周 琳，張青松，朱燕忠，趙吉光，顧園園△

1.前海人壽廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 511330；2.江蘇省太湖康復(fù)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇無錫 214086； 安徽宣城市中心醫(yī)院：3.檢驗(yàn)科；4.腫瘤科，安徽宣城 242000

胃癌是我國發(fā)病率及病死率較高的惡性腫瘤之一。目前研究普遍認(rèn)為環(huán)境因素與遺傳因素交互作用導(dǎo)致疾病的進(jìn)展并最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生，其中環(huán)境因素如飲食結(jié)構(gòu)與習(xí)慣、吸煙、飲酒等被認(rèn)為是胃癌的誘發(fā)因素，病原菌感染如幽門螺桿菌(Hp)、EB病毒感染是胃癌的致病因素[1]。這些易感因素的探明為胃癌的預(yù)警及重點(diǎn)人群的早期篩查提供了重要依據(jù)[2]。Toll樣受體(TLR)是一種進(jìn)化上高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞表面，其是一組重要的模式識(shí)別受體，在病原體入侵人體時(shí)發(fā)揮屏障作用。TLR-4與病原體入侵機(jī)體的早期免疫應(yīng)答及感染后的適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)。研究表明TLR-4是細(xì)菌脂多糖的受體，Hp脂多糖可以通過TLR-4誘導(dǎo)致炎因子分泌，通過活化單核細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞誘導(dǎo)一氧化氮和氧自由基，導(dǎo)致胃部炎癥及疾病進(jìn)展[3]。因此，TLR-4與腫瘤特別是炎癥相關(guān)性腫瘤密切相關(guān)。TLR-9主要表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，如記憶性B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞等，其在多種腫瘤細(xì)胞中亦有表達(dá)；在胃癌的發(fā)生過程中TLR-9介導(dǎo)的炎性反應(yīng)發(fā)揮著重要的作用[4]。有研究指出，TLR-9基因多態(tài)性與Hp感染相關(guān)，是胃癌潛在易感基因[5]。本研究對(duì)江蘇省無錫市及安徽省宣城市胃癌及健康人群進(jìn)行調(diào)查，探討TLR-4及TLR-9基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及病理的相關(guān)性，為胃癌的臨床及基礎(chǔ)研究積累分子流行病學(xué)資料，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年12月招募江蘇省無錫市及安徽省宣城市經(jīng)病理確診的325例胃癌患者(病例組)，以及同期招募該地區(qū)經(jīng)體檢檢測(cè)結(jié)果為健康且自述無消化道疾病史的健康者402例(對(duì)照組)作為研究對(duì)象。

1.2方法 所有受試者均采集乙二胺四乙酸抗凝的靜脈血3 mL，分離血漿與血細(xì)胞。Hp感染采用膠體金法(上海凱創(chuàng)生物技術(shù)公司產(chǎn)品)檢測(cè)抗體?；蚪MDNA提取采用納米磁技術(shù)(西安金磁納米生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)按照試劑說明書步驟進(jìn)行?；蚪M提取后檢測(cè)DNA濃度與純度(NaniDrop2000c型蛋白核酸檢測(cè)儀，美國Thermo公司)?；蚍中筒捎肕assARRAY技術(shù)進(jìn)行(點(diǎn)樣儀及質(zhì)譜儀為美國Sequenom公司產(chǎn)品；Iplex Gold Reagent kit試劑盒為美國Sequenom公司產(chǎn)品)，該平臺(tái)分析基因型主要為以下步驟：目標(biāo)序列的擴(kuò)增、蝦堿性磷酸酶純化、單堿基延伸、樹脂純化、MassArray點(diǎn)樣儀、質(zhì)譜分析、結(jié)果解讀。PCR所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司產(chǎn)品(GeneAmp PCR System 9700型)。

1.3多態(tài)性位點(diǎn)的選擇 在公共數(shù)據(jù)庫中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)檢索TLR-4及TLR-9基因多態(tài)性位點(diǎn)的信息。基因多態(tài)性位點(diǎn)的選擇符合以下條件：(1)現(xiàn)有研究顯示有潛在的胃癌相關(guān)性風(fēng)險(xiǎn)；(2)基因多態(tài)性位點(diǎn)在中國人群的最小等位基因頻率為大于0.05；(3)基因多態(tài)性位點(diǎn)位于TLR-4或TLR-9基因相關(guān)區(qū)域位置見表1。

