劉宏錢， 宋朝暉， 梁巧米

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

呼吸道感染是臨床較為常見的感染性疾病，尤其是在嬰幼兒、老年人和免疫缺陷患者中，常常導(dǎo)致其出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，甚至死亡。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)道，2016年全球約有300萬例患者死于下呼吸道感染[1]。常見的呼吸道感染病原體包括病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體等。病毒性病原體主要有甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、偏肺病毒、腺病毒等。細(xì)菌性病原體有肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌等。大多數(shù)呼吸道感染具有相似的臨床癥狀，導(dǎo)致臨床醫(yī)生很難通過臨床癥狀鑒別病原體，而快速鑒定呼吸道感染的病原體對(duì)于臨床精準(zhǔn)診斷以及用藥具有重要意義。過去幾年，分子檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展，在很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)和免疫學(xué)檢測(cè)等方法對(duì)于呼吸道病原體檢測(cè)的缺陷，使呼吸道病原體的檢測(cè)速度更快，靈敏度和特異性也得到了很大的提高。尤其是多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）病原體檢測(cè)方法的建立及其在臨床上的應(yīng)用，使同時(shí)檢測(cè)多種不同的病原體成為可能。多重PCR檢測(cè)具有比較高的靈敏度和特異性，但受限于每個(gè)反應(yīng)中熒光類型的數(shù)量，一般1個(gè)反應(yīng)孔只能檢測(cè)3～4種病原體，如果需要檢測(cè)更多的病原體，則需要更多的反應(yīng)孔，從而使檢測(cè)的便利性和檢測(cè)通量大大降低。基于液相芯片技術(shù)的NxTAG Respiratory Viral Panel可以同時(shí)檢測(cè)20種病原體，包括18種病毒及其亞型、肺炎支原體和肺炎衣原體，但該試劑盒成本較高，并未廣泛應(yīng)用于臨床。

核酸質(zhì)譜檢測(cè)整合了PCR技術(shù)的高靈敏度和質(zhì)譜技術(shù)的高通量，1個(gè)反應(yīng)體系最高可實(shí)現(xiàn)40重基因擴(kuò)增，可應(yīng)用于基因的單核苷酸多態(tài)性分析、基因突變檢測(cè)、DNA甲基化分析和基因拷貝數(shù)鑒定等研究[2]。目前，在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用主要有耳聾基因檢測(cè)、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變檢測(cè)、液體活檢和高血壓易感基因檢測(cè)等。本研究擬應(yīng)用核酸質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)檢測(cè)導(dǎo)致呼吸道感染的27種常見病原體，探討該方法在呼吸道感染病原體診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2019年9月—2020年3月杭州市第一人民醫(yī)院疑似呼吸道感染患者鼻咽拭子樣本207份。患者中男112例、女95例，年齡1～76歲。

1.2 儀器與試劑

2720 PCR儀（美國ABI公司），LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（瑞士羅氏公司），MassARRAY分析系統(tǒng)、Iplex Pro樣本鑒定試劑盒、Spectro Chip（美國Agena公司），PrimeScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶、TaKaRa Taq Hot Start Version（日本Takara公司），DNA/RNA抽提試劑盒（杭州倍沃醫(yī)療科技有限公司），呼吸道病原體檢測(cè)試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）。

1.3 DNA和RNA的提取

采用DNA/RNA核酸提取試劑盒提取樣本DNA和RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。

1.4 擴(kuò)增引物和延伸引物設(shè)計(jì)

選取病原體基因保守區(qū)域，通過MassARRAY Design軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和延伸引物，引物序列見表1。引物由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。

表1 27種病原體對(duì)應(yīng)引物序列

1.5 呼吸道病原體質(zhì)粒的構(gòu)建

選取病原體保守區(qū)域基因片段（100～300 bp），連接到pUC57質(zhì)粒載體上，病原體質(zhì)粒由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）及MassARRAY核酸質(zhì)譜檢測(cè)

1.6.1 RT-PCR PCR反應(yīng)體系為40 μL，反應(yīng)條件：50 ℃ 25 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃3 min；4 ℃永久保溫。

1.6.2 去磷酸化反應(yīng) 取5 μL RT-PCR產(chǎn)物，加入蝦堿性磷酸酶反應(yīng)液2 μL，45 ℃ 25 min，80 ℃2 min，以去除反應(yīng)體系中的脫氧核糖核苷三磷酸。

1.6.3 單堿基延伸反應(yīng) 加2 μL單堿基延伸反應(yīng)液于去磷酸化反應(yīng)產(chǎn)物中，然后進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃5 s、80 ℃ 5 s（5個(gè)循環(huán)），30個(gè)循環(huán)；72 ℃3 min。單堿基延伸反應(yīng)液中以雙脫氧核糖核苷酸代替脫氧核糖核苷三磷酸，僅在特異性延伸引物后面延伸1個(gè)堿基即終止反應(yīng)。

