苑華飛, 魏海燕, 曹江宇, 張蒙藝, 張 蕤, 徐紅梅

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

離子液體(ionic liquids,ILs)是一種熔點(diǎn)低于100 ℃,完全由陰、陽離子組成的有機(jī)鹽[1-2]。相比于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑,ILs具有制備方法簡(jiǎn)單、溶解力強(qiáng)、熱穩(wěn)定性較高、不易揮發(fā)等優(yōu)點(diǎn),因而在化學(xué)合成[3]、萃取分離[4]和功能材料制備[5]等方面有著廣泛的應(yīng)用,被認(rèn)為是揮發(fā)性有機(jī)溶劑的綠色替代品。然而越來越多的研究表明,ILs并非完全綠色環(huán)保[6],其對(duì)多種生物體(如細(xì)菌、細(xì)胞、蚯蚓、斑馬魚和水稻幼苗[7-11]等)都有一定的毒性。

隨著ILs合成與應(yīng)用的快速發(fā)展,部分ILs泄漏到環(huán)境中是不可避免的;同時(shí),由于ILs性質(zhì)穩(wěn)定,易在環(huán)境或生物體內(nèi)累積而產(chǎn)生危害。因此,研究ILs 對(duì)生物體的毒性及作用機(jī)制,評(píng)價(jià)其對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響,具有深遠(yuǎn)的社會(huì)意義和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

咪唑型ILs是近年來研究最為廣泛的一類ILs[12],對(duì)其毒性評(píng)價(jià)的報(bào)道也逐漸增多,但有關(guān)咪唑型ILs對(duì)哺乳動(dòng)物毒性的研究并不多。因此,本實(shí)驗(yàn)擬采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)的“up-and-down procedure” (UDP)[13],考察咪唑型ILs四氟硼酸化1-十四烷基-3-甲基咪唑鹽([C14mim]BF4)對(duì)大鼠的急性毒性,并通過HE染色法觀察其對(duì)大鼠胃、腸、肝、腎等臟器組織的損傷,以期為咪唑型ILs毒性作用機(jī)理的探究提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 離子液體

咪唑型ILs [C14mim]BF4由中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所合成,其純度≥99%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠10 只(6周齡),雄性,體質(zhì)量約為(180±20) g,由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供,生產(chǎn)許可證為SCXK(皖)2018-001。大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)(溫度20～22 ℃、濕度65%～75%),自然光照,動(dòng)物自由飲水、飲食。

1.3 試劑

生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液)購自安徽豐原藥業(yè)有限公司,批號(hào)為20190524;甲醛溶液(37.0%～40.0%)購自上海振企化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)為20190112;無水乙醇購自上海中試化工總公司,批號(hào)為20190210。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

JA2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);RM2245Leica切片機(jī)(德國萊卡公司);IX71顯微鏡(OLYMPUS公司);微量移液器(北京東南儀誠實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 ILs溶液的配制

實(shí)驗(yàn)前,分別精密稱取550、1 750、5 500、20 000 mg的[C14mim]BF4,各自溶于100 mL蒸餾水中,依次得到質(zhì)量濃度為5.5、17.5、55.0、200.0 mg/mL的[C14mim]BF4溶液。

1.5.2 動(dòng)物分組及染毒

根據(jù)UPD法,采用劑量序列55、175、550、2 000 mg/kg依次對(duì)大鼠進(jìn)行經(jīng)口染毒(每100 g體質(zhì)量用1 mL藥液)。[C14mim]BF4以175 mg/kg為起始劑量,先用1只大鼠進(jìn)行染毒,觀察48 h。若大鼠瀕死或死亡,則降低劑量至55 mg/kg;若大鼠未出現(xiàn)死亡,則劑量遞增至550 mg/kg;以此類推。染毒后存活的大鼠連續(xù)觀察14 d,將每次染毒劑量、大鼠存活(記為○)和死亡(記為×)的結(jié)果輸入AOT425StatPgm軟件,計(jì)算出[C14mim]BF4的LD50值和95%可信區(qū)間。

1.5.3 中毒體征

大鼠染毒后逐日觀察、記錄其中毒反應(yīng),包括外觀特征、行為活動(dòng)、飲食與精神狀況、是否死亡、中毒反應(yīng)的嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間、是否可逆等,連續(xù)觀察14 d。

