閆 巖，袁云龍

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，江蘇蘇州 215000

微小核糖核酸(miRNA)是一類長度約22個核苷酸的小的非編碼RNA，它們能夠通過在轉(zhuǎn)錄后水平降低或阻斷信使RNA的翻譯來調(diào)節(jié)基因的表達，從而參與多種生理、病理過程[1]。miRNA穩(wěn)定存在于多種體液中，并且可作為許多疾病的潛在生物標志物[2-3]。缺氧或低氧張力，是一種獨特的環(huán)境壓力，能夠引起轉(zhuǎn)錄因子和信號蛋白的廣泛變化以協(xié)調(diào)細胞在代謝、增殖、DNA修復(fù)和凋亡中的適應(yīng)。機體調(diào)控細胞適應(yīng)缺氧的過程是復(fù)雜且不完全相同的。一些證據(jù)表明，miRNA通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)節(jié)基因的表達在應(yīng)對缺氧反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，此外缺氧在對miRNA的生成、活性等方面也有重要的調(diào)節(jié)作用[4-5]。多項研究表明在缺氧條件下或與缺氧相關(guān)的疾病中miR-130a-3p在細胞或組織內(nèi)的表達水平發(fā)生變化[6-7]。但是高原低氧環(huán)境能否影響循環(huán)miR-130a-3p表達的報道較為少見。本研究采用實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)法，對移居到我國高原地區(qū)的健康漢族人和長期居住在平原地區(qū)的健康漢族人群血漿中miR-130a-3p水平進行比較分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集包括從江蘇省、安徽省、上海市移居到海拔3 560 m的高原地區(qū)1～2年(平均17個月)的健康漢族人(高原漢組)的血漿，高原漢組中男性55例，女性25例，平均年齡為(36.13±11.70)歲；同時期收集與移居到高原地區(qū)個體年齡、性別相匹配的150例長期居住在海拔高度8.9 m的平原地區(qū)健康漢族個體(平原漢組)的血漿作為對照。平原漢組中男性88例，女性62例，平均年齡為(34.87±9.40)歲，所有入選對象均經(jīng)病史詢問，排除血液系統(tǒng)疾病、全身免疫性疾病、急慢性感染性疾病、高血壓、心臟病、腫瘤等干擾性疾病。

1.2儀器與試劑 2720型PCR儀(美國Applied Biosystem公司)，7300型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)，5418型高速冷凍離心機(德國Eppendorf 公司)，XE-2100全自動血液分析儀(日本Sysmex 公司);Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，異丙醇、氯仿、無水乙醇(國藥集團試劑公司)，人工合成peu-MIR2911、miR-130a-3p的引物和探針(美國Applied Biosystem公司);逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及qRT-PCR反應(yīng)體系所用試劑(日本TaKaRa公司) 。

1.3方法

1.3.1標本采集 所有受試者均空腹8～10 h，清晨采集2 mL靜脈血于乙二胺四乙酸二鉀抗凝真空采血管中，15 min內(nèi)上機進行血常規(guī)檢測。剩余血液迅速用室溫離心機1 500×g離心10 min。收集分離出的血漿于Eppendorf(EP)管中，置于-80 ℃保存。

