朱 寧，馬曉珊，陳春麗，黎國(guó)仙，楊秀娟，謝 東*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院藥學(xué)科，廣東 佛山 528244；2. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510282)

帕金森疾病(Parkinson′s disease,PD)是目前世界排名第二的神經(jīng)元變性疾病，已嚴(yán)重危及老年人的生命健康[1]。目前PD的臨床治療主要為多巴胺替代治療，如左旋多巴能夠在一定程度上減輕PD患者的癥狀，但其并不能夠阻止疾病的進(jìn)程，且治療時(shí)患者會(huì)對(duì)藥物的敏感性降低[2-3]。因此，亟待探尋新的藥物研發(fā)以減緩PD疾病進(jìn)程。京尼平苷(geniposide,GP)的主要藥效成分為中藥梔子。有研究顯示其能夠透過(guò)用于阿爾茨海默病的治療，并能夠通過(guò)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4-6]。自噬是依賴溶酶體體內(nèi)異常蛋白以及受損細(xì)胞器降解的一種分解機(jī)制。研究證實(shí)細(xì)胞自噬途徑的調(diào)控異常，例如磷酸腺苷依賴的蛋白激酶/mTOR(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase/mTOR,AMPK/mTOR)信號(hào)通路調(diào)控，在PD疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用[7-8]。但是目前關(guān)于GP是否能夠通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抑制帕金森模型氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡及自噬的作用還尚不清楚。本研究使用1-甲基4-苯基-四氫吡啶離子(1-methyl-4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPP+)預(yù)處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建PD細(xì)胞模型，探究GP對(duì)PD細(xì)胞模型的細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷及自噬的影響，并進(jìn)一步探究GP是否通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路調(diào)控PD細(xì)胞模型的細(xì)胞凋亡及自噬。

1 材料與方法

1.1材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y購(gòu)自于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。MPP+、兔抗AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、LC3B單克隆抗體、大鼠抗β-actin單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔與兔抗大鼠二抗均購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、胰酶、青鏈霉素混合液及RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自于美國(guó)Gibco公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒及BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于英國(guó)Abcam公司；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性檢測(cè)試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測(cè)試劑盒及購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司；Efficient chemiluminescence(ECL)化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Millipore公司；AMPK激動(dòng)劑Metformin及mTOR抑制劑Rapamycin購(gòu)自于美國(guó)Cell signaling technology公司；京尼平苷(≥98%)購(gòu)自于成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將SH-SY5Y細(xì)胞置于含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640培養(yǎng)基中，在5% CO2條件下的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，每3～4 d更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)，1∶3胰酶消化傳代，取3～7代生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2篩選最適MPP+濃度及作用時(shí)間以建立急性PD細(xì)胞損傷模型 取適量MPP+溶于細(xì)胞培養(yǎng)液中，終濃度調(diào)整為1 mmol/L，0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾除菌，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取處于指?shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)12 h，取不同終濃度(0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L)的MPP+添加至細(xì)胞培養(yǎng)板中作用24 h，及1 mmol/L MPP+添加至細(xì)胞培養(yǎng)板中作用不同時(shí)間(0 h、6 h、12 h、24 h及48 h)，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)添加試劑后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)不同濃度MPP+處理后細(xì)胞的吸光度，以0 mmol/L為對(duì)照，計(jì)算分析細(xì)胞活力。

1.2.3試驗(yàn)分組及處理 ①對(duì)照(Control)組：正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，無(wú)任何特殊處理；②MPP+組：?jiǎn)为?dú)使用1 mmol/L MPP+進(jìn)行處理的SH-SY5Y細(xì)胞；③GP 組：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，單獨(dú)使用100 μmol/L GP進(jìn)行處理SH-SY5Y細(xì)胞；④MPP+聯(lián)合GP處理組(MPP++GP)：使用1 mmol/L MPP+進(jìn)行SH-SY5Y細(xì)胞的預(yù)處理，培養(yǎng)24 h后添加100 μmol/L GP。

上述各組細(xì)胞均置于5% CO2條件下的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 48 h后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。此外，分別采用AMPK激動(dòng)劑Metformin(Met)及mTOR抑制劑Rapamycin(Rap)處理MPP+組及MPP++GP組，明確GP是否通過(guò)AMPK/mTOR通路影響MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的增殖及自噬能力。

