王 蓉,潘小平,賴金國,杜利軍,楊 園

廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,廣東廣州 510800

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅女性的生命健康[1]。研究證實環(huán)境因素和遺傳方式可能導(dǎo)致乳腺癌或增加患乳腺癌的風(fēng)險[2]。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，在腫瘤基因表達調(diào)控、細胞增殖分化等方面起最重要作用。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)是表觀遺傳學(xué)中催化并維持DNA甲基化的重要酶家族。其中DNMT1是DNMT酶家族中最重要也是目前研究最多的一種酶。研究發(fā)現(xiàn)DNMT1與DNA異常甲基化有關(guān)，從而導(dǎo)致腫瘤的進一步發(fā)生、發(fā)展,乳腺癌患者外周血中DNMT1 mRNA和蛋白高表達[3]，但是DNMT1多態(tài)性與乳腺癌的研究報道較少。本研究選取DNMT1啟動子區(qū)域的4個多態(tài)性位點rs2114724、rs2228611、rs8101866、rs16999593進行研究，擬通過檢測分析DNMT1多態(tài)性位點的基因型與乳腺癌臨床病理特征風(fēng)險之間的關(guān)系，探討DNMT1多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年4月至2019年12月在本院接受乳腺癌手術(shù)且經(jīng)病理學(xué)證實為乳腺癌的患者68例作為病例組,年齡31～85歲，平均(46.8±12.2)歲;另選同期體檢健康女性80例作為對照組,年齡28～74歲，平均(44.8±13.9)歲。按照文獻[4]乳腺癌的腫瘤大小判定標準分為T1 21例,T2～T4 47例;按照組織學(xué)等級分為G1 15例、 G2 27例、G3 26例;按照是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為無轉(zhuǎn)移25例、有轉(zhuǎn)移43例;按照是否有遠處轉(zhuǎn)移分為無遠處轉(zhuǎn)移56例、有遠處轉(zhuǎn)移12例。所有病例術(shù)前均未經(jīng)任何治療?；颊呔橥猓狙芯拷?jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準。

1．2儀器與試劑 郎基A300PCR儀購于浙江杭州飛迪生物有限公司，博日HB-T2-D 金屬浴加熱儀購于杭州諾丁科學(xué)器材有限公司，其林貝爾螺旋震蕩儀V6RTAX-5購于北京通世華港設(shè)備有限公司，ABI 3730xl測序儀購于美國ABI公司，DNA提取試劑盒TSP201-200、PCR試劑1.1×T3 Super PCR Mix購于廣州擎科生物技術(shù)有限公司，SNaPshot反應(yīng)試劑盒、內(nèi)標試劑、HiDi緩沖液均由ABI生物技術(shù)中國有限公司提供。

1.3DNA提取 病例組和對照組各采集空腹靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。按照DNA試劑盒步驟，抽提得到DNA，測定DNA水平及A260/A280值，選用DNA水平為50 ng/μL，A260/A280值為1.70～2.10的樣本，-80 ℃保存、備用。

1.4PCR擴增產(chǎn)物 按照單堿基延伸引物設(shè)計原則，DNMT1 4個多態(tài)性位點擴增引物見表1。提取的DNA樣品稀釋至20 ng/μL后作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，10 μmol/L正向引物1 μL，10 μmol/L 反向引物 1 μL，模板(gDNA)1 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，然后98 ℃10 s、58～61 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，35個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳。

表1 DNMT1 4個多態(tài)性位點擴增引物

1.5PCR產(chǎn)物測序 純化好的混合PCR產(chǎn)物待用，單堿基延伸引物稀釋到10 μmol/L，將各位點的等體積單堿基延伸引物混合，得到混合引物，進行SNaPshot PCR，PCR體系及各組分如下：PCR反應(yīng)體系為5 μL,其中ABI SnapShot multiplex Mix 2 μL，混合引物 2 μL，純化后PCR模板 1 μL。PCR反應(yīng)條件為96 ℃預(yù)變性2 min，然后96 ℃10 s、50 ℃5 s、60 ℃ 30 s，25個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物處理后上ABI 3730xl測序儀進行毛細管電泳測序。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS18.0分析DNMT1多態(tài)性位點基因型頻率分布，并驗證Hardy-Weinberg平衡定律，評估對照組和病例組的基因型，分析各基因型與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。為了評估同一基因單核苷酸的相關(guān)性，利用Haplo View 4.2 software對DNMT1的4個位點進行了連鎖不平衡和單體型分析。計算相對優(yōu)勢比(OR)及95%CI，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，病例資料少于5例時采用Fish精確檢驗。