1.3.2血漿RNA提取 采用苯酚氯仿抽提法進行，將上述收集的血漿樣本室溫融化混勻后，各取100 μL血漿樣本于新的除酶的EP管中，再加300 μL DEPC水稀釋混勻血漿標本；每管中各加入200 μL水飽和酚，充分渦旋混勻，然后每管加入20 μL人工合成的外源性植物miRNA MIR2911(MIR2911序列:5′-GGC CGG GGG ACG GGC UGG GA-3′) 以控制樣本提取純化過程中的差異，渦旋混勻，室溫靜置5 min；每管中各加入200 μL氯仿，充分渦旋混勻，室溫靜置5 min；室溫，16 000×g，離心20 min；取離心后的上清液于新的除酶EP管中；每管加入1/10倍上清液體積的乙酸鈉(濃度=3 mol/L，pH=5.3)和2倍上清液體積的異丙醇。渦旋顛倒混勻數(shù)次，置于-20 ℃沉淀60 min；沉淀結(jié)束后，4 ℃,16 000×g，離心20 min；離心后去除上清液，保留沉淀，每管加1 mL 75% DEPC水乙醇洗滌沉淀；4 ℃,16 000×g，離心20 min。離心后棄去上清液，保留沉淀，將EP管倒置，室溫干燥沉淀；沉淀晾干后，每管加入20 μL DEPC水溶解沉淀，將溶解好的RNA置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.3qRT-PCR檢測 采用基于TaqMan 探針的qRT-PCR方法檢測所有受試者血漿標本中miR-130a-3p表達水平。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(10 μL體系)：DEPC水3.5 μL，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL,AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，miR-130a-3p反轉(zhuǎn)錄引物1.0 μL，RNA 標本2.0 μL。反應(yīng)條件:16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存，1個循環(huán);qRT-PCR 總反應(yīng)體系(20 μL體系),ddH2O 14.77 μL、10×PCR buffer 2 μL、10 mmol/L dNTP 0.4 μL、25 mmol/L MgCl21.2 μL、Taq 酶0.3 μL，探針及上、下游引物 0.33 μL，cDNA 1 μL。以DEPC水作為陰性對照，每個樣本均設(shè)3個復(fù)孔，陰性對照的cDNA與待測樣本的cDNA同時進行擴增，95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。血漿中miRNA表達水平采用相對定量的方法進行計算。用樣本中待測miRNA的Cq值減去相應(yīng)樣本中參考基因Cq值得到ΔCq值，即ΔCq=Cq(miR-130a-3p)-Cq(MIR2911)。待測miRNA相對于參考基因的表達水平用2-ΔCq表示。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床基本信息 兩組人群的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與平原漢組比較，高原漢組血液中紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、血細胞比容(Hct)、平均血紅蛋白含量(MCH)均顯著升高,而血小板計數(shù)(PLT)則顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組血液中平均血紅蛋白濃度(MCHC)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組臨床基本信息

2.2兩組血漿外源性MIR2911表達水平比較 采用qRT-PCR技術(shù)分別檢測150例平原漢組及80例高原漢組血漿中的MIR2911表達水平，用Cq值表示。兩組血漿中外源性MIR2911表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.087 1)，見圖1。

圖1 兩組血漿外源性MIR2911表達水平比較

2.3血漿miR-130a-3p的qRT-PCR檢測結(jié)果 高原漢組血漿miR-130a-3p表達水平為[323.12(209.46，618.54)]×10-5高于平原漢組血漿miR-130a-3p表達水平[210.51(158.18,274.98)]×10-5,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-5.318，P<0.05)。

2.4miR-130a-3p與血液學(xué)指標的相關(guān)性 為了驗證miR-130a-3p與機體適應(yīng)高原低氧環(huán)境相關(guān)，進一步利用Spearman秩相關(guān)分析了miR-130a-3p與RBC、Hb、Hct、PLT之間的相關(guān)性。miR-130a-3p與RBC(r=0.58、P<0.001)、Hb(r=0.59、P<0.001)、Hct(r=0.69、P<0.001)均呈正相關(guān)，而與PLT(r=-0.21,P=0.001 4)呈負相關(guān)。

2.5miR-130a-3p的靶基因預(yù)測 為了探討miR-130a-3p在應(yīng)對高原低氧環(huán)境中的作用及潛在的分子學(xué)機制，利用TargetScan,miRanda和PicTar靶基因預(yù)測軟件預(yù)測了其潛在的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-130a-3p存在一些與缺氧相關(guān)(DDX6、EGLN3、FOSL1、EDN1、CHRN2、PRKA1、I7PR1、PXDN、TGFB1、TGFB2、UCP3等)、紅細胞生成相關(guān)(SMAD5、SP1等)、巨核細胞系統(tǒng)增殖與分化(MAFB、HOXD1、CXDCL2、CBFA、MYB、PDGFRA、MAFG、HOXA3)等相關(guān)的靶基因。

