張 超, 施 洋, 劉 詠, 張 強(qiáng), 王軍輝

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.功能性復(fù)合調(diào)味品安徽省重點實驗室,安徽 界首 236500)

三棱(RhizomaSparganii)是我國中藥界常用的一味中藥,屬于被子植物門(Angiospermae),單子葉植物綱(Monocotyledoneae),禾本目(Poales),黑三棱科(SparganiaceaeHanin)[1]。其味辛、苦,性平,具有破瘀、行氣、消積、止痛等功效,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、胸痹心痛、瘀血經(jīng)閉、食積脹痛等病癥,同時作為抗癌藥物在醫(yī)學(xué)上也得以應(yīng)用[2]。研究表明,三棱中含有有機(jī)酸、多糖、甾醇類、揮發(fā)油、黃酮類和礦物鹽等豐富的化學(xué)成分,其中多糖的含量尤為豐富,是三棱中的主要活性化學(xué)成分[3]。多糖作為一種免疫調(diào)節(jié)劑,在免疫功能的調(diào)節(jié)、癌癥的診斷與治療、抗衰老及解除機(jī)體疲勞等方面都有著重要作用[4]。目前關(guān)于三棱多糖的理化特性及活性的研究較少,僅有一些關(guān)于三棱中化學(xué)成分的提取以及中藥三棱藥理研究方面的報道[5-7]。

有文獻(xiàn)報道,從材料中不同部分所獲得的多糖在理化性質(zhì)、活性等方面存在差異[8]。為了深入了解三棱中多糖的組成及特性,本文在課題組前期工作基礎(chǔ)上,采用熱水、螯合劑、1.0 、4.0 mol/L NaOH 4種溶劑從三棱根莖中依次獲得了三棱熱水提多糖(RSB)、三棱螯合劑提多糖(RSC)、三棱稀堿提多糖(RSDA)、三棱濃堿提多糖(RSCA)4種多糖組分,并進(jìn)一步采用物理和化學(xué)方法檢測各多糖片段的理化特性并比較其活性差異,為三棱多糖的精細(xì)化加工及資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中藥三棱(購自河北省安國同源堂)經(jīng)高速藥物粉碎機(jī)粉碎,用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫色脫脂后烘干備用。其他試劑有三氯甲烷、NaCl、正丁醇、KBr、苯酚、硫酸、考馬斯亮藍(lán)G250、抗壞血酸(Vc)、FeSO4、水楊酸、ABTS、FeCl2、醋酸、DPPH試劑、二甲基亞砜、乙酸酐、吡啶、過氧化氫、EDTA-Na2等。

1.2 三棱多糖的提取

秤取100 g中藥三棱粉末,按料液比1∶30熱水提取3 h。提取液經(jīng)過濾(殘渣收集)、濃縮、離心、醇沉后得到多糖沉淀。將沉淀復(fù)溶于蒸餾水中,用Sevag試劑(V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=1∶5～1∶4)脫蛋白后并以自來水透析3 d,去離子水透析2 d,將透析液凍融、離心、冷凍干燥得到RSB,多糖得率為0.5%。

熱水提殘渣用0.05 mol/L EDTA和0.05 mol/L草酸鈉溶液在pH值為5.8,100 ℃的條件下提取2 h,按照上述實驗步驟操作得到RSC,多糖得率為1.2%。

螯合劑提取殘渣在1.0 mol/L NaOH/20 mmol/L NaBH4溶液中室溫下提取2 h,用醋酸中和濾液后按照上述實驗步驟得到RSDA,多糖得率為5.7%。

1 mol/L堿提殘渣在4 mol/L NaOH/20 mmol/L NaBH4溶液中室溫下提取2 h,用醋酸中和濾液后同樣按照上述實驗方法得到RSCA,多糖得率為2.8%。

