郭揚凱，陳麗麗，馮嬌嬌，劉雪梅，趙 利，白春清,

（1.江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌 330013；2.江西科技師范大學，有機功能分子研究所，江西南昌 330013）

美拉德反應又稱“非酶褐變反應”，是基于蛋白質(zhì)的ε-氨基與多糖還原性末端上的羰基之間發(fā)生的接枝反應[1]。該反應不需要任何化學試劑作為催化劑，食品加工中僅加熱就可使該反應自發(fā)進行，使蛋白質(zhì)與糖共價結(jié)合。美拉德反應接枝后，可提高蛋白的溶解性、乳化性及抗氧化活性。作為一種具有發(fā)展?jié)摿Φ牡鞍踪|(zhì)化學改性技術，美拉德反應受到國內(nèi)外研究者的普遍關注[2?4]。但傳統(tǒng)的美拉德改性方式如：水浴加熱、烘箱加熱等方式，往往存在反應時間長、受熱不均、能耗高等缺陷。微波加熱作為新型的加熱技術，其作用原理是通過加熱體內(nèi)部偶極分子高頻往復運動將微波能轉(zhuǎn)變成熱能，具有加熱速度快、熱量損失小、操作方便、加熱均勻等優(yōu)點，可以縮短工藝時間、提高生產(chǎn)效率、降低成本[5]。微波功率大小及微波加熱時間長短是影響加熱快慢的關鍵因素，同時pH的高低也是影響美拉德改性的主要因素[6]。目前關于微波提取及微波殺菌方面的研究報道較多，而關于微波法進行美拉德反應改性的研究較少[7]。

乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀后存在于乳清中的天然蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其安全無毒，消化利用率高（95%以上），營養(yǎng)豐富，且具有良好的乳化性能，被廣泛應用于乳品、焙烤食品等領域[8?11]。但天然蛋白的一些缺點如抗氧化性有限，在等電點附近溶解性差、乳化性不理想等，限制了其在食品工業(yè)特別是在乳化包埋體系中的進一步應用[12]。

因此，本研究擬采用微波加熱處理促進美拉德反應對乳清分離蛋白進行改性，研究主要因素（微波功率、微波加熱時間、pH及糖-蛋白質(zhì)比例）在微波處理過程對乳蛋白功能性質(zhì)（乳化性、抗氧化性）的影響，優(yōu)化改性工藝，并對反應進程中二級結(jié)構變化及氨基酸組成進行深入分析，探討作用機制，以期為微波加熱在蛋白質(zhì)化學改性中的進一步應用提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白（蛋白含量91%~92%） Glanbia公司；乳糖、大豆油、十二烷基硫酸鈉（SDS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司

BSA224S-CW型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；T25高速剪切乳化機 德國IKA集團；JB-3型磁力攪拌器 上海雷磁新徑儀器有限公司；UV-2600紫外分光光度計 上海儀器有限公司；微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司；FTIR Nicolet5700 紅外 美國Nexus儀器公司；HITACHI L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 美拉德反應產(chǎn)物制備 參照Kim等[13]的方法稍作改進。稱取一定量的WPI溶于蒸餾水配制成濃度為50 mg/mL WPI溶液，按質(zhì)量比5:5稱取乳糖，充分攪拌溶解后，用0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH8.5，分裝到50 mL玻璃樣品瓶后置于微波爐中，在560 W功率下加熱反應9 min后，立即取出冷卻至室溫，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 乳化性評價 通過測定樣品的乳化活性及乳化穩(wěn)定性評價其乳化性：稱取MRPs，溶解于去離子水中，配成蛋白濃度為1 mg/mL的溶液。在常溫下攪拌1 h后，取9 mL MRPs溶液與1 mL大豆油混合，放入50 mL離心管中。在機械乳化機下乳化1 min（轉(zhuǎn)速12000 r/min），取樣點固定在離離心管底部0.5 cm處，取50 μL的乳化液與5 mL，0.1%的SDS混合，在500 nm處測定樣品吸光度值A0，用0.1%的SDS做空白對照。

