孫紅星，竇永青，韓 梅*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

組織切片作為醫(yī)學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)方法，保存良好的組織形態(tài)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)重要的前提，最常見的是石蠟切片和冰凍切片兩種類型。石蠟切片雖然可以使組織表現(xiàn)出良好形態(tài)[1]，但脫水、透明等中間環(huán)節(jié)中的有機(jī)試劑會(huì)使組織樣品中的蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的變性，而冰凍切片可以更好的保持組織細(xì)胞抗原的活性而被廣泛應(yīng)用[2]。冰凍切片主要應(yīng)用于一些組織化學(xué)方法和免疫組織化學(xué)方法、臨床手術(shù)的快速病理診斷等。冰凍切片的質(zhì)量受多種因素的影響，如取材手法、冰凍方法、切片方法等，其中凍存方法[3]或冰凍速度[4]對(duì)組織有明顯的影響。然而，對(duì)于不同肌性組織(如骨骼肌、心肌和平滑肌)標(biāo)本最適宜的冰凍條件尚無比較性研究證據(jù)。常用的組織標(biāo)本冰凍有三種方式：①將組織直接投放到液氮中(簡(jiǎn)稱液氮浸入法)，使其快速冷凍；②將組織放入錫紙托中，漂浮于液氮上(簡(jiǎn)稱液氮漂浮法)，使其以慢于液氮浸入法的速度冷凍；③將組織直接置于-80 ℃冰箱(簡(jiǎn)稱直接-80 ℃法)，使其以更慢的速度冷凍。本研究通過切片蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色對(duì)比這三種方法處理的骨骼肌、平滑肌和心肌組織形態(tài)差異，以期能夠得出不同肌性組織冰凍方法的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為鼠齡8～12周的C57BL/6野生小鼠。飼養(yǎng)于溫度濕度恒定的獨(dú)立通氣籠盒系統(tǒng)中，標(biāo)準(zhǔn)鼠糧飼養(yǎng)，飲水為純凈水，自由進(jìn)食水。環(huán)境采用12 h明暗循環(huán)，7:00～19:00照明，19:00～次日7:00無照明。

本研究所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑和儀器 手術(shù)器械(剪刀，鑷子，止血鉗，紗布)均經(jīng)121 ℃，高壓滅菌30 min，冰凍切片OCT包埋劑 (Leica)，冰凍切片機(jī)(LEICA CM 1950)，刀片(LEICA 819)，載玻片，蓋玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)，中性樹膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇，二甲苯，HE染液，正置顯微鏡(LEICA DM 2000 LED)。

錫紙托的制作：用適量錫紙(深圳市都利實(shí)業(yè)有限公司)做成一定厚度的近似桶狀的托，透明膠帶粘牢且保證無漏洞，用金屬絲穿過錫紙托上方打好的等距三個(gè)孔起到平衡和固定作用。

1.3組織取材

1.3.1腓腸肌取材 用4%水合氯醛麻醉小鼠后，將小鼠置于解剖板上，四肢固定。鈍性分離后取下完整腓腸肌放到OCT包埋劑中，保持位置豎直使切片時(shí)可以得到其橫截面。

1.3.2心臟取材 剪開胸腔，暴露心臟，將右心房剪破，用掛在2 m高處與輸液瓶相連的輸液針頭刺入左心室，灌入約50 mL于4 ℃預(yù)冷的生理鹽水，以沖洗血液。灌流后取下完整心臟放到OCT包埋劑中，切片時(shí)從心尖切起，待有明顯心腔的位置留下切片。

1.3.3胸主動(dòng)脈取材 灌流后剪下相應(yīng)位置血管，為避免人為用力撕扯血管改變結(jié)構(gòu)，未剝離周圍組織，將其放到OCT包埋劑中，切片時(shí)留取血管的橫截面，即完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)。

1.4條件處理

1.4.1液氮浸入法 將5塊組織包埋好后鑷子夾住，直接接觸液氮并緩慢投入液氮中，包埋劑10～20 s后凝固變白即為凍實(shí)。隨后放入-80 ℃冰箱。

1.4.2液氮漂浮法 將5塊包埋好的組織放入錫紙托，提起金屬絲放入液氮，錫紙托直接接觸液氮，組織非直接接觸。包埋劑凍實(shí)比液氮浸入法緩慢，待完全凝固變白即為凍實(shí)，隨后投入液氮中暫存再放入-80 ℃冰箱。