1.3 三棱多糖理化性質(zhì)分析

1.3.1 化學(xué)成分測定

參照文獻(xiàn)[9-10],將多糖轉(zhuǎn)化成糖醇乙酸酯后進(jìn)行氣相色譜(gas chromatography,GC)分析。檢測條件設(shè)定如下:N2流速為20 mL/min,H2流速為30 mL/min,空氣流速為200 mL/min,柱溫230 ℃,檢測器溫度250 ℃,氣化室溫度280 ℃。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單糖的滯留時間判定多糖樣品的單糖組成,以峰面積計算各單糖的摩爾分?jǐn)?shù)。

三棱多糖摩爾分?jǐn)?shù)采用苯酚硫酸法測定[11],蛋白質(zhì)摩爾分?jǐn)?shù)采用考馬斯亮藍(lán)法檢測[12],糖醛酸摩爾分?jǐn)?shù)采用咔唑法進(jìn)行檢測[13]。

1.3.2 熱特性分析

稱取5 mg干燥樣品,利用熱重分析儀(thermal gravimetric analyzer,TGA)對提取的多糖樣品進(jìn)行分析。設(shè)定溫度范圍為35～800 ℃,加熱速率為10 ℃/min,保護(hù)氣(N2)流量為50 mL/min,吹掃氣(O2、N2)流量為20 mL/min。

1.3.3 紅外光譜分析

稱取待測多糖樣品1 mg同溴化鉀充分研磨后,在紅外燈下加熱、壓片。將制備好的透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)中掃描,掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.4 三棱多糖顯微結(jié)構(gòu)測定

使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope,FESEM)測定三棱多糖的顯微結(jié)構(gòu)。將樣品處理后固定在載玻片上于5 kV電壓下觀察多糖的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 生物活性測定

1.4.1 抗氧化活性

依據(jù)文獻(xiàn)所提到的方法設(shè)定不同質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液[14-16],分別測定多糖對DPPH自由基、羥基自由基以及ABTS自由基清除的能力。

1.4.2 免疫調(diào)節(jié)活性

將小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中置于37 ℃,5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至1.0×105個/mL,取150 μL細(xì)胞液于96孔板中,貼壁培養(yǎng)24 h,加入50 μL質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200、500 μg/mL的多糖溶液,培養(yǎng)24 h后分別加入20 μL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT試劑,混勻,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,移去上清液,加入200 μL DMSO,振蕩10 min后用酶標(biāo)儀在570 nm下測定吸光度值。

為測定RAW264.7細(xì)胞的NO產(chǎn)生量,用DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至1.0×105個/mL。取150 μL細(xì)胞液于96孔板中,培養(yǎng)24 h后分別加入50 μL質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200、500 μg/mL的多糖溶液,培養(yǎng)24 h后分別取100 μL細(xì)胞上清液于96孔板中,向板中加入Griess試劑,靜置10 min后用酶標(biāo)儀在540 nm下測定吸光度值。

同樣按照上述實驗方法,移除已培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞上清液,用PBS清洗后加入100 μL中性紅染色液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,移除多余的中性紅溶液,PBS沖洗2次,加入細(xì)胞裂解液,放置1 h后用酶標(biāo)儀在540 nm下測定吸光度值。

空白對照組為DMEM培養(yǎng)基,正對照為脂多糖(LPS),每組實驗均有6個復(fù)孔。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.1軟件繪制圖表,利用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,*表示P<0.05差異顯著,**表示P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 三棱多糖的理化特性分析

三棱多糖的化學(xué)成分分析結(jié)果見表1所列。由表1可知,4種組分的化學(xué)成分差異顯著。其中RSB、RSC、RSDA、RSCA的總碳水化合物摩爾分?jǐn)?shù)分別為54.51%、70.01%、85.36%、88.44%,糖醛酸摩爾分?jǐn)?shù)為5.43%、3.16%、0.59%、0.38%。與RSB和RSC相比,堿提組分中的蛋白質(zhì)摩爾分?jǐn)?shù)更低,其中在RSCA中未檢測到蛋白質(zhì)的存在。單糖組成分析結(jié)果表明RSB與RSC中均含有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖4種單糖,其中葡萄糖摩爾分?jǐn)?shù)最高,分別為84.85%和78.89%。堿提組分RSDA中含有16.53%的甘露糖,但在RSB與RSC中未檢測到甘露糖存在,推測可能由于在堿性環(huán)境下,破壞了三棱中細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),使得細(xì)胞壁中的甘露糖成分溶于提取液中。堿提組分(RSDA、RSCA)中未檢測到鼠李糖存在,且4種組分中均不含有半乳糖。