以乳化活力指數(shù)（Emulsification Activity Index,EAI）表示蛋白的乳化活性：

式中：N：稀釋倍數(shù)=100，C：乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度（g/mL），2.303：換算常數(shù)，φ：乳化液中油的體積分數(shù)（V/V，φ=0.10）。

靜置10 min后重新取樣測定吸光值（A10），乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)（Emulsifying Stability Index,ESI）表示：

1.2.3 抗氧化活性的測定 0.1 mmol/L DPPH溶液的配制：精密稱取DPPH 10 mg，用無水乙醇溶解并定容至250 mL棕色容量瓶中，得濃度為0.004%的DPPH溶液（0.1 mmol/L），避光保存，備用。1 mg/mL美拉德產(chǎn)物（以WPI含量計）樣品液的配制：按照反應前蛋白質(zhì)量為依據(jù)，配制蛋白含量為1 mg/mL的美拉德產(chǎn)物樣品液。測定：取配制好的樣品溶液2.0 mL，置于10 mL試管中，加入2.0 mL的DPPH溶液，室溫避光反應30 min，同時分別以蒸餾水、無水乙醇替代樣品、DPPH溶液作為試劑空白，于517 nm波長處測定吸光值。DPPH自由基清除率計算：按下列公式計算各濃度樣品對DPPH自由基的清除率：

式中，A0：2.0 mL蒸餾水+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值；A1：2.0 mL樣品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值；A2：2.0 mL樣品溶液+2.0 mL無水乙醇的吸光度值；試劑空白：2.0 mL蒸餾水+2.0 mL無水乙醇。

1.2.4 制備條件對MRPs功能特性的影響 蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)取決于美拉德反應的進程，而制備條件又是影響反應體系的關鍵因素[14?16]。本研究在前期實驗研究的基礎上，采用固定單一變量法，系統(tǒng)研究微波條件（微波加熱時間、功率）、pH、復合物比例對MRPs乳化性和抗氧化活性的影響。

1.2.4.1 微波加熱時間、功率對MRPs功能特性的影響 固定乳糖與WPI質(zhì)量比為5:5，反應混合物pH為8.5，分別考察微波加熱時間（0、1、3、5、7、9、11、13、15 min）及微波功率（320和560 W）對WPIMRPs乳化性及抗氧化活性的影響。

1.2.4.2 pH對MRPs功能特性的影響 固定乳糖與WPI質(zhì)量比為5:5，微波功率560 W，考察不同反應pH（7、7.5、8、8.5、9）條件下，分別加熱7和9 min對WPI-MRPs乳化性及抗氧化活性的影響。

1.2.4.3 乳糖與WPI質(zhì)量比對MRPs功能特性的影響 固定微波功率560 W，反應混合物pH為8.5，考察微波加熱時間7 min，乳糖與WPI質(zhì)量比（5:3、5:4、5:5、5:6、5:7、5:8）對WPI-MRPs乳化性及抗氧化活性的影響。

1.2.5 正交試驗 根據(jù)單因素實驗，選取影響較大的三個因素（A微波加熱時間、B pH、C WPI與乳糖質(zhì)量比），以ESI為主要指標按照表1做L9（34）工藝正交設計，篩選對MRPs乳化性改善最佳的反應條件。

表 1 L9（34）正交設計因素水平Table 1 Factor and level of L9(34) orthogonal design

1.2.6 紅外光譜分析 稱取適量樣品，進行冷凍干燥后，按質(zhì)量比1:100分別與光譜純KBr混合，于瑪瑙研缽（紅外專用）中充分均勻，壓成薄片后，用傅立葉紅外光譜儀對不同加熱時間（0、3、7、15 min）作全波長（4000~400 cm?1）掃描。利用Omnic 6.0軟件對酰胺I帶圖譜（1700~1600 cm?1）進行基線校正，二階求導，去卷積處理，并采用Origin軟件對去卷積后圖譜進行Gaussian擬合，得到各子峰，進行峰的歸屬及各子峰峰面積百分含量計算。