1.5.4 組織病理學(xué)

不同染毒劑量大鼠死亡后立即解剖,分別觀察各臟器的體積、顏色、質(zhì)地等有無異常,并取其胃、小腸、心臟、肺、腎臟和肝臟,用10%甲醛溶液固定,不同梯度乙醇溶液逐級(jí)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,在OLYMPUS顯微鏡下,觀察各組織的形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 中毒體征結(jié)果分析

觀察期間,染毒大鼠出現(xiàn)毛色發(fā)黃、攝食減少、反應(yīng)遲鈍等中毒反應(yīng),隨著染毒劑量增大,大鼠毒性反應(yīng)增強(qiáng)。550 mg/kg劑量染毒大鼠出現(xiàn)毛發(fā)豎立、身體顫抖、呼吸急促、亢奮甚至無法站立等中毒癥狀;2 000 mg/kg劑量染毒大鼠的毒性反應(yīng)最為強(qiáng)烈,表現(xiàn)為呼吸喘促、行走不穩(wěn)、腹部脹大、全身抽搐等癥狀,并在24 h內(nèi)死亡。

統(tǒng)計(jì)染毒大鼠的存活/死亡情況,結(jié)果見表1所列。

表1 [C14mim]BF4急性毒性試驗(yàn)大鼠存活和死亡結(jié)果

對(duì)中毒死亡的大鼠進(jìn)行解剖,其肝臟、胃如圖1所示。

從圖1可以看出,染毒大鼠的肝臟組織呈暗紅色,表面粗糙(圖1b),局部出現(xiàn)淤血(圖1c);2 000 mg/kg劑量染毒大鼠還出現(xiàn)胃、小腸脹氣等現(xiàn)象(圖1e)。

圖1 染毒大鼠肝臟、胃圖片

2.2 [C14mim]BF4的LD50

將急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸入AOT425StatPam-程序,計(jì)算出[C14mim]BF4對(duì)大鼠的LD50值為249.8 mg/kg,其95%可信區(qū)間為175～550 mg/kg。

2.3 組織病理學(xué)結(jié)果分析

2.3.1 [C14mim]BF4對(duì)大鼠胃、小腸的損傷

HE染色后大鼠胃、小腸組織病理切片鏡檢(放大100倍)結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2 大鼠胃組織病理切片

圖3 大鼠小腸組織病理切片

由圖2可知,正常大鼠胃粘膜細(xì)胞形態(tài)均勻,粘膜腺體排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整(圖2a),隨著染毒劑量的增加,大鼠的胃組織依次出現(xiàn)上皮細(xì)胞壞死(圖2b)、脫落(圖2c),甚至腺體結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞(圖2d)等損傷。由圖3可知,小腸絨毛排列整齊、完整無損(圖3a),小腸組織依次出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(圖3b、圖3c),絨毛層排列不規(guī)則,細(xì)胞壞死、脫落(圖3d)。

2.3.2 [C14mim]BF4對(duì)大鼠心臟、肺的損傷

HE染色大鼠心臟、肺組織病理切片鏡檢(放大100倍)結(jié)果如圖4、圖5所示。由圖4可知,正常大鼠的心肌細(xì)胞排列均勻整齊(圖4a),[C14mim]BF4染毒后,大鼠的心肌組織依次出現(xiàn)細(xì)胞輕度淤血(圖4b、圖4c),橫紋肌間隙增寬(圖4c),肌束排列紊亂、斷裂(圖4d)等損傷。由圖5可知,肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)均勻(圖5a),肺組織依次出現(xiàn)間質(zhì)出血、炎細(xì)胞浸潤(圖5b),肺泡間隔擴(kuò)大、斷裂(圖5c、圖5d)、間質(zhì)彌漫性出血(圖5d)等損傷,且其損傷程度隨著[C14mim]BF4染毒劑量的增大而增強(qiáng)。