1.2.4CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性 將各組細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h；待檢測(cè)前4 h棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，使用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌3次，每孔加入10 μL 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(cell counting kit-8,CCK-8)混勻，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)細(xì)胞吸光度，計(jì)算分析細(xì)胞的增殖活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/mL，使用預(yù)冷磷酸緩沖液漂洗細(xì)胞，加入100 μL Binding buffer溶液重懸細(xì)胞，隨后依次加入5 μL Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)及10 μL 碘化丙啶染色液(propidium iodide,PI)，于室溫條件下避光染色處理15 min，隨即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 收集上述待測(cè)細(xì)胞，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別按照LDH試劑盒、SOD試劑盒及MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞的LDH表達(dá)、SOD活性以及MDA含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7LC3蛋白定位 將生長(zhǎng)條件良好的SH-SY5Y細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，并按2×105個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔板中，使用不含抗生素及血清的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染試劑PEI的稀釋?zhuān)覝胤胖? min；向混合液中加入1 μg GFP-LC3質(zhì)粒DNA混勻，室溫放置15 min；將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，常規(guī)條件培養(yǎng)6 h并更換新鮮培養(yǎng)基；按方法1.2.3進(jìn)行細(xì)胞處理及分組，培養(yǎng)48 h后，室溫條件下加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min；加入0.1 mg/L DAPI染液，室溫條件下染色2 min，PBS洗滌細(xì)胞一次后封片，最后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光。

1.2.8Western blot 取上述各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，混勻并收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中，BCA法測(cè)定蛋白濃度，100 ℃水浴加熱10 min，12 000 r/min離心10 min；配置相應(yīng)濃度的濃縮膠，將蛋白樣品及Maker依次上樣后60 V電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)整為110 V繼續(xù)電泳至樣品達(dá)分離膠底部。使用甲醇激活過(guò)的聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜。結(jié)束后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h；分別使用稀釋好的AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、LC3B(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000)一抗孵育至PVDF膜上，置于濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜，回收一抗并使用TBST洗膜3次，每次10 min；使用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶二抗室溫條件下孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；按照ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白質(zhì)顯色，置于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行，使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料多組間差異比較采用F檢驗(yàn)，組間差異多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的作用 CCK-8法檢測(cè)MPP+處理后SH-SY5Y細(xì)胞活性，結(jié)果顯示隨著MPP+作用濃度的增加，SH-SY5Y細(xì)胞活力呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，其中1.0 mmol/L、2.5 mmol/L及5.0 mmol/L濃度MPP+作用后SH-SY5Y細(xì)胞活力相較于0 mmol/L顯著降低(P<0.01)，鑒于2.5 mmol/L及5.0 mmol/L濃度的MPP+作用后SH-SY5Y細(xì)胞活力下降至50%以下，因此本研究選擇1.0 mmol/L作為MPP+的給藥濃度。隨后再次應(yīng)用CCK-8進(jìn)一步明確MPP+的最佳作用時(shí)間，結(jié)果顯示隨MPP+作用時(shí)間的延長(zhǎng)，SH-SY5Y細(xì)胞活力也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，其中1 mmol/L的MPP+作用細(xì)胞12 h、24 h及48 h后SH-SY5Y細(xì)胞活力相較于0 h顯著降低(P<0.01)，鑒于1.0 mmol/L濃度的MPP+作用48 h后SH-SY5Y細(xì)胞活力也下降至50%以下。因此本研究應(yīng)用1 mmol/L的MPP+處理細(xì)胞24 h作為最佳條件進(jìn)行構(gòu)建急性PD細(xì)胞模型，見(jiàn)表1～2。

表1 不同濃度MPP+處理后SH-SY5Y細(xì)胞活性變化 Table 1 Changes in SH-SY5Y cell viability after treatment with different concentrations of MPP+

表2 1.0 mmol/L MPP+處理不同時(shí)間下SH-SY5Y細(xì)胞活性變化Table 2 Changes of SH-SY5Y cell viability at different time of 1.0 mmol/L MPP+ treatment

2.2GP抑制MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的作用 流式細(xì)胞檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，相較于Control組，MPP+組及MPP++GP組的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01)，GP組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；相較于MPP+組，MPP++GP組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率均顯著減少(P<0.01)。 見(jiàn)圖1，表3。

圖1 京尼平苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖A.對(duì)照組；B.MPP+組；C.GP組；D.MPP++GP組Figure 1 Flow cytometry of geniposide on the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by MPP+

