王 迪，王 穎,2,3,4, ，張艷莉，佐兆杭，劉淑婷，張 裕，李志芳

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）

現(xiàn)如今越來越多消費(fèi)者追求營養(yǎng)的多樣性、易于吸收性和平衡性，酵素發(fā)酵飲料作為新型功能性食品逐漸被大眾喜愛。食用酵素是以一種或多種新鮮果蔬、豆谷類、藥食兩用食材等為原料，經(jīng)多種益生菌發(fā)酵制得的富含酶、益生菌、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[1?2]，具有解酒護(hù)肝[3?4]、美白抗氧化[5?7]、降糖降脂[8?10]等功效。

蕓豆（Phaseolus vulgarisLinn）學(xué)名菜豆，屬蝶形花科的小宗雜糧作物[11]，是栽培面積僅次于黃豆的豆類農(nóng)作物[12]。蕓豆富含蛋白質(zhì)、維生素、皂苷等營養(yǎng)成分，蕓豆膳食纖維[13]、山奈酚[14?15]、槲皮素[16]可持續(xù)性調(diào)控機(jī)體糖代謝紊亂，改善胰腺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體功能，維持血糖水平穩(wěn)態(tài)。蕓豆抗性淀粉[17]、α-淀粉酶抑制劑[18]可以降低高脂血癥大鼠血脂代謝水平，改善氧化應(yīng)激并調(diào)控腸道微生物平衡。黃酮類化合物對(duì)心血管疾病[19?20]、癌癥[21?22]等老年疾病有積極的預(yù)防、緩解和治療作用。蕓豆提取物還具有補(bǔ)腎利氣、抗炎抑菌[23?24]、利水消腫等多種功效，是開發(fā)功能性食品的優(yōu)質(zhì)原料。

基于蕓豆主要以鮮食為主，存在加工形式及企業(yè)較少、綜合利用程度差等問題，同時(shí)目前鮮見復(fù)合益生菌發(fā)酵蕓豆酵素的研究，其代謝產(chǎn)物及抗氧化能力亦沒有報(bào)道。監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系代謝產(chǎn)物及抗氧化活性，是反映蕓豆酵素發(fā)酵進(jìn)程、產(chǎn)品品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值的重要依據(jù)。因此，本文以蕓豆酵素為研究對(duì)象，研究不同發(fā)酵時(shí)間代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，分析其抗氧化能力，為蕓豆高值利用及精深加工產(chǎn)業(yè)鏈提供新思路，同時(shí)為綜合開發(fā)兼具蕓豆和益生菌營養(yǎng)保健價(jià)值的蕓豆酵素產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫花蕓豆 黑龍江省黑河市；白砂糖 市售；安琪牌活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)菌庫；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus） 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；耐高溫α-淀粉酶（20000 U/mL）、糖化酶（10000 U/mL） 上海源葉生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ） 北京中生瑞泰科技有限公司；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 美國Sigma公司；葡萄糖、氯化鐵、氫氧化鈉、福林酚（10%）、碳酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇 國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

BS224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；JYL-Y912料理機(jī) 九陽股份有限公司；S220 pH計(jì) 瑞典波通儀器公司；DGG-9023A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；V-5100B可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；HH-1S數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司；YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌器 濟(jì)南捷島分析儀器有限公司；H1850R冷凍離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司；BCV-6S1超凈工作臺(tái) 浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；ATC-32手持式折光儀 上海淋譽(yù)貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 菌種的活化與培養(yǎng) 取甘油保存的菌液100 μL于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，無菌操作臺(tái)中劃線接入MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37 ℃，24 h），連續(xù)接種3代，使其充分活化。挑取斜面培養(yǎng)基生長較好菌落接種至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37 ℃，24 h），搖勻后移取10%（v/v）菌液至液體培養(yǎng)基（37 ℃，24 h），得到擴(kuò)大培養(yǎng)的乳酸菌菌懸液，待用?；钚愿山湍赣?0倍體積蒸餾水中溶解，30~35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，待用。