2 結(jié) 果

2.1DNMT1單個基因型與乳腺癌風(fēng)險分析 PCR反應(yīng)后，得到清晰的擴增條帶。所有樣本經(jīng)測序后成功分型，經(jīng)χ2檢驗，在病例組和對照組中DNMT1各位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，見表2。病例組和對照組DNMT1的4個位點的基因型構(gòu)成比比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 DNMT1各位點基因型Hardy-Weinberg平衡檢測

表3 DNMT1基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險性研究

2.2DNMT1基因多態(tài)性與乳腺癌臨床病理學(xué)指標的分析 病例組DNMT1 多態(tài)性位點rs2228611、rs2114724、rs8101866、rs16999593各基因型頻率在乳腺癌臨床病理學(xué)指標間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 DNMT1基因多態(tài)性與乳腺癌臨床病理學(xué)指標的相關(guān)性研究[n(%)]

續(xù)表4 DNMT1基因多態(tài)性與乳腺癌臨床病理學(xué)指標的相關(guān)性研究[n(%)]

2.3連鎖不平衡和單體型分析 DNMT1多態(tài)性位點rs2228611、rs2114724和rs8101866之間存在較強的連鎖不平衡并且形成一個單體型模塊，見圖1。為了評估同一基因單核苷酸的相關(guān)性，利用Haplo View 4.2 software分析了DNMT1的4個位點連鎖不平衡系數(shù)(D′)和相關(guān)系數(shù) (r2)，依據(jù)D′ 和r2值大小，在同一基因內(nèi)判斷各單核苷酸之間關(guān)聯(lián)程度的強弱，對關(guān)聯(lián)性較強的單核苷酸采用單體型分析，分析所有樣本中常見的單體型及攜帶單體型的相對危險度。發(fā)現(xiàn)DNMT1多態(tài)性位點rs2114724、rs2228611和rs8101866之間存在較強的連鎖不平衡，r2>0.8，而rs16999593與以上3個位點之間關(guān)聯(lián)程度較弱，r2<0.2。見表5。對關(guān)聯(lián)較強的rs2114724、rs2228611和rs8101866位點進行了單倍體型分析，發(fā)現(xiàn)研究人群中DNMT1最常見的單倍體型為C、G、T，頻率為68.4%，少見的單倍體型為T、A、T，頻率為3.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明DNMT1基因中rs2114724、rs2228611和rs8101866位點形成的單倍體T、A、T能顯著增加患乳腺癌的風(fēng)險。見表6。