圖4 大鼠心臟組織病理切片

圖5 大鼠肺組織病理切片

2.3.3 [C14mim]BF4對(duì)大鼠腎臟、肝臟的損傷

HE染色后大鼠腎臟、肝臟組織病理切片鏡檢(放大100倍)結(jié)果如圖6、圖7所示。由圖6可知,正常大鼠的腎小球、腎小管形態(tài)正常、染色均勻(圖6a),染毒后大鼠的腎臟隨著染毒劑量的增加,依次出現(xiàn)腎小管排列不規(guī)則(圖6b),上皮細(xì)胞水腫(圖6c)、脫落(圖6d),腎間質(zhì)、腎小球嚴(yán)重淤血(圖6d)等變化。由圖7可知,肝細(xì)胞以中央靜脈為軸心呈放射狀排列,細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰(圖7a),肝細(xì)胞則出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死(圖7b)、脂肪變性或空泡(圖7c)、嚴(yán)重淤血(圖7d)、胞質(zhì)稀疏呈纖維網(wǎng)狀(圖7d)等一系列變化。大鼠肝細(xì)胞受損程度隨著[C14mim]BF4染毒劑量的增大而增強(qiáng)。

圖6 大鼠腎臟組織病理切片

圖7 大鼠肝臟組織病理切片

3 討 論

大量的研究資料表明,咪唑型ILs的毒性強(qiáng)弱與其烷基側(cè)鏈的長(zhǎng)度有關(guān),本課題組前期的研究工作也證實(shí):當(dāng)咪唑型ILs 側(cè)鏈取代基為C10、C12、C14時(shí),隨著碳鏈的增長(zhǎng),其對(duì)小鼠的毒性增強(qiáng),當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度為14時(shí),毒性最強(qiáng)[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),[C14mim]BF4經(jīng)口染毒可引起部分大鼠死亡,說明其對(duì)大鼠具有一定的毒性。根據(jù)測(cè)得的LD50值,參照《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度(GHS)》中急性毒性分類標(biāo)準(zhǔn)[16],可以判斷[C14mim]BF4對(duì)大鼠經(jīng)口染毒的毒性為中等毒性,這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[17-18]。

外源性的ILs經(jīng)口進(jìn)入大鼠體內(nèi)后,首先經(jīng)胃腸道消化吸收,然后隨血液運(yùn)輸?shù)叫?、肺、肝、腎等組織器官[19]。在實(shí)驗(yàn)中,本文考察了[C14mim]BF4對(duì)大鼠心、肺、肝、腎和消化系統(tǒng)的影響。病理結(jié)果表明:與正常大鼠相比,染毒組大鼠的胃、小腸、心、肺、腎和肝組織都受到了一定程度的損傷,且受損程度隨著染毒劑量的增加而加重,但肝臟的損傷最為嚴(yán)重,在較低劑量時(shí),[C14mim]BF4即可引起肝細(xì)胞脂肪變性或壞死。究其原因,可能與肝臟是外源性化合物或毒物在體內(nèi)代謝與解毒的主要場(chǎng)所有關(guān)[20]。由此可見,肝臟是咪唑型ILs毒性作用的主要靶器官[21],心、肺、腎也有可能是ILs攻擊的靶器官。

文獻(xiàn)資料表明,咪唑型ILs的毒性雖然主要取決于陽離子類型,但陰離子對(duì)其毒性也有一定的影響[22-23]。文獻(xiàn)[24]發(fā)現(xiàn),ILs ([C4mim]Br、 [C4mim]Cl、[C4mim]BF4)對(duì)斜紋夜蛾9(Sf-9)細(xì)胞系的細(xì)胞毒性與陰離子有關(guān),BF4-由于在高濃度下可被水解成HF,更容易進(jìn)入細(xì)胞,因此比Br-和Cl-更具細(xì)胞毒性;文獻(xiàn)[25]發(fā)現(xiàn)[Omim]BF4染毒可引起蚯蚓機(jī)體內(nèi)細(xì)胞膜通透性增加,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂與活性氧(ROS)過量積累,造成氧化損傷;文獻(xiàn)[26]報(bào)道在急性暴露下,[Bmim]BF4會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)ROS過度產(chǎn)生,引起脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致肝臟損傷。

以上表明,肝臟在抵御咪唑型ILs毒性損傷中發(fā)揮了重要的作用[27]。[C14mim]BF4對(duì)大鼠肝臟急性損傷的機(jī)理以及BF4-在其中所起的作用將在今后的工作中進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本文研究發(fā)現(xiàn)[C14mim]BF4對(duì)大鼠的LD50值為249.8 mg/kg,屬于中等毒性。病理學(xué)結(jié)果顯示,肝臟是 [C14mim]BF4對(duì)大鼠毒性作用的主要靶器官。