1.2.3 蕓豆酵素的制備 紫花蕓豆清洗后去皮，按1:3（g/mL）料水比打漿。雙酶法進(jìn)行水解，液化條件：α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH6.0、酶解溫度97 ℃、時(shí)間20 min；糖化條件：加酶量200 μL/100 mL、pH4.5、溫度60 ℃、時(shí)間30 min。酶解液于高速離心機(jī)中以1.0×104r/min離心15 min，得到蕓豆清汁。調(diào)清汁pH4.0，添加6%白砂糖后滅菌。接種0.2%酵母菌于32 ℃恒溫振蕩預(yù)發(fā)酵24 h，再接種3%復(fù)配乳酸菌（植物乳桿菌:嗜酸乳桿菌=1:1）32 ℃恒溫發(fā)酵24 h。4 ℃后發(fā)酵并保藏。分別在發(fā)酵0、8、16、24、32、40、48、56 h時(shí)取樣，離心后取上清液，待測(cè)。

1.2.4 pH和總酸含量的測(cè)定 采用精密pH計(jì)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間的蕓豆酵素的pH。參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定方法》測(cè)定各樣品總酸含量。

1.2.5 還原糖含量的測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸法進(jìn)行測(cè)定[25]。取0.05、0.01、0.15、0.20、0.25、0.30 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）于10 mL試管中，去離子水補(bǔ)至1 mL，加入3 mL DNS試劑，混勻后在沸水浴中加熱5 min，冷卻后定容至10 mL，室溫放置30 min，去離子水作為空白對(duì)照，520 nm下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取稀釋待測(cè)液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=0.1218x?0.1523，R2=0.9952計(jì)算發(fā)酵液中還原糖含量（以葡萄糖計(jì)）。

1.2.6 可溶性固形物的測(cè)定 使用折光儀測(cè)定各樣品可溶性固形物含量。打開進(jìn)光板，用柔軟絨布將折光棱鏡擦拭干凈。將蒸餾水?dāng)?shù)滴，滴在折光棱鏡上，輕輕合上進(jìn)光板，使溶液均勻分布于棱鏡表面，并將儀器進(jìn)光板對(duì)準(zhǔn)光源或明亮處，調(diào)整明暗分界線置于零位。擦凈蒸餾水，取一滴蕓豆酵素溶液代替蒸餾水滴于折光棱鏡上，記錄視場(chǎng)相應(yīng)刻度值。

1.2.7 總酚含量的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteus法測(cè)定[26]，200 μL樣品溶液與0.5 mL福林酚混勻，加入2.3 mL去離子水，放置1 min后加入7.5%（g/mL）碳酸鈉溶液2 mL，混勻，室溫下暗反應(yīng)2 h。測(cè)定760 nm波長下的吸光度值，去離子水代替樣品作為空白對(duì)照。沒食子酸（0~250 μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=0.0045x?0.0022（R2=0.9905）。

1.2.8 黃酮含量的測(cè)定 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定[27]。取500 μL待測(cè)發(fā)酵液，加入5% NaNO2溶液150 μL，搖勻靜置6 min。加入10% Al（NO）3溶液150 μL，搖勻靜置6 min。再加入4% NaOH溶液2 mL，95%乙醇定容，搖勻靜置15 min，510 nm處測(cè)吸光值。

1.2.9 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.9.1 還原力的測(cè)定 參照武悅等[28]的方法制備FRAP試劑。1 mL發(fā)酵原液與5 mL FRAP試劑混合，37 °C水浴中反應(yīng)10 min，以去離子水為空白對(duì)照，于593 nm處測(cè)定吸光度值。FeSO4（0~50 μmol/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=0.0307x?0.0132（R2=0.9975）。

1.2.9.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定 參照白海娜等[29]的方法制備ABTS溶液，1.5 mL酵素原液中加入1.5 mL ABTS溶液，蒸餾水代替ABTS溶液作為對(duì)照管，蒸餾水代替酵素原液作為空白管，室溫避光放置6 min，734 nm測(cè)定其吸光度，計(jì)算公式如下：