表3 京尼平苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的影響Table 3 Effect of geniposide on the apoptosis rate of SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.3京尼平苷減輕MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用 相較于Control組，MPP+組LDH活性及MDA含量顯著增加(P<0.01)，且SOD活性顯著降低(P<0.01)，而GP組及MPP++GP組的LDH、SOD活性及MDA含量均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；相較于MPP+組， MPP++GP組LDH活性及MDA含量顯著降低(P<0.01)，SOD活性顯著增加(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 京尼平苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分泌LDH、SOD活性及MDA含量的影響Table 4 Effect of geniposide on the secretion of LDH,SOD and MDA content in SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.4京尼平苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬的作用 熒光染色結(jié)果顯示，與Control組細(xì)胞相比，MPP+組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光聚集點(diǎn)明顯增加，GP組及MPP++GP組無(wú)明顯變化。與MPP組比較，MPP++GP組細(xì)胞綠色熒光聚集現(xiàn)象明顯降低(圖2)。

圖2 外源性表達(dá)GFP-LC3后觀察GP對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬的影響(綠色熒光為GFP-LC3染色，藍(lán)色熒光為DAPI染色，×400，標(biāo)尺為10 μm)Figure 2 Effectof GP on MPP+ induced autophagy in SH-SY5Y cells after exogenous expression of GFP-LC3 (Green fluorescence is GFP-LC3 staining, blue fluorescence is DAPI staining, ×400, scar bar=10 μm)

2.5GP對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的作用 相較于Control組，MPP+組細(xì)胞中自噬標(biāo)記分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及AMPK/mTOR信號(hào)通路中AMPK蛋白磷酸化水平均顯著增高(P<0.01)，而mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.01)，GP組及MPP++GP組的細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、AMPK及mTOR磷酸化水平間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；相較于MPP+組，GP組及MPP++GP組自噬標(biāo)記分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及AMPK/mTOR信號(hào)通路中AMPK蛋白磷酸化水平均顯著降低(P<0.01)，而mTOR蛋白磷酸化水平顯著增高(P<0.01)。Western blot結(jié)果見(jiàn)圖3，表5。

圖3 GP對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot圖Figure 3 Western blot of MPP+ induced autophagy-related protein expression in SH-SY5Y cells induced by GP

表5 GP對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Table 5 Effect of MPP+ induced autophagy-related protein expression in SH-SY5Y cells induced by GP

2.6GP通過(guò)AMPK/mTOR通路調(diào)控MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬 Western blot結(jié)果顯示，在添加AMPK激動(dòng)劑Met或mTOR抑制劑Rap后，與MPP+組比較，MPP++Met組或MPP++Rap組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與p-MAPK磷酸化水平明顯增加(P<0.01)，mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.01)；而與MPP++GP組比較，MPP++GP+Met組或MPP++GP+Rap組細(xì)胞中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與p-MAPK磷酸化水平明顯增加(P<0.01)，mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.01)。Western blot結(jié)果見(jiàn)圖4，表6。

圖4 添加Met或Rap后GP對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot圖A.添加Met后檢測(cè)結(jié)果；B.添加Rap后檢測(cè)結(jié)果Figure 4 Western blot of autophagy-related protein expression in SH-SY5Y cells induced by MPP+ after GP treatment after adding Met or Rap

表6 添加Met或Rap后GP對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Table 6 Effect of autophagy-related protein expression in SH-SY5Y cells induced by MPP+ after GP treatment after adding Met or Rap

3 討 論

PD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，臨床用于治療PD的藥物主要包含左旋多巴、抗膽堿藥及多巴胺受體激動(dòng)劑等。由于上述藥物應(yīng)用于臨床會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，例如低血壓、惡心嘔吐及不自主運(yùn)動(dòng)等[9]，因此探究新型治療藥物對(duì)PD的神經(jīng)保護(hù)作用十分重要。MPP+能夠引起神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷以及細(xì)胞凋亡的神經(jīng)毒性，因此常作為帕金森細(xì)胞模型的誘導(dǎo)劑[10]。所以本研究首先利用MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建了PD細(xì)胞模型，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞活力明顯下降，且細(xì)胞凋亡率明顯增高，氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重，表明成功制備了PD細(xì)胞模型，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。PD的發(fā)病與細(xì)胞自噬密切相關(guān)，而細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白及受損細(xì)胞器均由大自噬降解，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞中的自噬活性來(lái)找尋PD的治療潛在靶點(diǎn)，將是未來(lái)的研究熱點(diǎn)。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其參與細(xì)胞增殖、凋亡及自噬等多種生物學(xué)過(guò)程。且mTOR蛋白的磷酸化水平變化能夠調(diào)控下游的自噬信號(hào)激活途徑。當(dāng)mTOR蛋白的磷酸化水平增加時(shí)，mTOR信號(hào)通路被激活，則細(xì)胞自噬受到抑制[11-12]。AMPK是mTOR的上游信號(hào)通路，且AMPK能夠抑制mTOR，進(jìn)而間接激活細(xì)胞自噬。AMPK主要通過(guò)兩種途徑參與細(xì)胞自噬的調(diào)控，一是AMPK可以直接磷酸化mTOR的抑制蛋白，促進(jìn)自噬；二是直接磷酸化Raptor，進(jìn)而激活自噬[13]。Arsikin等[14]研究發(fā)現(xiàn)藥物能夠通過(guò)AMPK抑制mTOR，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，最終造成PD細(xì)胞模型的細(xì)胞毒性作用。而本研究發(fā)現(xiàn)MPP+藥物誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞后，發(fā)生了AMPK磷酸化水平的增加并伴隨著mTOR磷酸化水平的抑制，這提示MPP+介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬中存在AMPK/mTOR信號(hào)通路的參與。