1.2.7 氨基酸分析 樣品經(jīng)濃鹽酸水解22 h后，旋蒸排酸，再過0.22 μm水系濾膜，用氨基酸自動分析儀（HITACHI L-8900型）測定氨基酸組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)均為3次實驗的平均值±標準偏差，并采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備條件對MRPs功能特性的影響

2.1.1 微波加熱時間、功率對MRPs功能特性的影響

2.1.1.1 微波加熱時間、功率對MRPs乳化性的影響

微波加熱時間、功率對WPI-MRPs乳化性及抗氧化活性的影響如圖1所示。圖1A、圖1B顯示，MRPs的乳化性及乳化穩(wěn)定性隨著微波加熱時間的延長呈先升高后降低的趨勢，并在9 min左右達到頂峰。據(jù)文獻所述，美拉德反應是一個連續(xù)進程，整個反應大致分成初期、中期和后期三個階段，在反應初期，水溶性糖的引入可使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構發(fā)生改變，促使處于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團暴露出來，在油-水界面發(fā)生變性，并伸向油相內(nèi)部，而糖份因其親水性附著在蛋白膜表面，提高蛋白質(zhì)乳化性的同時，增強了界面膜的穩(wěn)定性，有效阻止油滴的聚集，使乳化穩(wěn)定性增強[14]；當反應進入中后期，隨著交聯(lián)程度的升高，一方面，因破壞了雙親性的平衡，MRPs的界面活性大大降低，乳化性下降；另一方面，過度反應產(chǎn)生的蛋白交聯(lián)聚集，會生成一定的不溶物，使體系溶解度下降，溶解性降低，乳化性降低[15]。同時，實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，隨著反應時間的延長，體系前期顏色變化較少，而后期顏色加深，并出現(xiàn)褐色，說明反應進行到了中后期，且出現(xiàn)了焦糖化反應。以上研究結(jié)果與其他相關研究學者的結(jié)論基本一致，如：胡坤等[16]發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白和麥芽糊精的糖基化反應產(chǎn)物的乳化性隨著反應時間的延長經(jīng)歷了從上升到下降的過程；O’Regan等[17]指出美拉德反應初期得到的產(chǎn)物較為溫和，不僅不會減弱蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，反而能改善乳化性能，因此，要控制反應過程。

320、560、800 W為微波爐可調(diào)節(jié)的三個常用功率，因本實驗所用樣品為液態(tài)，800 W加熱功率過大，液體容易濺出，固選擇320、560 W兩個加熱功率展開研究[18]。不同微波功率對MRPs乳化性方面的影響結(jié)果顯示，高、低微波功率加熱處理樣品的ESI和EAI測定值隨加熱時間的變化趨勢基本一致，但560 W條件下樣品的ESI和EAI均高于320 W條件下的測定值，且高微波功率下MRPs的ESI和EAI峰值出現(xiàn)時間明顯早于低微波功率的測定值，說明微波功率的提高會加劇美拉德反應的進程。這可能是高功率有利于體系快速的升溫，從而加劇分子間的相互作用，使美拉德反應更容易發(fā)生[19]。在美拉德反應初期，蛋白質(zhì)的氨基與還原糖的醛基之間發(fā)生Shiff堿環(huán)化反應，后經(jīng)Amadori重排形成Amadori化合物[20]。微波加熱屬于內(nèi)發(fā)式加熱，體系的物理性質(zhì)（介電常數(shù)、密度、粘度、比熱等）及微波功率是影響升溫速度快慢的重要因素[21]。在物料固定的條件下，其升溫速度主要受控于微波功率，微波功率高，則促使體系中的極性分子以更快的速度進行運動摩擦生熱，并快速升溫，因此，高功率處理組的乳化性升高速度較低功率處理組快；另一方面，溫度越高，初期所生成的Amadori化合物進行脫水、降解的速率也越快，從而使美拉德反應較快地進入中后期，最終導致乳化性的拐點（560 W，7 min）較低功率處理組（320 W，9 min）有所提前[21]。

