孫玉會(huì)，劉旭麗

（上黨區(qū)人民醫(yī)院，山西 長(zhǎng)治 047100）

0 引言

心肌病（CM）是一組由于心臟下部分腔室（即心室）的結(jié)構(gòu)改變和心肌壁功能受損所導(dǎo)致心臟功能進(jìn)行性障礙的病變。阿霉素（ADR 或DOX）是一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，因其對(duì)很多腫瘤均有較好的療效，所以被廣泛應(yīng)用于臨床。然而，其具有嚴(yán)重的心臟毒性[1-3]。p38MAPK 作為MAPK 家族中的一個(gè)重要成員，主要被環(huán)境應(yīng)激及細(xì)胞因子激活，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、分裂以及死亡[4-5]。

血管緊張素-（1-7）[Ang-（1-7）]自1983 年在大鼠腦組織中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，從被認(rèn)為是無(wú)活性的代謝片段到目前越來(lái)越多的生理及病理效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)，特別是在心血管系統(tǒng)的作用被許多學(xué)者重視[6]。本文應(yīng)用DOX 損傷H9c2 心肌細(xì)胞，為深入闡明Ang-（1-7）的心肌保護(hù)作用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

血管緊張素-（1-7）、N-acetyl-L-cysteine（NAC）、阿霉素、Hoechst 33258、雙氯熒光素（DCFHDA）和羅丹明123（Rh123）購(gòu)自Sigma Aldrich 公司（USA），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）由Dojindo Lab（日本）提供，蛋白預(yù)覽Marker（10-170Kd）購(gòu)自Fermenta 公司，DMEM-F12 培養(yǎng)基以及特級(jí)胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco BRL（USA），抗t-p38、p-p38抗體及SB302580（p38MAPK 抑制劑）購(gòu)自Cell Signaling Technology Inc（CST）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

H9c2 細(xì)胞來(lái)源于大鼠胚胎期心臟組織。在37 ℃、5%CO2的條件下，培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中。

實(shí)驗(yàn)分為8 組：①正常對(duì)照組；②阿霉素?fù)p傷組；③血管緊張素-（1-7）預(yù)處理+阿霉素?fù)p傷組：10-3μmol/L Ang-（1-7）作用H9c2 心肌細(xì)胞2 h，撤去，用PBS 洗兩2 次，接著5 μmol/L DOX 作用24 h；④SB203580 預(yù)處理+阿霉素?fù)p傷組：5 μmol/L SB203580 作用H9c2 心肌細(xì)胞60 min，撤去，用PBS 洗2 次，接著5 μmol/L DOX 作用24 h；⑤NAC 預(yù)處理+阿霉素?fù)p傷組：1000 μmol/L NAC 作用H9c2 心肌細(xì)胞60 min，撤去，用PBS 洗2 次，接著5 μmol/L DOX 作用24 h；⑥血管緊張素-（1-7）處理組：10-3 μmol/L Ang-（1-7）作用H9c2 心肌細(xì)胞2 h；⑦SB203580 處理組：5 μmol/L SB203580作用H9c2 心肌細(xì)胞60 min；⑧NAC 處理組：1000 μmol/L NAC 作用H9c2 心肌細(xì)胞60 min。

1.3 Western blot 測(cè)定p38MAPK 蛋白的表達(dá)

大鼠H9c2 心肌細(xì)胞接種于60 mm 培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS 洗3 次，加入細(xì)胞裂解液60 mL，4 ℃冰箱中靜置30 min，12000 r/min 離心10 min，取上清，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDSPAGE 分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5% 脫脂奶粉封閉90 min，隨后加入抗p-p38MAPK 抗體（1:1000）、抗t-p38MAPK 抗體（1:1000），4 ℃冰箱中過(guò)夜，用TBST 洗3 次，10 min/ 次。將PVDF 膜用發(fā)光試劑ECL 顯色，暗室曝光到X 線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.4 CCK-8 測(cè)定心肌細(xì)胞存活率

大鼠H9c2 心肌細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔約80%面積時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行不同的處理；每個(gè)處理因素設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。終止培養(yǎng)后，每孔加入10 μl CCK-8，輕搖，37 ℃孵育2.5 h，用酶標(biāo)儀（λ=450 nm）記錄各孔的吸光度（OD）。取5 孔OD 值的平均數(shù)，按下列公式計(jì)算心肌細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=處理組OD/ 對(duì)照組OD×100%，重復(fù)3 次。