1.4.3直接-80 ℃法 將5塊包埋好的組織直立放在-80 ℃冰箱里，凍存過夜。

1.5切片方法 所用儀器為L(zhǎng)eica冰凍切片機(jī)。將冰凍切片機(jī)待機(jī)狀態(tài)調(diào)整為工作狀態(tài)，箱體溫度，刀頭溫度設(shè)定為-20 ℃，同時(shí)將鑷子、刀片、毛筆等放入箱體內(nèi)預(yù)冷。待達(dá)到指定溫度后，將組織塊安裝到組織夾持器上，調(diào)整好刀片與組織塊的距離和角度。先用舊刀片進(jìn)行組織粗修，厚度為40 μm，看到明顯的組織暴露后，換用鋒利的新刀片進(jìn)行切片，切20片，切下的完整無褶皺的組織薄片迅速的貼附在干凈載玻片上，并做好標(biāo)記。

1.6HE染色 將切片復(fù)水后置于蘇木素染液2 min，水洗2 min，用1%鹽酸乙醇分化15 s，水洗2 min，伊紅染液3 s，水洗1 min，70%乙醇2～3 s，80%乙醇2～3 s，90%乙醇2～3 s，95%乙醇5 min，100%乙醇5 min，二甲苯透明后中性樹膠封片。

1.7圖像采集及研究指標(biāo) 用正置光學(xué)顯微鏡在10倍和40倍鏡下觀察，每張切片選取5個(gè)同等位置的視野并采集圖像；以切片組織完整性良好，無空泡和撕裂縫隙作為質(zhì)量滿意標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行對(duì)比和分析。比較同一種組織標(biāo)本經(jīng)三種不同凍存方法處理后，計(jì)算符合滿意條件的切片數(shù)量占總切片數(shù)量的百分率。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)。P<0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1骨骼肌(腓腸肌)冰凍條件優(yōu)化 液氮浸入法處理的腓腸肌結(jié)構(gòu)較為完整，肌束緊密、規(guī)則，筋膜清晰、完整，液氮漂浮法處理的切片肌束出現(xiàn)密集、不規(guī)則空泡，筋膜邊界模糊，直接-80 ℃法處理的骨骼肌切片形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了極其明顯的變化，正常的肌束形態(tài)完全喪失，出現(xiàn)大量的冰晶空泡，效果最差，見圖1。液氮浸入法的切片滿意度高于液氮漂浮法和直接-80 ℃法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 三種冰凍條件下腓腸肌結(jié)構(gòu)改變的比較A.液氮浸入法的腓腸肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×10)；B.液氮漂浮法的腓腸肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×10)；C.直接-80 ℃法的腓腸肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×10)；D.液氮浸入法的腓腸肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×40)；E.液氮漂浮法的腓腸肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×40)；F.直接-80 ℃法的腓腸肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×40)Figure 1 Comparison of the structural changes of gastrocnemius under three freezing conditions

表1 小鼠腓腸肌不同冰凍條件下切片滿意率Table 1 The satisfaction of mouse gastrocnemius sections under different freezing conditions

2.2心肌冰凍條件優(yōu)化 用液氮浸入法和液氮漂浮法處理的心肌組織標(biāo)本，大體結(jié)構(gòu)都比較完整，液氮浸入法的組織切片可見到明顯的組織裂隙且數(shù)量較多，液氮漂浮法處理的標(biāo)本，結(jié)構(gòu)更為致密，直接-80 ℃法可完全破壞心肌組織的形態(tài)，見圖2。液氮漂浮法切片滿意度高于液氮浸入法和直接-80 ℃法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠心肌不同冰凍條件下切片滿意率Table 2 The satisfaction of mouse myocardium sections under different freezing conditions

2.3血管(動(dòng)脈)冰凍條件優(yōu)化 液氮浸入法和液氮漂浮法保存的血管壁形態(tài)均保持完整，內(nèi)膜和中膜結(jié)構(gòu)清晰，而直接-80 ℃法出現(xiàn)較多冰晶縫隙，管壁各層紊亂，見圖3。液氮浸入法和液氮漂浮法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，三種方法比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 小鼠動(dòng)脈不同冰凍條件下切片滿意率Table 3 The satisfaction of mouse artery sections under different freezing conditions

圖2 三種冰凍條件下心臟結(jié)構(gòu)改變的比較A.液氮浸入法的心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×10)；B.液氮漂浮法的心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×10)；C.直接-80 ℃法的心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×10)；D.液氮浸入法的心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×40)；E.液氮漂浮法的心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×40)；F.直接-80 ℃法的心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×40)Figure 2 Comparison of the structural changes of the heart under three freezing conditions圖3 三種冰凍條件下胸主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)改變的比較A.液氮浸入法的胸主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×10)；B.液氮漂浮法的胸主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×10)；C.直接-80 ℃法的胸主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×10)；D.液氮浸入法的胸主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×40)；E.液氮漂浮法的胸主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×40)；F.直接-80 ℃法的胸主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)( ×40)Figure 3 Comparison of the structural changes of thoracic aorta under three freezing conditions