2.1.2 微波加熱時間、功率對MRPs抗氧化活性的影響 抗氧化活性是基于美拉德反應接枝產(chǎn)物的重要功能特性之一[22]。為了考察微波加熱時間、功率對美拉德反應復合物抗氧化能力的影響，本研究以乳清蛋白為對照，跟蹤監(jiān)測了乳糖-乳清蛋白體系分別在320和560 W微波加熱不同時間復合物對DPPH自由基清除率的能力大小，結(jié)果如圖2所示。可清晰地發(fā)現(xiàn)，隨著美拉德反應時間的延長，MRPs的DPPH自由基清除率逐漸增加，且高功率加熱組的測定值普遍高于低功率加熱組的測定值，如經(jīng)560、320 W分別加熱15 min后，DPPH自由基清除率由最初的1.29%分別達到12.17%和9.32%。美拉德反應產(chǎn)物是一個復雜的混合物，體系抗氧化能力的大小與復合物組成有很大關系，其中美拉德反應終產(chǎn)物—類黑精為主要的抗氧化物質(zhì)、Amadori產(chǎn)物的熱分解時生成的還原酮類化合物以及硫醇類雜環(huán)化合物具有一定的抗氧化活性，美拉德反應高級階段產(chǎn)生的N、S的揮發(fā)性雜環(huán)化合物，氫基以及吡咯也有抗氧化活性[23]。因此，本研究微波加熱處理可提高蛋白質(zhì)的抗氧化活性可能由于微波加熱促使蛋白質(zhì)分子結(jié)構伸展，提高了美拉德反應速率，產(chǎn)生更多具有較高抗氧化活性的中間產(chǎn)物和高級產(chǎn)物，加熱時間越長，產(chǎn)生的產(chǎn)物越多，抗氧化活性越高；而較高微波功率會使得更多蛋白分子伸展，從而促進反應的發(fā)生，生成更多的具有抗氧化性的產(chǎn)物。

圖 2 微波加熱時間、功率對MRPs抗氧化活性的影響Fig.2 Effects of microwave heating time and power on antioxidant activity of MRPs

圖 3 pH對MRPs乳化穩(wěn)定性（A）和乳化活性（B）的影響Fig.3 Effects of pH on ESI（A）and EAI（B）of MRPs