GP是一類(lèi)環(huán)烯醚萜葡萄糖苷，是梔子的主要藥效成分。有研究表明GP對(duì)心血管疾病及中樞神經(jīng)疾病治療效果顯著之外，還具有一定的抗炎及抗軟組織損傷的作用[15-16]。同時(shí)，近年來(lái)有研究證實(shí)，GP對(duì)帕金森動(dòng)物模型具有神經(jīng)保護(hù)作用[17]。為了進(jìn)一步確認(rèn)GP對(duì)PD細(xì)胞模型氧化應(yīng)激及凋亡的調(diào)控作用，本研究使用GP處理MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的PD細(xì)胞模型，結(jié)果表明使用GP藥物處理后的PD細(xì)胞模型凋亡率明顯降低。探究細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用時(shí)，本研究檢測(cè)了處理后細(xì)胞中MDA含量、SOD及LDH活性的變化。LDH活性能夠反映出細(xì)胞膜發(fā)生損傷的嚴(yán)重程度；MDA含量能夠間接反映出機(jī)體受到自由基攻擊的程度；而SOD活性能夠間接反映出機(jī)體清除自由基的能力；上述三種指標(biāo)常用于評(píng)估細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)添加GP處理后，MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞上清液中LDH活性及MDA含量明顯降低，SOD活性明顯升高。同時(shí)GP能夠抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的AMPK磷酸化，激活mTOR的磷酸化，且顯著的修復(fù)了這些細(xì)胞自噬調(diào)控蛋白的磷酸化水平。表明GP能夠降低MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，并且能夠通過(guò)阻斷自噬調(diào)節(jié)中的AMPK/mTOR信號(hào)通路，發(fā)揮抑制細(xì)胞自噬的作用。

本研究為了進(jìn)一步確認(rèn)GP抑制細(xì)胞自噬依賴于AMPK/mTOR信號(hào)通路，分別利用AMPK激動(dòng)劑Metformin及mTOR抑制劑Rapamycin進(jìn)行MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的處理。結(jié)果顯示，GP處理后細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)水平降低，AMPK磷酸化水平降低，而mTOR磷酸化水平上升。而Metformin或Rapamycin能夠明顯加劇MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的自噬水平，表現(xiàn)出LC3-II表達(dá)水平上升，AMPK磷酸化水平上升，而mTOR磷酸化水平降低。表明GP能夠通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路調(diào)控PD細(xì)胞自噬，且AMPK激動(dòng)劑Metformin及mTOR抑制劑Rapamycin在一定程度上能夠激活PD細(xì)胞自噬。但是有研究證明自噬在PD中能夠起到保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用[21-23]。自噬是一把雙刃劍，自噬的啟動(dòng)能夠有助于神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)的維持，繼而減少繼發(fā)性損傷；但自噬的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，進(jìn)而加速神經(jīng)元變性的進(jìn)程。因此后續(xù)還需要繼續(xù)探究GP對(duì)PD自噬水平的調(diào)控作用，同時(shí)探究AMPK激動(dòng)劑Metformin及mTOR抑制劑Rapamycin對(duì)帕金森細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制。

綜上所述，GP能夠通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路調(diào)控MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡、自噬及氧化應(yīng)激過(guò)程。本研究結(jié)果能夠?yàn)檎覍ぐ踩腋咝е委烶D疾病的藥物提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。