3 討 論

miRNA可作為多種疾病的潛在生物標志物，但是環(huán)境等非病理因素對miRNA表達的影響研究很少。為了將miRNA更好地應(yīng)用到疾病的診斷、預(yù)測中去，必須了解非病理因素對miRNA表達的影響。缺氧發(fā)生在許多病理生理過程中，例如組織的快速生長、急慢性缺血及處于高海拔地區(qū)等。當平原地區(qū)的居民移居到高原環(huán)境中時將面對缺氧的威脅，而身體在高原發(fā)生缺氧的生理變化很復(fù)雜，涉及一系列的生理機制[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧情況下機體、細胞中的一些miRNA的表達水平會發(fā)生變化，除此之外在與缺氧相關(guān)的疾病中一些miRNA的表達水平也會發(fā)生變化[5-7]。然而這些研究主要集中在組織或細胞層面的miRNA的表達水平上。考慮到miRNA是應(yīng)對缺氧的關(guān)鍵因素，推測高原低氧環(huán)境可能對循環(huán)miRNA的表達也存在影響。

紅細胞的生理功能是將氧氣從肺部毛細血管運輸?shù)浇M織毛細血管進行氣體交換，紅細胞生成過程受到包括氧含量在內(nèi)的多種因素的影響。當平原地區(qū)居民移居到高海拔地區(qū)時不能很好地適應(yīng)高原低氧的環(huán)境，為了獲得充分的氣體交換，機體內(nèi)RBC、Hb、Hct等會升高[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與一直居住在平原地區(qū)的人群相比，從平原地區(qū)移居到高原地區(qū)的人群的RBC、Hb、Hct都顯著升高，與其他研究報道結(jié)果一致[9-10]。進一步分析了miR-130a-3p與這些血液學(xué)指標的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-130a-3p與RBC、Hb、Hct呈正相關(guān)。這些結(jié)果提示 miR-130a-3p可能通過調(diào)節(jié)紅細胞的生成、分化等參與機體對低氧環(huán)境的適應(yīng)過程。

另外，通過分析生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了miR-130a-3p的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-130a-3p的部分靶基因與氧代謝及氧敏感度有關(guān)。如預(yù)測到miR-130a-3p的靶基因DDX6，miR-130a-3p能夠通過靶向調(diào)節(jié)DDX6進而增強缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的作用來調(diào)節(jié)細胞對缺氧的反應(yīng)[11]。此外，miR-130a-3p還存在一些與紅細胞生成、巨核細胞分化相關(guān)的靶基因。例如，SMAD5[12]和SP1[13]是與紅細胞生成有關(guān)的靶基因，MAFB[14]和MYB[15]是在巨核細胞分化過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。以上結(jié)果進一步說明miR-130a-3p可能通過參與紅細胞的生成和巨核細胞的分化來調(diào)節(jié)機體對高原低氧環(huán)境的適應(yīng)過程。但是，在本研究中并未涉及miR-130a-3p在機體應(yīng)對低氧環(huán)境中的具體分子機制，在之后的試驗中有待更深入的研究。

綜上所述，高原低氧環(huán)境能夠影響血漿miR-130a-3p表達水平，miR-130a-3p可作為應(yīng)對缺氧環(huán)境的一個循環(huán)因子。本研究進一步分析了miR-130a-3p與血細胞指標的相關(guān)性并預(yù)測了miR-130a-3p的一些潛在的靶基因。以上研究結(jié)果為研究人類適應(yīng)高原環(huán)境的分子機制提供了新視角，miR-130a-3p可能參與這一適應(yīng)過程。