2.2 pH對MRPs功能特性的影響

2.2.1 pH對MRPs乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響pH是影響美拉德反應進程的一個重要參數(shù)[24]。一般來說，當體系在酸性條件下，蛋白質(zhì)分子中的氨基處于質(zhì)子化狀態(tài)，糖堿基C1因受正電荷的影響更易于進行1、2-烯醇化轉(zhuǎn)化，而難以進行葡胺縮合反應，且其縮合產(chǎn)物易于水解，因而，酸性條件不利于美拉德反應的進行；當體系處于堿性條件下時，糖堿基C1上電子云密度增大，體系更易于2,3-烯醇化反應生成還原酮類和脫氫還原酮類，即堿性條件易于美拉德反應的進行[25]。為了獲得較適宜的pH條件，考察了體系經(jīng)五個pH：7、7.5、8、8.5、9分別微波加熱7、9 min后的乳化活性性及乳化穩(wěn)定性，結(jié)果圖3所示。從圖3中可清晰地發(fā)現(xiàn)，雖微波加熱時間不同，pH對乳化性的影響整體一致，即隨著pH的升高（pH7~8.5），ESI都呈先升高再降低的趨勢，EAI都呈整體上升趨勢。美拉德體系成分多且反應復雜，在美拉德反應過程中，一方面，因親水性糖分子的引入，蛋白質(zhì)自身的親水/疏水平衡被打破，蛋白質(zhì)親水性提高，分子內(nèi)部疏水基團暴露，油-水界面的相互作用提高（蛋白質(zhì)乳化大豆油），乳化活性增強的同時，界面膜的厚度和機械強度增加，乳化穩(wěn)定性提高；另一方面，溫度過高，反應過于劇烈，也會使蛋白質(zhì)高度變性，結(jié)構及內(nèi)部基團被破壞，出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集、絮凝，乳化性能降低[26?27]。在pH7~8.5范圍內(nèi)，ESI和EAI都隨著堿性條件的增強而升高，說明堿性環(huán)境易于乳糖與WPI間的接枝反應，且多糖分子的空間位阻效應一定程度上減少了WPI分子間的熱聚集。而pH9.0時，乳化穩(wěn)定性下降，可能是過堿環(huán)境在促進美拉德反應接枝的同時也加速了反應終產(chǎn)物的產(chǎn)生，外加蛋白質(zhì)間的熱聚集的綜合影響，導致復合物乳化性能降低[15,25]。同時也發(fā)現(xiàn)，相同pH條件下（7~8），長時間加熱組的乳化活性及乳化穩(wěn)定性均高于對應短時間加熱組的測定值，而當pH升至8.5~9時，短時加熱組的測定值反而高于長時間加熱組。反應條件（溫度、pH、時間、蛋白質(zhì)與多糖比例等）都是影響美拉德反應進程的常見因素[15]。一方面，微波加熱時間越長，體系所受的高溫加熱時間越長，在低pH條件下，pH高低為接枝改性的關鍵受控因素，微波加熱時間越長，體系所受的高溫加熱時間越長，接枝反應越徹底，乳化性能越好。而高pH具有促進反應進程的作用，體系產(chǎn)生最佳乳化性能復合物所需時間縮短，加熱時間過長，體系產(chǎn)生更多中后期產(chǎn)物，體系乳化性能降低。

2.2.2 pH對MRPs抗氧化活性的影響 在前期微波功率、時間對MRPs功能特性的影響實驗中，發(fā)現(xiàn)7、9 min在選定的微波功率（560 W）下，乳化性后者略低于前者，而其抗氧化活性高于前者，為了綜合系統(tǒng)研究pH對MRPs功能特性的影響，設定加熱時間分別為7、9 min進行了研究。圖4顯示不同加熱時間下，MRPs自由基清除率隨著pH的變化規(guī)律基本一致，即隨著pH的升高自由基先升高后降低，其中在pH7~8.0之間自由基清除率上升幅度較大，從3.86%升高至6.34%（加熱7 min），在pH8~8.5之間上升幅度較小，當pH為9.0時，測定值低于8.5測定值。在pH為8~9范圍內(nèi)測定值波動不大，基本保持恒定。同時也可發(fā)現(xiàn)，同一pH下，長時間加熱組的自由基清除率普遍高于短時加熱組的測定值，如pH8.5時，加熱7和9 min的自由基清除率分別為6.60%和7.26%，且在pH9.0時，都呈現(xiàn)微弱的降低趨勢。低pH條件下，清除率的升高可能源于堿性條件易于美拉德反應的進行，從而產(chǎn)生較多的中間產(chǎn)物，抗氧化活性提高；而8~8.5可能為較適宜的pH反應條件，美拉德反應進程差別較小，產(chǎn)物組分較為類似，自由基清除率差別不大；而過堿環(huán)境可能加速了反應的進程，使體系在加熱7 min時已經(jīng)產(chǎn)生了大量的反應終產(chǎn)物，并促進了終產(chǎn)物的分解，產(chǎn)生了一定量的抗氧化性相對較弱的產(chǎn)物，而使體系抗氧化性有所降低[25]。

圖 4 pH對MRPs抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of pH on antioxidant activity of MRPs