表1 TLR-4及TLR-9基因多態(tài)性位點(diǎn)信息

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床與基本特征比較 兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；病例組中吸煙、飲酒比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組的Hardy-Weinberg 遺傳平衡(HWE)檢驗(yàn)結(jié)果(P>0.05)顯示樣本具有群體代表性，見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2兩組TLR-4、TLR-9基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布及與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的GA、GA/GG基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，見表3。

表3 兩組TLR-4、TLR-9基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布及與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

續(xù)表3 兩組TLR-4、TLR-9基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布及與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

2.3TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)因素分析 為明確TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)因素之間關(guān)系，對(duì)年齡、性別、Hp感染、腫瘤部位、腫瘤分期進(jìn)行分析，結(jié)果顯示年齡>60歲的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的GA及GA/GG基因型均與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P<0.05)，年齡≤60歲胃癌患者的TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的所有基因型均與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。病例組Hp感染陽性患者的TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的GA及GA/GG基因型均與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P<0.05)，而病例組Hp感染陰性患者的TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的所有基因型均與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。腫瘤部位為非賁門的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的GA及GA/GG基因型均與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P<0.05)。胃癌患者腫瘤分期T3～T4期患者的TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的GA及GA/GG基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 兩組TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)因素分析

3 討 論

TLR-9 rs187084位點(diǎn)位于該基因的啟動(dòng)子-1 486位，該位點(diǎn)的多態(tài)性導(dǎo)致形成轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)合位點(diǎn)[6]，影響了TLR-9表達(dá)[7]。研究顯示，與淺表性胃炎、萎縮性胃炎及異常增生的患者相比，TLR-9在胃癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與Hp感染相關(guān)[4，8]。有研究表明，在宮頸癌研究中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與患者外周血單核細(xì)胞中的TLR-9 mRNA及血清中的TLR-9蛋白水平相關(guān)，并與人乳頭瘤病毒感染關(guān)聯(lián)[9]。本研究結(jié)果顯示，TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的GA及GA/GG基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。此外，另有研究進(jìn)一步證實(shí)GA 或GG基因型與胃癌、宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[10-11]，與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)年齡>60歲的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的GA及GA/GG基因型均與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P<0.05)，可能是由于在年齡較大的人群中受到Hp持續(xù)感染，暴露時(shí)間長，致胃部炎癥水平升高，引起TLR-9表達(dá)增加，進(jìn)而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[12]。胃癌患者腫瘤部位為非賁門的患者TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的GA及GA/GG基因型均與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P<0.05)，與TLR-9參與胃癌的發(fā)病進(jìn)程相關(guān)機(jī)制一致[12]。有研究顯示，TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與胃癌的預(yù)后相關(guān)，G等位基因與預(yù)后較差相關(guān)[10]，此與本研究結(jié)論一致。本研究結(jié)果顯示，TLR-9 rs187084基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且與Hp感染有潛在關(guān)聯(lián)，是非賁門胃癌的風(fēng)險(xiǎn)因素，該位點(diǎn)的基因型與胃癌的分期相關(guān)，是潛在的預(yù)后不良因素。

有研究發(fā)現(xiàn)TLR-4 rs10759932基因多態(tài)性位點(diǎn)[14]及rs1927911基因多態(tài)性位點(diǎn)[15]的基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，與本研究的結(jié)論不一致。此可能與病例選擇及研究的方法不一樣有關(guān)，上述兩個(gè)研究均采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶法，而本研究采用的Mass-array基因分析平臺(tái)結(jié)果相對(duì)可靠。還有研究顯示TLR-4 rs11536889 的基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[16]，與本研究結(jié)論不一致，其所納入病例相對(duì)較少，而本研究病例數(shù)雖相對(duì)較大，但本研究的病例數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)效應(yīng)還較弱，有待于更多的大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。胃癌是一個(gè)多基因多因素參與的復(fù)雜疾病，TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的功能研究還不清晰。

綜上所述，年齡>60歲及非賁門部位的胃癌患者TLR-9 rs187084基因多態(tài)性位點(diǎn)的GA及GA/GG基因型均與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。