式中：A1：1.5 mL ABTS溶液與1.5 mL蒸餾水的吸光度值；A2：1.5 mL ABTS溶液與1.5 mL酵素原液的吸光度值；A3：1.5 mL酵素原液與1.5 mL蒸餾水的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 pH和總酸含量的變化

pH是衡量發(fā)酵過程是否正常的重要條件，酸度是衡量酵素成熟度及發(fā)酵液品質(zhì)的主要指標(biāo)之一[30]。由圖1可知，發(fā)酵液pH隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷降低，總酸含量則逐漸升高。經(jīng)48 h發(fā)酵，蕓豆酵素pH由4.01降低至3.44，總酸含量從發(fā)酵初期0.03 g/100 mL至后期增漲至0.57 g/100 mL。發(fā)酵前期總酸含量增幅明顯，分析原因該階段酵母菌大量增殖，在厭氧條件下利用發(fā)酵液中的糖原產(chǎn)生CO2及乙醇，部分CO2溶于發(fā)酵液，同乳酸作用，降低發(fā)酵液pH的同時(shí)增加總酸含量。接種乳酸菌后其分泌酶水解發(fā)酵液中碳源為單糖后進(jìn)一步利用產(chǎn)生大量乳酸、蘋果酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致發(fā)酵液pH持續(xù)降低，總酸含量穩(wěn)定增長。蕓豆酵素發(fā)酵56 h時(shí)，發(fā)酵液營養(yǎng)物質(zhì)基本被完全消耗，乳酸菌利用有機(jī)酸作為代替碳源來維持自身增殖代謝等生物過程，使得總酸含量小幅度升高。發(fā)酵體系含多種有機(jī)酸，可抑制部分有害菌的生長，同時(shí)形成了蕓豆酵素的獨(dú)特風(fēng)味[31]。

圖 1 蕓豆酵素發(fā)酵過程中pH、總酸含量變化Fig.1 Changes of pH and total acid content in the fermentation process of kidney bean Jiaosu

2.2 還原糖含量與可溶性固形物含量的變化

糖作為碳源是微生物發(fā)酵的重要營養(yǎng)物質(zhì)，其含量的變化是反應(yīng)酵素液中微生物活動(dòng)情況的指標(biāo)之一[32]。由圖2所示，還原糖含量僅在前8 h呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷降低。這可能是由于發(fā)酵初期優(yōu)勢(shì)菌種酵母菌在蔗糖酶的作用下將蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖，使發(fā)酵液中還原糖含量增加。發(fā)酵8~24 h時(shí)，還原糖含量下降較快，該階段酵母菌已適應(yīng)此時(shí)發(fā)酵環(huán)境，大量的葡萄糖和果糖被利用生成乙醇用于代謝生長。發(fā)酵液中果糖等游離糖利于乳酸菌等厭氧微生物增殖生長，接種乳酸菌其自身分泌β-半乳糖苷酶等水解酶分解乳糖成葡萄糖和半乳糖，并通過糖酵解等代謝途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乳酸，還原糖逐漸減少。發(fā)酵48 h時(shí)，還原糖含量為3.55 mg/mL并趨于平緩，證明發(fā)酵已基本結(jié)束。

圖 2 蕓豆酵素發(fā)酵過程中還原糖、可溶性固形物含量變化Fig.2 Changes of reducing sugar and soluble solids content in the fermentation process of kidney bean Jiaosu

可溶性固形物含量可較為直觀反映發(fā)酵液品質(zhì)，若含量過高，發(fā)酵體系滲透壓升高易破壞發(fā)酵菌種細(xì)胞壁及細(xì)胞膜特性，導(dǎo)致生長周期停滯或凋亡；含量過低，發(fā)酵液口感酸，影響產(chǎn)品風(fēng)味[33]。由圖2可知，蕓豆酵素可溶性固形物含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長持續(xù)下降并趨于穩(wěn)定，經(jīng)48 h的發(fā)酵，發(fā)酵液中可溶性固形物含量由17.07%降低至6.13%，發(fā)酵體系環(huán)境適宜，營養(yǎng)物質(zhì)充足，微生物在該階段迅速繁殖，大量且持續(xù)利用碳水化合物，使得蕓豆酵素可溶性固形物含量逐漸降低。