2.3 乳糖與乳清蛋白質(zhì)量比對MRPs功能特性的影響

2.3.1 乳糖與乳清蛋白質(zhì)量比對MRPs乳化性的影響 由圖5、圖6可以發(fā)現(xiàn)，隨著乳糖比例的增加，MRPs的乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）和乳化活力指數(shù)（EAI）呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，并且在乳糖與乳清粉質(zhì)量比為5:5時，乳化活性及乳化穩(wěn)定性達到最佳狀態(tài)。研究表明，美拉德反應程度高低與還原糖含量大小有關，在蛋白質(zhì)質(zhì)量固定的條件下，還原糖添加量越大，被接枝的氨基就越多，在進行乳化性評價過程中，MRPs在油-水界面可以更加有序緊密的排列，從而形成更為致密的蛋白膜，因此其乳化性得以提高；但當還原糖添加量過高時，生成大量中間產(chǎn)物和類黑精等不具備雙親性質(zhì)的物質(zhì)越多，導致乳化性能下降[14?15]。

圖 5 乳清蛋白與乳糖質(zhì)量比對MRPs乳化穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of the ratio of whey protein to lactose on the emulsion stability of MRPs

圖 6 乳清蛋白與乳糖質(zhì)量比對MRPs乳化活性的影響Fig.6 Effect of the ratio of whey protein to lactose on the emulsifying activity of MRPs

2.3.2 乳糖與乳清蛋白質(zhì)量比對MRPs抗氧化活性的影響 圖7顯示了美拉德復合物DPPH自由基清除率隨不同乳清蛋白-乳糖質(zhì)量比的變化，根據(jù)圖像顯示，當增大乳清蛋白-乳糖質(zhì)量比時，MRPs DPPH自由基清除率也跟著增加，在質(zhì)量比為5:5時達到最大，而隨著乳糖加入量的繼續(xù)增加，MRPs DPPH自由基清除率反而逐漸減小。這種變化趨勢與乳化性的變化趨勢較為類似。乳糖添加量的提高易于美拉德反應的進行，從而產(chǎn)生較多具有抗氧化活性的物質(zhì)，從而提高自由基清除率；而過多的乳糖反而減低了接枝反應的速率，而導致反應產(chǎn)物較少，抗氧化性下降[23]。

圖 7 乳清蛋白與乳糖質(zhì)量比對MRPs抗氧化性的影響Fig.7 Effect of weight ratio of whey protein to lactose on the antioxidant activity of MRPs

2.4 正交試驗

根據(jù)單因素實驗，得知加熱時間、乳糖-乳清粉質(zhì)量比和pH對美拉德反應復合物的乳化性影響較大，本研究以ESI為主要指標進行了L9（34）工藝正交實驗，結(jié)果如表2所示。

表 2 L9（34）工藝正交試驗設計結(jié)果Table 2 Result of the L9(34) orthogonal experiment

從極差分析能得出，影響MRPs乳化穩(wěn)定性指數(shù)的各因素主次順序為：pH>時間>乳清蛋白與乳糖質(zhì)量比。根據(jù)Ki值，得到MRPs乳化穩(wěn)定性指數(shù)的最佳條件為A2B2C2，即：加熱時間7 min、pH為8.5、乳清蛋白與乳糖質(zhì)量比為5:5。同法，以DPPH自由基清除率為指標開展的正交試驗（數(shù)據(jù)未顯示，設定反應時間水平為11、13、15 min，其他條件同乳化性因素水平表）得知，對MRPs DPPH自由基清除率影響最大的因素為微波加熱時間，其次為pH，最后是乳清蛋白-乳糖質(zhì)量比，獲得具有較高抗氧化活性MRPs DPPH的最優(yōu)反應條件為：pH8.5、乳清蛋白-乳糖質(zhì)量比5:5、反應時間15 min。因此，綜合分析可以確定pH8.5、乳清蛋白-乳糖質(zhì)量比5:5為高乳化性、抗氧化活性MRPs較優(yōu)的制備條件；但對MRPs DPPH自由基清除率而言，反應時間越長，抗氧化活性越高，而伴隨著加熱時間的延長，較多中后期產(chǎn)物產(chǎn)生，體系乳化性降低，綜合考慮選定加熱時間7 min；確定制備兼具抗氧化活性，乳化活性的MRPs條件為pH8.5、乳清蛋白-乳糖質(zhì)量比5:5、反應時間7 min。在該條件下制備所得MRPs的EAI、ESI和DPPH自由基清除率分別為0.35 m2/g、88.39 min和6.60%。