1.6.4 前處理 在9 μL單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物中加入16 μL去離子水和6 mg樹脂，進(jìn)行脫鹽和檢測(cè)前處理。

1.6.5 核酸質(zhì)譜點(diǎn)芯片和質(zhì)譜檢測(cè) 基于各病原體延伸產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量的差異判讀質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，在病原體特定產(chǎn)物分子質(zhì)量位置出現(xiàn)檢測(cè)峰，則判斷為該病原體陽性。

1.7 RT-PCR MassARRAY法呼吸道病原體檢測(cè)性能評(píng)估

利用27種病原體的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對(duì)反應(yīng)體系的靈敏度進(jìn)行分析。將質(zhì)粒稀釋成1×104、1×103、1×102、1×101拷貝/μL 4個(gè)梯度，然后再進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果通過儀器進(jìn)行自動(dòng)判讀。陽性結(jié)果為延伸引物峰降低或消耗干凈。并在相應(yīng)位置出現(xiàn)擴(kuò)增1個(gè)堿基的延伸產(chǎn)物峰，各病原體延伸引物峰序列和相對(duì)分子質(zhì)量以及延伸產(chǎn)物序列和相對(duì)分子質(zhì)量見表2。對(duì)每個(gè)質(zhì)粒梯度均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果均為陽性的最低稀釋濃度即為最低檢出限。將1×104拷貝/μL濃度的各病原體標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別進(jìn)行多重RT-PCR檢測(cè)，評(píng)估該檢測(cè)體系的特異性。若各病原體延伸產(chǎn)物峰出現(xiàn)在特定位置，且產(chǎn)物峰之間不交叉重疊，則認(rèn)為檢測(cè)體系特異性良好。

表2 延伸引物、延伸產(chǎn)物序列和相對(duì)分子質(zhì)量

續(xù)表2

1.8 RT-PCR MassARRAY法檢測(cè)呼吸道病原體的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

提取207份鼻咽拭子樣本核酸，然后分別進(jìn)行RT-PCR MassARRAY檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)、熒光定量檢測(cè)試劑主要為上海之江生物科技有限公司產(chǎn)品和本實(shí)驗(yàn)室自行合成的檢測(cè)試劑，腸道病毒、博卡病毒、冠狀病毒、卡他莫拉菌、人鼻病毒、流感嗜血桿菌、H3N2季節(jié)性流感病毒檢測(cè)引物和探針由本實(shí)驗(yàn)室委托上海百力格生物技術(shù)有限公司合成，引物和探針序列見表3。比較2種方法的陽性檢出情況和一致性。

表3 7種病原體引物及探針序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示。對(duì)2種檢測(cè)方法進(jìn)行一致性分析，以kappa>0.8為結(jié)果高度一致。

2 結(jié)果

2.1 呼吸道病原體檢測(cè)靈敏度和特異性

陰性對(duì)照和低于檢出限的病原體質(zhì)粒僅有延伸引物峰，無延伸產(chǎn)物峰；而濃度高于檢出限的質(zhì)粒延伸引物峰被消耗，可以看到特定的延伸產(chǎn)物峰。27種病原體質(zhì)粒檢出峰分析結(jié)果顯示，每種病原體僅出現(xiàn)單一的延伸產(chǎn)物峰，特異性良好?？ㄋ?、人鼻病毒、肺炎支原體、冠狀病毒、甲型流感病毒、人偏肺病毒、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、A群鏈球菌、肺炎鏈球菌、H1N1型甲型流感、副流感病毒3型、副流感病毒2型、腺病毒、H-3型甲型流感病毒、嗜肺軍團(tuán)菌、H3N2季節(jié)性流感病毒的檢出限為1×102拷貝/μL，乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的檢出限為1×103拷貝/μL，肺炎衣原體、H-5型甲型流感病毒、副流感病毒4型、B群鏈球菌、副流感病毒1型、腸道病毒、H-7型甲型流感病毒、博卡病毒的檢出限為1×101拷貝/μL。以肺炎支原體為例，檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 肺炎支原體靈敏度檢測(cè)質(zhì)譜圖

2.2 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

用建立的反應(yīng)體系對(duì)207份鼻咽拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢出陽性57份，陽性檢出率為27.54%。其中感染1種病原體的樣本33份，感染2種病原體的樣本19份，有5份樣本感染3～4種病原體。在所有病原體中，肺炎鏈球菌檢出率最高（9.66%），其次為卡他莫拉菌（5.80%），肺炎支原體和流感嗜血桿菌檢出率均為5.31%。有21份樣本病毒檢測(cè)陽性，2份樣本存在3種病毒混合感染。病毒檢出率居前3位的分別為副流感病毒（1～4型）（10份，4.83%）、人偏肺病毒（7份，3.38%）、甲型流感病毒（6份，2.90%）。雙重及多重感染中，與肺炎鏈球菌合并感染所占比例較高，其中肺炎鏈球菌合并卡他莫拉菌感染5例、肺炎鏈球菌合并流感嗜血桿菌感染4例。其他病原體檢出情況見表4。

