侯黎明，劉迎見(jiàn)△，舒閃閃

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬商丘市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南商丘 476100； 2.商丘市婦幼保健院檢驗(yàn)科，河南商丘 476000

2型糖尿病(T2DM)是內(nèi)分泌科常見(jiàn)的一種代謝性疾病，主要特點(diǎn)為高血糖，病理基礎(chǔ)為胰島素分泌不足、胰島素抵抗，該病危害性較大，可引起神經(jīng)性病變，增加病死率[1]。T2DM患者的糖代謝紊亂狀態(tài)持續(xù)存在，長(zhǎng)期胰島素抵抗會(huì)影響心肌細(xì)胞利用葡萄糖，導(dǎo)致心臟所需能量不足，嚴(yán)重時(shí)可致心功能損害[2]；脂代謝異常是糖尿病腎病惡化的影響因素之一[3]，在T2DM進(jìn)展過(guò)程中，糖脂代謝異常、炎性因子、胰島素抵抗均會(huì)引起T2DM患者病情惡化。近年來(lái)，有研究指出，微小核糖核酸(miRNA)參與了β細(xì)胞分化、糖尿病腎病等病變的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-125b對(duì)胰島細(xì)胞凋亡有調(diào)節(jié)作用[5]。另有研究提示，miR-18a作為miRNA的重要組成部分，參與了多種疾病的慢性應(yīng)激過(guò)程，增加了機(jī)體患病風(fēng)險(xiǎn)[6]。單個(gè)核細(xì)胞包括兩類(lèi)細(xì)胞，分別為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，可吞噬衰老細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子表達(dá)情況，更能反映機(jī)體功能變化[7]。故本研究選取88例T2DM患者作為研究對(duì)象，分析T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平與糖脂代謝、炎性因子及胰島素抵抗的關(guān)系，通過(guò)探討相互之間的關(guān)系，進(jìn)一步了解T2DM患者病情，旨在為T(mén)2DM治療提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5月至2020年6月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬商丘市第一人民醫(yī)院收治的T2DM患者88例(T2DM組)作為研究對(duì)象，另選取同期于該院體檢的健康志愿者65例作為對(duì)照組。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。研究方案獲該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組均對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意。研究對(duì)象均符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：出現(xiàn)明顯的糖尿病癥狀，如多食、煩渴多飲、多尿等，且隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L；空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L；口服葡萄糖耐量試驗(yàn)提示餐后2 h血糖(2 hPG)≥11.1 mmol/L。

表1 兩組一般資料比較

1.2納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn) T2DM組：(1)滿足上述關(guān)于T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)認(rèn)知狀態(tài)、精神狀態(tài)正常。對(duì)照組：(1)身體健康狀況良好；(2)性別、年齡資料與T2DM組匹配；(3)認(rèn)知狀態(tài)、精神狀態(tài)正常。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) (1)出現(xiàn)急性并發(fā)癥；(2)腎臟、肝臟、心等臟器嚴(yán)重受損；(3)惡性腫瘤；(4)自身免疫性疾病；(5)近6個(gè)月內(nèi)有外科手術(shù)史；(6)1型糖尿病或妊娠糖尿??；(7)伴急/慢性感染。

1.3方法

1.3.1樣本采集 兩組于就診或體檢當(dāng)日，采集5 mL空腹靜脈血，分裝于兩管，一管用于檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b，另一管用于檢測(cè)糖脂代謝、炎癥指標(biāo)。