2.5 紅外吸收光譜

紅外吸收帶的波數(shù)位置、波峰的數(shù)目以及吸收譜帶的強度反映了分子結(jié)構上的特點，可以用來鑒定化合物的結(jié)構組成或通過分析功能基團特征譜帶的變化推測化合物之間的相互反應[28]。當還原糖與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應后，主要的變化特征是分子中的N-H和C=O數(shù)量明顯的增加。具體表現(xiàn)在：a.在WPI中因N-H變形振動或羥基伸縮振動產(chǎn)生的3700~3200 cm?1范圍內(nèi)較寬的譜帶經(jīng)微波加熱后向低波數(shù)方向移動，并伴隨譜帶變寬強度變大，且最大吸收峰由原來的3411.57 cm?1處移至3393.76 cm?1處，這可能是由于新物質(zhì)共價交聯(lián)出現(xiàn)了新的NH鍵所致；乳清蛋白在1651 cm?1酰胺Ⅰ帶的尖銳吸收峰主要是因C=O鍵面內(nèi)伸縮振動引起，且微波處理后最大吸收波長向低波數(shù)方向移動，與未加熱處理組相比，微波加熱3 min與7 min樣品波數(shù)有所降低，但二者間差異不大，微波加熱15 min后最大吸收波長有所降低，且在1610 cm?1附近出現(xiàn)新的吸收峰。在酰胺Ⅲ帶1400 cm?1左右同時出現(xiàn)的尖銳的吸收峰（圖8），主要是C-N伸縮振動和N-H面內(nèi)變形振動引起的，反應后吸收明顯增強且加寬，說明CN鍵明顯增多，即還原糖以共價鍵的形式連接在了WPI的N-H上。900 cm?1附近的吸收峰表示不飽和鍵的多少，微波處理3 min后這個波數(shù)附近峰的形狀有幾乎沒有變化，隨著微波加熱時間的延長，原本位于894 cm?1附近的吸收峰向低波數(shù)方向移動，并在925 cm?1處出現(xiàn)新的吸收峰（7 min），這可能是美拉德反應產(chǎn)生的一些烯醇等中間體，而微波處理15 min后，在該處的吸收峰強度明顯加大，這可能與糖基化產(chǎn)物裂解產(chǎn)生較多的不飽和醛酮類物質(zhì)有關[21]。

圖 8 不同加熱時間的MRPs紅外光譜Fig.8 Infrared spectra of MRPs after heated for different time

圖 9 MRPs酰胺Ⅰ帶的紅外光譜及高斯曲線擬合圖Fig.9 Infrared spectra and Gaussian fitting curves in amide Ⅰ region of MRPs