表6 所有研究對象DNMT1 單倍體型分析

注：1、2、3、4分別代表rs2114724、rs2228611、rs8101866、rs16999593。

3 討 論

乳腺癌居女性癌癥發(fā)病首位[1]。在腫瘤進展過程中啟動子通過調(diào)控基因表達發(fā)揮了重要的表觀遺傳學(xué)作用。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)機制最常見的形式，基因啟動子區(qū)及附近區(qū)域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達，從而引起相應(yīng)基因沉默[5]。DNA甲基化是指在DNMT的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基基團轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上并與其3′端的鳥嘌呤形成 mCpG，且在雙鏈對稱出現(xiàn)。異常的基因啟動子甲基化能抑制多種抑癌基因的表達。目前研究發(fā)現(xiàn)的DNMT家族成員至少包括 DNMT1、DNMT2、DNMT3。其中位于染色體19q13.2的DNMT1是以復(fù)制病灶為靶點的最豐富的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，并且在細胞分裂過程中起最主要的、穩(wěn)定的維持甲基化狀態(tài)作用[6]。DNMT1不僅與胚胎發(fā)育、細胞衰老有關(guān)，也與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。DNMT1高表達可以使甲基化模式發(fā)生異常，抑癌基因沉默、原癌基因激活導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[7]。DNMT1的多態(tài)性與人類乳腺癌[8]、結(jié)直腸癌[9]、卵巢癌[10]等有關(guān)。DNMT1在乳腺癌中能導(dǎo)致許多抑癌基因發(fā)生甲基化，如P53[11]、PTEN[12]、APG等。目前，有兩項關(guān)于中國人群DNMT1多態(tài)性與乳腺癌的研究，在黑龍江人口的一項研究中發(fā)現(xiàn)中國人群DNMT1 rs16999593的雜合子基因型CT的頻率病例組低于對照組[13]；而在中國南方人群中調(diào)查發(fā)現(xiàn)相同位點基因型CT能顯著增加患乳腺癌的風(fēng)險，廣東人群DNMT1 rs2228612位點和重慶人群DNMT1 rs2114724和rs2228611與乳腺癌易感性相關(guān)[14]，可以看出結(jié)果存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組和對照組在各位點基因型頻率和等位基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，位點rs16999593的CT基因型頻率在兩組間并沒有較大差別，與野生基因型TT相比，雜合子基因型CT和突變基因型CC能顯著增加患乳腺癌的風(fēng)險。SUN等[14]報道在病例組和對照組DNMT1 rs16999593雜合子CT能明顯增加患乳腺癌的風(fēng)險，這與本研究結(jié)論不同。分析可能的原因：(1)研究對象背景不同，遺傳結(jié)構(gòu)可能存在一定差異；(2)納入的符合要求的樣本量不同，可能會導(dǎo)致統(tǒng)計結(jié)果偏倚；(3)檢測方法不同，可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果不一致。擴大符合要求的樣本統(tǒng)計是本課題下一步工作的重要內(nèi)容之一。此外，在本研究人群中DNMT1(rs2228611、rs2114724、rs8101866)3個多態(tài)性位點彼此間存在較強的關(guān)聯(lián)，4個位點單核苷酸可以形成連鎖不平衡結(jié)構(gòu)圖，這說明中國婦女DNMT1 rs2228611、rs2114724、rs8101866位點多態(tài)性可能與乳腺癌易感性相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)樣本中單體型C、G、T的頻率明顯高于單體型T、A、C和T、A、T，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017)，攜帶T、A、T單倍體型的人群患乳腺癌的風(fēng)險顯著增加。這與SUN等[14]研究結(jié)果不一致，其認為DNMT1基因的位點rs2228611、rs2114724、rs8101866和rs16999593形成的單倍體C、G、T、C能明顯增加患乳腺癌的風(fēng)險，結(jié)論的不同還需要增加樣本量等進一步探討。通過對臨床病理指標的分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病年齡、組織學(xué)分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、遠處轉(zhuǎn)移、ER和PR狀態(tài)等方面，乳腺癌患者DNMT1多態(tài)性位點rs2228611、rs2114724、rs8101866、rs16999593各基因型頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究進一步探討了乳腺癌中DNMT1單核苷酸多態(tài)性與以上臨床病理特征的關(guān)系，也進一步證明了DNMT1可能參與了乳腺癌的發(fā)生，但與病程的發(fā)展還有待進一步深入研究。

DNA甲基化是調(diào)控基因表達的表觀遺傳學(xué)的重要機制之一，DNMT表達狀態(tài)影響著細胞基因的表達調(diào)控。本研究通過對DNMT1多態(tài)性位點的分析評估了其與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。位點rs16999593能增加患乳腺癌的風(fēng)險，但分子機制還有待進一步闡明，今后也將擴大樣本進行分層分析，為乳腺癌的早期篩查、診斷及DNMT1抑制劑的使用提供更加準確的科學(xué)依據(jù)。