1.3.2外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b檢測(cè) 采集3 mL空腹肘靜脈血，行抗凝處理，利用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)Trizol試劑(北京雷根生物技術(shù)有限公司，NR0002)對(duì)總RNA進(jìn)行提取，加入Trizol試劑500 μL，充分混合，在室溫下放置5 min，而后加入100 μL氯仿(上海研生生化試劑有限公司，YS-0043B)，震蕩混合，放置2 min，使用高速離心機(jī)(湘儀集團(tuán)，H1650)在4 ℃下行離心處理，時(shí)間為15 min，12 000 r/min，將上清液棄除。取100 μL異丙醇(西安晉湘藥用輔料有限公司，497-19-8)加入，充分混合后離心處理，將上清液棄除。取75%冰乙醇100 μL加入，離心后棄除上清液。經(jīng)空氣干燥機(jī)(杭州超濾實(shí)業(yè)有限公司，CLRD-SA/W)干燥5～10 min，去除蛋白及水分。取焦炭酸二乙酯(美國(guó)Amresco，E174-5G)20 μL，使RNA完全溶解，存放于低溫冰箱(中科都菱，MPC-5V1500)待測(cè)。經(jīng)紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器，SP-2500)對(duì)RNA樣品的純度予以檢測(cè)，分別在280、260 nm波長(zhǎng)處各測(cè)1次，明確A260與A280比值，若比值處于1.8～2.1提示滿足檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。各樣本均取RNA 1 ng經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件設(shè)定為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)引物序列如下：miR-18a上游引物為5′-GTG CTA AGG TGC ATC TAG CAG-3′，下游引物為5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；miR-125b上游引物為5′-GGA TGG TGT TAT AGG AGG TTG TG-3′，下游引物為5′-CTC TTT CCC CCA AAA CAA ATA TAC-3′；以U6為內(nèi)參基因，上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 20 s，變性95 ℃ 10 s、退火57 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)，檢測(cè)儀器為PCR檢測(cè)儀(上?？圃措娮涌萍迹琎uick1600)，經(jīng)2-ΔΔCt法表示miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3糖脂代謝及炎性因子檢測(cè) 將采集的血樣行離心處理，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心時(shí)間10 min，離心半徑8 cm，分離血清，經(jīng)博科生物(山東)BK-200全自動(dòng)生化分析儀與配套試劑測(cè)定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-15、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，試劑盒購(gòu)自江萊生物(上海)，經(jīng)放射免疫分析法測(cè)定空腹胰島素(FINS)，試劑盒購(gòu)自上海瑞齊生物科技有限公司。經(jīng)厚美德生物(青島)GLS-77血糖分析儀測(cè)定2 hPG、FPG，經(jīng)涵飛醫(yī)療(上海)CS2000糖化血紅蛋白(HbA1c)分析儀測(cè)定HbA1c。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平比較 T2DM組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2兩組血糖及胰島素抵抗指標(biāo)比較 T2DM組2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組血糖及胰島素抵抗指標(biāo)比較

2.3兩組脂代謝指標(biāo)比較 T2DM組TC、TG、LDL-C高于對(duì)照組，而HDL-C低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 兩組脂代謝指標(biāo)比較

2.4兩組血清炎性因子比較 T2DM組血清IL-1β、IL-6、IL-15及TNF-α高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 兩組血清炎性因子比較

2.5T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平與各指標(biāo)相關(guān)性分析 外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平與2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、LDL-C、IL-1β、IL-6、IL-15、TNF-α呈正相關(guān)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，但二者與TC、TG無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表6。

表6 T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平與各指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討 論

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)2013年T2DM患病率已高達(dá)10.4%[9]。該病發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，臨床上尚未完全明確其特點(diǎn)，既往研究采用血糖、血脂等常規(guī)指標(biāo)評(píng)估患者病情，雖然具有一定價(jià)值，但僅能反映糖脂代謝、胰島素反應(yīng)的變化，存在局限性，臨床仍需尋求可靠指標(biāo)對(duì)其病情進(jìn)展予以判斷，為治療提供依據(jù)。既往有學(xué)者認(rèn)為，過(guò)表達(dá)的miR-18a可能具有擾亂機(jī)體蛋白質(zhì)代謝，削弱腎臟、血管等生理功能的作用[10]。miR-125b表達(dá)可能影響血管平滑肌細(xì)胞的分化[11]。臨床通過(guò)評(píng)估T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平，可能有利于進(jìn)一步了解病情，提出針對(duì)性干預(yù)方案。