表1 三棱多糖化學(xué)成分及其摩爾分?jǐn)?shù) 單位:%

三棱多糖的FTIR譜圖如圖1所示。

圖1 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的FTIR譜圖

從圖1可以看出,4種組分均有顯著的多糖結(jié)構(gòu)。根據(jù)文獻(xiàn)資料對各樣品吸收峰進(jìn)行分析[17-20],在3 400 cm-1處的吸收峰為糖環(huán)的O—H伸縮振動,2 925 cm-1處的吸收峰歸因于—CH2—基團(tuán)的C—H伸縮振動,1 420～1 385 cm-1處的吸收峰歸因于C—H的變角振動,1 073 cm-1處歸因于吡喃糖環(huán)中C=O伸縮和變角振動。此外,RSB與RSC在1 740 cm-1處有明顯的吸收峰,說明這2種多糖中含有糖醛酸。

多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA在同一放大倍數(shù)下的微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的FESEM圖

從圖2可以看出，RSB與RSC在放大200倍條件下呈現(xiàn)出塊狀或片狀結(jié)構(gòu),而堿提組分則呈現(xiàn)出疏松的孔狀或網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)?？赡茉趬A性環(huán)境下多糖間化學(xué)鍵被破壞,其表面形態(tài)呈多孔狀網(wǎng)絡(luò)布局。該結(jié)構(gòu)與水提組分相比更加疏松,且多糖的穩(wěn)定性更容易受到外界環(huán)境因素影響。

4種組分的熱重(thermogravimetric,TG)分析曲線如圖3所示,從圖3可看出,熱分解的第1階段主要集中在35～175 ℃,RSB、RSC、RSDA、RSCA在此階段中主要損失為多糖中的結(jié)合水以及易熱分解化合物,質(zhì)量損失率依次為11.64%、11.03%、5.41%、9.03%,其中RSB分解速率最快,RSDA分解速率最慢;熱分解的第2階段為175～800 ℃,在該階段中4種多糖的化學(xué)鍵被破壞,多糖因高溫分解,RSB、RSC、RSDA、RSCA在此階段中的質(zhì)量損失率依次為66.44%、68.68%、72.51%、73.45%。比較4種組分的熱重分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)RSB與RSC質(zhì)量損失速度開始減緩時的溫度要高于RSDA、RSCA組分,說明多糖RSB、RSC比堿提組分(RSDA、RSCA)的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。這可能是由于堿提多糖中聚合物含量較低,存在大量短鏈糖以及多側(cè)鏈糖且結(jié)構(gòu)比水提組分更加疏松，從而使多糖更易受熱分解。

圖3 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的TG分析

2.2 三棱多糖的活性分析

2.2.1 抗氧化活性研究

三棱多糖的抗氧化活性結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出,4種多糖組分的抗氧化活性均呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性,且活性大小隨著多糖質(zhì)量濃度增加而增大,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時自由基清除率達(dá)到最高。通過比較4種多糖的抗氧化活性結(jié)果可以看出,RSB在DPPH自由基(圖4a)、羥基自由基(圖4b)、ABTS自由基(圖4c)的清除能力上均表現(xiàn)最佳,最高自由基清除率依次可達(dá)到81.47%、80.80%、52.57%。而RSCA的抗氧化活性在4種組分中表現(xiàn)最差,最高自由基清除率依次為61.21%、63.24%、37.52%。RSDA組分在ABTS自由基的清除能力上略高于RSC組分,但在DPPH自由基與羥基自由基的活性數(shù)據(jù)上低于RSC組分?？傮w而言,多糖RSB、RSC與堿提組分(RSDA和RSCA)相比具有更高的抗氧化活性。推測堿性環(huán)境下多糖的結(jié)構(gòu)可能被破壞,從而導(dǎo)致4種組分的抗氧化活性結(jié)果產(chǎn)生顯著差異。