2.3 總酚與黃酮含量的變化

蕓豆酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化見圖3。總酚含量在發(fā)酵階段呈先迅速上升后小幅度下降而后繼續(xù)增長的趨勢(shì)。楊小幸等[30]研究表明發(fā)酵體系中酚類物質(zhì)含量的變化與發(fā)酵原料、發(fā)酵工藝條件及微生物種類密切相關(guān)。與未發(fā)酵清汁相比，發(fā)酵24 h的蕓豆酵素總酚含量顯著增長約1.4倍，分析原因是原料中酚類物質(zhì)溶出，其一發(fā)酵前期發(fā)酵液營養(yǎng)物質(zhì)充足，微生物大量繁殖代謝產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，這些有機(jī)酸及酶類可溶出蕓豆中的酚類物質(zhì)；其二高糖濃度形成高滲透壓體系，導(dǎo)致原料大量酚類物質(zhì)的溶出并呈游離態(tài)[34]。發(fā)酵32 h時(shí)，總酚含量略微降低，可能是由于多酚類物質(zhì)具有抑菌效果，一定濃度的酚類物質(zhì)會(huì)抑制微生物的生長[35]，因此發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌種會(huì)產(chǎn)生降解酚類的物質(zhì)來維持自身正常繁殖代謝。此外，蛋白質(zhì)可以與多酚類物質(zhì)的多元?dú)滏I和疏水鍵發(fā)生反應(yīng)，也是可能造成多酚含量下降的因素之一[36]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，部分微生物逐漸適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境中的高濃度酚，將一些大分子酚類物質(zhì)降解為單體酚或小分子量酚類物質(zhì)[34]，發(fā)酵56 h時(shí)，發(fā)酵液總酚含量進(jìn)一步增長至367.90 mg/mL。

圖 3 蕓豆酵素發(fā)酵過程中總酚、黃酮含量變化Fig.3 Changes of total phenol content and flavonoid content during fermentation of kidney bean Jiaosu

由圖3可知，蕓豆酵素發(fā)酵過程中總黃酮含量呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)，由初期30.02 mg/mL迅速上升至56 h的92.31 mg/mL，增漲約3倍且具有顯著性差異（P<0.05）。發(fā)酵前期優(yōu)勢(shì)菌種酵母菌生長代謝旺盛產(chǎn)生乙醇，溶解了大部分不溶或難溶于水的黃酮類物質(zhì)，造成發(fā)酵液黃酮含量的迅速增加。整個(gè)發(fā)酵過程中，發(fā)酵體系中黃酮類物質(zhì)始終以不同速率累積，一方面，發(fā)酵液的高滲環(huán)境及微生物的活動(dòng)致使植物細(xì)胞破裂，原料中抗氧化物質(zhì)滲出與合成，同時(shí)酵母菌及乳酸菌代謝產(chǎn)生酶系將部分碳源轉(zhuǎn)化為可以發(fā)生顯色反應(yīng)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)[37]。另一方面，發(fā)酵后期糖苷與游離態(tài)黃酮類物質(zhì)結(jié)合的黃酮醇配糖體被水解，造成發(fā)酵液黃酮類物質(zhì)含量的進(jìn)一步升高[38]。

2.4 還原力的變化

由圖4可知，接種酵母菌和乳酸菌后，發(fā)酵液還原力均顯著高于未發(fā)酵清汁，且還原力隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)不斷上升的變化趨勢(shì)。分析原因，酵母菌和乳酸菌均可通過產(chǎn)生NADH氧化酶、SOD、GSHPx等過氧化酶類物質(zhì)清除活性氧[39]。酵母菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，還原力最高可達(dá)0.72 μmol/L，可能是由于酵母菌自身含有的細(xì)胞壁多糖能夠清除如超氧陰離子自由基等活性氧。發(fā)酵56 h時(shí)，蕓豆酵素還原力為0.88 μmol/L，乳酸菌自身具備的抗氧化能力主要是代謝產(chǎn)物及菌體表面的抗氧化物質(zhì)發(fā)揮作用。范昊安等[40]研究表明相較于發(fā)酵初期，蘋果梨酵素的還原力顯著升高。適當(dāng)?shù)难娱L發(fā)酵時(shí)間有利于蕓豆酵素還原力的增強(qiáng)。

