃黏膜中HP時IHC法的替代檢測法。