綜上所述，微波加熱過程中，乳糖與WPI通過共價鍵發(fā)生締合，隨著加熱時間的延長產(chǎn)生了復雜的美拉德中間產(chǎn)物和醛酮類化合物。

圖9 為MRPs 酰胺Ⅰ帶的紅外光譜及高斯曲線擬合圖。反應起始時，體系α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲，分別為26.47%、27.85%、18.73%、26.96%，隨著加熱時間的延長，α-螺旋呈整體上升趨勢，而β-折疊有明顯的降低，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構變化趨勢有點復雜。其中，微波加熱3 min樣品與0 min相比，可發(fā)現(xiàn)α-螺旋略有降低，β-折疊降低了4.19%，而β-轉(zhuǎn)角升高了8.90%，無規(guī)則卷曲降低了2.73%；加熱7 min樣品二級結(jié)構與3 min相比，除β-折疊有所降低，其他二級結(jié)構變化不大；而熱15 min后，α-螺旋升高至30.63%，β-折疊持續(xù)降低至16.65%，β-轉(zhuǎn)角又降低至25.05%，無規(guī)則卷曲略微升高至27.67%。α-螺旋和β-折疊屬于緊密有序結(jié)構，β-轉(zhuǎn)角屬于比較松散的部分有序結(jié)構，而無規(guī)則卷曲為松散的無序結(jié)構[29]。由表3可知，未微波前，α+β結(jié)構占比高達54.32%，即此時乳清蛋白分子內(nèi)部主要由緊密有序結(jié)構組成，分子內(nèi)部的氫鍵作用力較強。隨著微波加熱時間的延長乳清蛋白分子中α+β結(jié)構占比呈降低趨勢，加熱15 min后，占比降至47.28%，說明微波加熱促使蛋白質(zhì)結(jié)構由緊密向松散結(jié)構轉(zhuǎn)化呈現(xiàn)出“溶脹”狀態(tài)，在轉(zhuǎn)變的過程中，涉及到大部分緊密有序結(jié)構首先轉(zhuǎn)變成松散有序結(jié)構，進而轉(zhuǎn)變成松散無序狀態(tài)，并可能伴隨小部分緊密結(jié)構經(jīng)長時間加熱后相互轉(zhuǎn)變（有待進一步驗證）。

表 3 MRPs酰胺Ⅰ帶譜帶指認結(jié)果Table 3 Band assignments in the amide Ⅰ spectral region of MRPs

2.6 氨基酸含量分析

組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20多種，但絕大多數(shù)的蛋白只有20種氨基酸組成[30]。本研究采用鹽酸水解蛋白質(zhì)制備氨基酸溶液，并對其進行測定。表4顯示：微波加熱0、7、15 min后，總氨基酸含量分別為162.850、149.173、144.950 nmol/L，即隨著反應時間的延長，總氨基酸含量呈減少的趨勢，這與之前的研究報道較為一致[18]。從氨基酸組成來看，20種常見氨基酸中，半胱氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺（表中未列出）未被檢出，可能是鹽酸破壞了上述氨基酸結(jié)構所致[18]；微波加熱后大部分氨基酸含量有所降低，且微波加熱時間越長含量越低，如：甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸；而脯氨酸經(jīng)微波加熱后含量略有升高；其它氨基酸如天門冬氨酸、蘇氨酸等則變化較為復雜。張?zhí)m[18]曾開展的微波加熱對酪蛋白-乳糖混合物總氨基酸分析結(jié)果表明微波處理會降低體系的總氨基酸含量，且微波功率越大，總氨基酸降低幅度越大，這可能是游離氨基酸參與了美拉德反應，并在反應中轉(zhuǎn)變成其他物質(zhì)所致[21,25]。有研究報道[31]認為因賴氨酸和精氨酸分子上存在參與美拉德反應的ε-氨基，導致美拉德反應進程中其含量有所降低。因美拉德反應較為復雜，在反應的進程中是否存在氨基酸降解、其降解歷程如何等系列問題，有待進一步研究。

表 4 樣品氨基酸組成測量成果Table 4 Amino acid composition results

3 結(jié)論

以ESI、EAI及DPPH自由基清除率為指標，系統(tǒng)考察了微波功率、時間、pH、乳糖與乳清蛋白質(zhì)量比等Maillard反應的主要參數(shù)對MRPs功能性質(zhì)的影響，結(jié)合正交試驗結(jié)果，綜合分析確定獲得較高乳化性、抗氧化活性的微波條件為：微波功率560 W，pH8.5，乳糖與乳清蛋白質(zhì)量比5:5，微波加熱時間7 min。紅外分析結(jié)果表明乳糖與WPI進行了共價結(jié)合，微波加熱促進了該反應的進行，并產(chǎn)生了負責的中間產(chǎn)物及醛酮類化合物；氨基酸測定結(jié)果顯示微波反應會降低體系總氨基酸含量；但是反應過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構是否存在相互轉(zhuǎn)化，是否存在氨基酸的降解及其降解歷程如何等問題有待進一步證實。