圖 4 蕓豆酵素發(fā)酵過程中還原力變化Fig.4 Reduction force changes during fermentation of kidney bean Jiaosu

表 1 蕓豆酵素發(fā)酵過程中各參數(shù)相關(guān)性Table 1 Correlation of various parameters in the fermentation process of kidney bean Jiaosu

2.5 ABTS+自由基清除率的變化

ABTS是一種穩(wěn)定存在的自由基，可與抗氧化成分發(fā)生反應(yīng)而使體系褪色，清除自由基能力由樣品對(duì)其吸光度的影響所反映[41]。蕓豆酵素發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除率的變化如圖5所示，發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除率呈現(xiàn)先快速上升后趨于平緩的趨勢(shì)。發(fā)酵前32 h，ABTS+自由基清除率從30.01%迅速上升至82.49%，隨后以小幅度趨勢(shì)上升至發(fā)酵后期趨于平緩，整個(gè)發(fā)酵過程蕓豆酵素ABTS+自由基清除率增漲約3倍。研究表明[30]，ABTS自由基清除能力與高濃度酚類、有機(jī)酸等物質(zhì)的芳香環(huán)數(shù)量、分子數(shù)量和羥基取代基的性質(zhì)密切相關(guān)。Floegel等[42]發(fā)現(xiàn)酚類化合物與ABTS+自由基清除率存在密切關(guān)系，分析其可能是造成蕓豆酵素具有高ABTS+自由基清楚能力的主要因素。

圖 5 蕓豆酵素發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除率變化Fig.5 ABTS+ radical scavenging rate during kidney bean fermentation

2.6 相關(guān)性分析

蕓豆酵素復(fù)合發(fā)酵過程中還原糖、總酚、黃酮等功能成分與還原力、ABTS+自由基清除率相關(guān)性分析結(jié)果如表1所示。還原力與ABTS+自由基清除率呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性（P<0.01），與周偏等[36]對(duì)諾麗酵素的研究結(jié)果一致。蕓豆酵素黃酮與還原力呈極顯著正相關(guān)（r=0.99，P<0.01），與ABTS+自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（r=0.98，P<0.01）；總酚與還原力、ABTS+自由基清除率均呈極顯著正相關(guān)（r=0.96，P<0.01），表明黃酮類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)是蕓豆酵素發(fā)酵過程中重要的抗氧化物質(zhì)。

3 結(jié)論

探究蕓豆酵素發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物含量以及抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，結(jié)果表明，pH呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，總酸變化趨勢(shì)與之相反。發(fā)酵初期還原糖含量小幅度上升后不斷降低至3.56 mg/mL。發(fā)酵56 h時(shí)可溶性固形物含量達(dá)到最低6.01%?？偡雍靠傮w呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，僅在發(fā)酵32 h時(shí)略微降低。與未發(fā)酵蕓豆清汁相比，發(fā)酵48 h的蕓豆酵素黃酮含量顯著提高3倍（P<0.05）。還原力和ABTS+自由基清除率呈現(xiàn)迅速升高后趨于平緩的趨勢(shì)，發(fā)酵大幅度提升蕓豆酵素的抗氧化能力，抗氧化活性的提高與總酚和黃酮含量的變化顯著正相關(guān)（P<0.05）。代謝產(chǎn)物含量的變化規(guī)律可以較為直觀反映發(fā)酵體系周期進(jìn)程以及發(fā)酵液生物活性物質(zhì)積累情況。蕓豆酵素代謝產(chǎn)物和抗氧化性的研究可為酵素產(chǎn)品的開發(fā)及推廣利用提供一定的理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。