本研究結(jié)果顯示，T2DM組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-18a是miR-17-29家族的一員，其異常表達(dá)與機(jī)體免疫存在關(guān)聯(lián)，在免疫應(yīng)答、細(xì)胞發(fā)育中有重要作用[12]。miR-18a可通過(guò)調(diào)節(jié)酪氨酸激酶-轉(zhuǎn)錄激活因子通路，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，導(dǎo)致機(jī)體炎癥加重，它在低度炎癥進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[13]?；诖?，筆者推測(cè)miR-18a可能通過(guò)其對(duì)炎癥介質(zhì)的調(diào)控作用，參與T2DM進(jìn)展。有學(xué)者認(rèn)為miR-125b過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有促進(jìn)作用，從而加速內(nèi)皮細(xì)胞損傷，影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，這可能是其過(guò)表達(dá)促進(jìn)糖尿病進(jìn)展的原因[14]。研究表明T2DM患者的輔助性、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞處于不平衡狀態(tài)[15]。而高表達(dá)的miR-125b則可能通過(guò)影響B(tài)淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白和干擾素調(diào)節(jié)因子-4的表達(dá)，引起輔助性、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞失衡[16]。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，T2DM組2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR及TC、TG、LDL-C顯著升高，而HDL-C下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示T2DM患者存在糖脂代謝紊亂與胰島素抵抗。糖尿病患者存在糖脂代謝紊亂，這主要是由于患者的胰島素功能障礙或胰島素分泌不足所致，癥狀包括餐后血糖或FPG上調(diào)及血脂代謝異常，引起胰島素抵抗及血糖、血脂指標(biāo)增高[17]。當(dāng)人機(jī)體持續(xù)處于高血糖狀態(tài)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)膽固醇累積，導(dǎo)致動(dòng)脈血管壁脂質(zhì)沉積速度增快，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[18]。血脂代謝異常也與胰島素抵抗有關(guān)，隨著病程延長(zhǎng)，可能出現(xiàn)心肌代謝障礙，引起心肌缺血，胰島素抵抗貫穿于T2DM發(fā)病的整個(gè)過(guò)程[19]。本研究發(fā)現(xiàn),T2DM組血清IL-1β、IL-6、IL-15及TNF-α高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明患者存在炎癥。持續(xù)血糖增高會(huì)影響單個(gè)核細(xì)胞合成功能，促進(jìn)炎癥介質(zhì)大量釋放，IL-1β、IL-6、IL-15均為促炎因子，可加重機(jī)體炎癥嚴(yán)重程度，三者均通過(guò)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行釋放，能對(duì)趨化蛋白予以介導(dǎo)，對(duì)糖尿病患者病情影響較大[20]。TNF-α與糖尿病并發(fā)癥發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，也可加重糖尿病患者的機(jī)體炎癥[21]?；诖?，臨床要加強(qiáng)對(duì)患者機(jī)體炎癥的觀察，以便調(diào)整治療方案。本研究最終證實(shí)，T2DM患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平與2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、LDL-C、IL-1β、IL-6、IL-15、TNF-α呈正相關(guān)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)，表明患者miR-18a、miR-125b表達(dá)與糖脂代謝、炎性因子、胰島素抵抗存在關(guān)聯(lián)。T2DM患者的糖脂代謝紊亂、炎癥程度、胰島素抵抗相應(yīng)呈進(jìn)行性發(fā)展，miR-18a可能通過(guò)調(diào)控炎癥介質(zhì)促進(jìn)T2DM進(jìn)展，miR-125b則可加重高糖誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)程度，引起內(nèi)皮細(xì)胞損害，參與T2DM進(jìn)展。外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b的高表達(dá)均可加重T2DM病情，二者相對(duì)表達(dá)水平越高，意味著血糖控制越差，繼而導(dǎo)致糖脂代謝紊亂、炎性反應(yīng)與胰島素抵抗進(jìn)一步加重。

綜上所述，T2DM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b表達(dá)明顯上調(diào)，且這類(lèi)患者存在糖脂代謝紊亂、炎性反應(yīng)及胰島素抵抗，而外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-18a、miR-125b表達(dá)與上述表現(xiàn)存在相關(guān)性。此外，本研究也存在一定的局限性，如樣本量較少，且T2DM發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，可能有多個(gè)miRNA參與，受研究經(jīng)費(fèi)限制本研究?jī)H選擇了miR-18a、miR-125b進(jìn)行觀察，未來(lái)還需加大樣本量對(duì)此進(jìn)行拓展研究。