3 討 論

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后在冷凍狀態(tài)下用切片機(jī)進(jìn)行切片的方法[5]，其作為一種有效且快速的實(shí)驗(yàn)方法廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床診斷中。在臨床上，冰凍切片技術(shù)已經(jīng)成為了病理科的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，無論術(shù)中快速診斷還是常規(guī)病理診斷[6-7]，其準(zhǔn)確率更與切片質(zhì)量密切相關(guān)。想要得到高質(zhì)量的切片應(yīng)對(duì)過程中涉及到的各個(gè)環(huán)節(jié)細(xì)致對(duì)待，不同組織本身的差異性也應(yīng)區(qū)別看待，這要求實(shí)驗(yàn)人員在工作中不斷積累經(jīng)驗(yàn)，摸索出最合適的條件和操作手法。

不同組織在不同冰凍速度下所表現(xiàn)的結(jié)果存在差異。研究證明，快速超低溫的冷凍極易使腦組織因冰凍不均勻而破裂，但若置于液氮中慢慢冷凍1～2 min，可以減少凍裂現(xiàn)象的發(fā)生[8]。有研究指出在液氮表面上方的蒸氣中的距離不同，導(dǎo)致冷凍速度差異，冰凍效果有差別[9]。本研究中，心肌和骨骼肌均是橫紋肌組織，但結(jié)果仍然不同，心肌的最優(yōu)條件是液氮漂浮法而骨骼肌則為液氮浸入法。血管組織相對(duì)于心肌和骨骼肌較薄，液氮浸入法和液氮漂浮法均能快速將組織完全冰凍，對(duì)其結(jié)構(gòu)上不會(huì)有明顯的改變。但直接-80 ℃保存幾乎對(duì)所有的組織都不適用，可能是跨過最大冰晶生成帶時(shí)間稍長(zhǎng)，組織內(nèi)形成更大的冰晶使其完整性遭到破壞[10-11]。因此，水分含量比較大的組織更應(yīng)引起注意，在取下組織后盡量避免接觸液體試劑或在生理鹽水中浸泡，并且采用濾紙吸除水分等方法以防冰晶的大量形成，影響冰凍效果[12]。另外，根據(jù)滲透壓及微波的原理也可以有效消除組織內(nèi)水分[13]。

本研究所用的慢速冷凍方法是直接-80 ℃法，此法的缺點(diǎn)是在包埋劑凍實(shí)前組織容易發(fā)生位置偏移。相比于慢速冷凍，速凍的方法可以快速跨過冰晶形成的溫度區(qū)間從而降低冰晶對(duì)組織結(jié)構(gòu)的損傷，效果更好。目前應(yīng)用于科學(xué)研究中的組織速凍方法很多，常見的有液氮速凍、液氮/異戊烷法速凍、干冰/無水乙醇混合物速凍等[14]。液氮/異戊烷法速凍是將包埋后的組織放入用液氮預(yù)冷的異戊烷中速凍。有研究曾嘗試將此方法改進(jìn)，分為分步凍存法和一步凍存法[15]。前者是將肌肉組織先放入冰塊預(yù)冷的異戊烷中10 s，在放入液氮預(yù)冷的異戊烷中10 s，最后放入液氮中10 s，再進(jìn)行包埋和-80 ℃冰箱保存。后者是將包埋好的組織放入液氮預(yù)冷的異戊烷中60 s，暫時(shí)存放到液氮中后再-80 ℃冰箱保存。結(jié)果是分步凍存法下冰晶形成更少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加完整。所以梯度降溫在組織凍存方法中合理利用是非常重要的。干冰/無水乙醇混合物速凍是將無水乙醇置于干冰中提前預(yù)冷，將干冰緩慢加入到無水乙醇至形成黏稠狀液體，再將包埋后的組織放入干冰/無水乙醇混合物中速凍。液氮速凍時(shí)若操作不當(dāng)容易造成組織發(fā)脆，甚至直接斷裂的情況發(fā)生，液氮漂浮法則可以避免過度冷凍，改善了這種現(xiàn)象。相比較于其他方法，本文中涉及到的液氮浸入法和液氮漂浮法不需要多余的試劑，操作更為簡(jiǎn)便。

綜上所述，不同的冰凍方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，比如關(guān)于方法的簡(jiǎn)化和冰凍時(shí)間的具體化等方面可能需要進(jìn)一步改良。現(xiàn)已提供了一種摸索組織冰凍最優(yōu)條件的思路和方法，為新手操作提供參考。