1.5 Hoechst33258 核染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡

將大鼠H9c2 心肌細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板中，在細(xì)胞生長(zhǎng)到占培養(yǎng)孔面積大約80%時(shí)，上述各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素后，棄去培養(yǎng)基，PBS 沖洗3 次，然后用4% 多聚甲醛于4 ℃環(huán)境中固定15 min，PBS 沖洗3 次，加入含5 mg/L Hoechst33258 試劑，于37 ℃溫箱孵育15 min，然后用PBS沖洗3 次。在熒光顯微鏡下（TE-2000’ Nikon’ Japan）攝片，染色質(zhì)呈均勻分布，核被染成均勻藍(lán)色的細(xì)胞被認(rèn)為是正常的心肌細(xì)胞，如細(xì)胞核呈濃縮、碎裂的明亮藍(lán)色細(xì)胞則被認(rèn)為是凋亡的心肌細(xì)胞，隨機(jī)選取視野在熒光顯微鏡下攝片。重復(fù)3 次。

1.6 心肌細(xì)胞胞內(nèi)ROS 水平的測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)的ROS 可將無(wú)熒光的DCFH 氧化成發(fā)出綠色熒光的DCF。綠色熒光的強(qiáng)弱可以間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平。將賴氨酸包被的蓋玻片置于12 孔培養(yǎng)板內(nèi)，H9c2 心肌細(xì)胞被均勻地接種于蓋玻片上。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔約80%面積時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要給予相應(yīng)的處理。每組均包括3個(gè)復(fù)孔。處理完成后，用PBS 漂洗蓋玻片3 次，用10 μmol L-1DCFH-DA 染液于37 ℃孵育30 min。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，用Image J 1.47i 軟件分析5 個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 Ang-（1-7）減弱DOX 對(duì)p38MAPK 表達(dá)的上調(diào)作用

單獨(dú)10-3 μmol/L Ang-（1-7）處理心肌細(xì)胞2 h 對(duì)p-p38MAPK 的基礎(chǔ)表達(dá)無(wú)明顯的影響，見(jiàn)圖1。

圖1 Ang-（1-7）減弱DOX 對(duì)H9c2 心肌細(xì)胞p-p38MAPK 的上調(diào)作用

2.2 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制劑和NAC 拮抗DOX 引起的心肌細(xì)胞毒性

單獨(dú)的10-3μmol/L Ang-（1-7）、5 μmol/L SB203580 或者1000 μmol/L NAC 作用H9c2 細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖2。

圖2 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制劑和NAC 抑制DOX 引起的心肌細(xì)胞毒性

2.3 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制劑和NAC 減輕高糖引起的心肌細(xì)胞凋亡

Hoechst 33258 染色的結(jié)果（圖3）顯示，單獨(dú)的10-3μmol/LAng-（1-7）、5 μmol/L SB203580 或 者1000 μmol/L NAC 作用H9c2 細(xì)胞本身不引起細(xì)胞凋亡。

圖3 Ang-（1-7）、p38MAPK 通路抑制劑和NAC 減輕高糖引起的心肌細(xì)胞凋亡

3 討論

阿霉素性心肌病是由于阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷所致，心肌毒性是阿霉素危害最大，嚴(yán)重限制了阿霉素的臨床應(yīng)用，其中阿霉素誘導(dǎo)的心肌毒性主要機(jī)制有氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，為了找到更特異和高效的防治措施，深入研究阿霉素引起心肌毒性的發(fā)病機(jī)制十分必要[7-8]。本研究結(jié)果顯示，阿霉素可以激活p38MAPK，采用ROS 清除劑NAC 后可以抑制阿霉素誘發(fā)的p38MAPK 的磷酸化；這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示：ROS 介導(dǎo)了阿霉素激活的p38MAPK 信號(hào)通路的激活。

綜上所述，本文證實(shí)Ang-（1-7）能保護(hù)H9c2 心肌細(xì)胞對(duì)抗DOX 引起的心肌毒性，此保護(hù)作用可能與其對(duì)抗ROS激活的p38MAPK 通路從而發(fā)揮其抗氧化作用、線粒體保護(hù)及抗凋亡作用等有關(guān)。Ang-（1-7）是具有廣泛生物學(xué)活性的內(nèi)源性血管緊張素，具有顯著的心肌保護(hù)作用，但其機(jī)制尚未明了，值得我們繼續(xù)探索。