圖4 多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA的抗氧化活性

2.2.2 免疫活性分析

多糖組分RSB、RSC、RSDA、RSCA的免疫調(diào)節(jié)活性結(jié)果如圖5所示。從圖5a可以看出，當(dāng)多糖在不同質(zhì)量濃度條件下，4種組分對巨噬細(xì)胞的增殖活性有不同的影響。其中RSDA與RSCA的細(xì)胞增殖活性呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性，增殖指數(shù)隨著質(zhì)量濃度的升高而增大，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL時，其對應(yīng)的增殖指數(shù)達(dá)到最大值，分別為1.61、1.49。RSB與RSC對巨噬細(xì)胞增殖活性的影響呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為200 μg/mL時,增殖指數(shù)達(dá)到最大值，分別為1.56、1.51。

圖5 4種多糖組分對巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫活性的影響

從圖5b可以看出，多糖組分RSC、RSDA與RSCA的NO釋放量在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性，隨著質(zhì)量濃度的升高NO釋放量增加，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL時NO釋放量達(dá)到最大值，分別為3.21、3.56、2.68。RSB的NO釋放量在各質(zhì)量濃度條件下均高于其他3組，在多糖質(zhì)量濃度為200 μg/mL時NO釋放量達(dá)到最大值為3.62。從圖5c可以看出，4種多糖組分均在不同程度上促進(jìn)了巨噬細(xì)胞RAW264.7對中性紅的吞噬能力。RSC與RSCA對巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢，在多糖質(zhì)量濃度為100 μg/mL時吞噬活性最佳，而RSB與RSDA在多糖質(zhì)量濃度為200 μg/mL時表現(xiàn)出最佳的吞噬活性。

通過比較多糖組分RSB、RSC、RSDA、RSCA的免疫活性結(jié)果,發(fā)現(xiàn)堿提組分RSDA與水提組分RSB對巨噬細(xì)胞的免疫活性影響要優(yōu)于其他2種組分,其中堿提組分RSDA的效果最佳。細(xì)胞的生物活性與多糖的分子量、支化度、化學(xué)結(jié)構(gòu)和鏈構(gòu)象等因素有關(guān)[21]。而與水提組分相比堿提多糖中聚合物含量低,短鏈糖以及小分子多糖等化合物含量較高,由于在不同的提取條件下所獲得的多糖組分的分子量、化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性不同,因此4種組分對巨噬細(xì)胞免疫活性的影響存在差異。

3 結(jié) 論

本實驗通過順序提取法,從中藥三棱粉末中提取出4種多糖組分RSB、RSC、RSDA、RSCA，并對其理化性質(zhì)及活性進(jìn)行研究。理化性質(zhì)結(jié)果表明，4種多糖組分均由阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖以及葡萄糖組成，其中葡萄糖為多糖RSB、RSC、RSCA的主要成分，摩爾分?jǐn)?shù)分別為84.85%、78.89%、86.51%。RSB、RSC比堿提組分(RSDA和RSCA)的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定且熱穩(wěn)定性更好。活性分析結(jié)果表明:4種多糖對DPPH自由基、羥基自由基以及ABTS自由基有清除作用，其中RSB的抗氧化活性最顯著，最高自由基清除率依次為81.47%、80.80%、52.57%；同時多糖RSB、RSC、RSDA、RSCA均能有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞的免疫活性，多糖的化學(xué)成分及熱特性差異可能對活性有影響。研究結(jié)果有助于認(rèn)識三棱多糖更深層次研究價值，為中藥三棱精深利用提供參考。