表4 各病原體檢出情況 例（%）

續(xù)表4

2.3 RT-PCR MassARRAY法與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較

僅有2份樣本2種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果不符，均為RT-PCR MassaARRAY法檢測(cè)陽性，而RTPCR檢測(cè)陰性，見表5。2種方法陽性符合率為100%，陰性符合率為98.68%，總符合率為99.03%。2種方法檢測(cè)結(jié)果具有高度的一致性（kappa=0.98）。

表5 RT-PCR MassARRAY法與RT-PCR檢出結(jié)果比較

3 討論

近年來，呼吸道感染在全球呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢(shì)，是威脅人類健康的重大的感染性疾病，對(duì)體弱多病的老年人和免疫力低下的兒童危害尤為突出。有研究發(fā)現(xiàn)，某院12歲以下死亡病例中，有36.7%死于呼吸道感染引起的肺炎[9]。呼吸道感染病原體種類繁多，臨床癥狀相似，給臨床診斷和治療帶來了極大的困難。分離培養(yǎng)是病原體診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，陽性檢出率偏低；有些微生物（如支原體、衣原體和病毒）體外培養(yǎng)成功率偏低。血清免疫學(xué)檢查存在相應(yīng)的窗口期，受機(jī)體抗體產(chǎn)生能力的影響，對(duì)病原體早期診斷意義不大。多重PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速，且靈敏度高，在臨床中逐漸被應(yīng)用于呼吸道病原體檢測(cè)。受熒光通道限制，多重實(shí)時(shí)熒光PCR單孔只能檢測(cè)3～4種病原體，如果病原體種類偏多，勢(shì)必需要多孔檢測(cè)，使操作更加復(fù)雜，對(duì)核酸樣本的需求也相應(yīng)增加，同時(shí)也使單次檢測(cè)的通量大大降低。多重PCR技術(shù)與質(zhì)譜相結(jié)合的MassARRAY技術(shù)可實(shí)現(xiàn)單管最高40重的基因檢測(cè)，同時(shí)借助其芯片技術(shù)，單次可進(jìn)行96/384個(gè)樣本的檢測(cè)，檢測(cè)通量極高。

本研究同時(shí)對(duì)27種病原體進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為1×101～1×103拷貝/μL，其中僅有2種病原體（乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒）檢測(cè)靈敏度為1×103拷貝/μL，對(duì)其他病原菌的檢測(cè)靈敏度≤1×102拷貝/μL。由此可見，本研究建立的RT-PCR MassARRAY方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，207例鼻咽拭子樣本的陽性檢出率為27.54%。肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體和卡他莫拉菌是社區(qū)獲得性肺炎和急性細(xì)菌感染的主要病原體。本研究中，這4種病原體的檢出率高于百日咳桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌等其他細(xì)菌。本研究還發(fā)現(xiàn)，在20例肺炎鏈球菌感染病例中，單重感染只有9例，僅占肺炎鏈球菌陽性病例的45%；在11例雙重和多重感染病例中，與卡他莫拉菌合并感染的有5例，和流感嗜血桿菌合并感染的有4例，從另一方面證明細(xì)菌之間的合并感染是比較常見的，且這3種細(xì)菌的耐藥情況也不一樣[10]。全面、詳盡的病原體診斷對(duì)指導(dǎo)抗菌藥物的合理使用意義重大。本研究207份樣本中有21份病毒檢測(cè)呈陽性（有2份存在3種病毒合并感染），病毒陽性檢出率為10.14%；副流感病毒（10份）、人偏肺病毒（7份）、甲型流感病毒（6份）是檢出率居前3位的病原體。有研究發(fā)現(xiàn)，我國病毒感染高發(fā)于秋冬季，春夏季病毒感染率相對(duì)較低[11]。本研究采集的樣本來自于4～7月的患者，這可能是導(dǎo)致病毒陽性率不高的原因之一。本研究中，有10份樣本檢出副流感病毒，1型、2型、3型、4型分別為2、3、2、3份，各亞型檢出數(shù)并無差異，與王春等[12]報(bào)道的上海地區(qū)副流感病毒1型、2型、3型、4型陽性檢出率分別為2.74%、0.62%、8.59%和3.40%有所不同，可能與王春等[12]的研究人群主要以兒童為主，而副流感病毒3型是導(dǎo)致嬰幼兒以及免疫功能低下人群下呼吸道感染的主要病因之一[13]有關(guān)。本研究中，人偏肺病毒陽性檢出率為3.38%，與鐘家禹等[14]2018年廣州地區(qū)人偏肺病毒陽性檢出率為3.53%的研究結(jié)果較為接近。本研究中，甲型流感病毒陽性檢出率為2.90%，且全部為H1N1型，另外還檢出呼吸道合胞病毒（2份）、腺病毒和冠狀病毒（各1份）。受限于樣本數(shù)量及樣本類型不夠豐富，博卡病毒、腸道病毒、乙型流感病毒、甲型流感病毒的一些亞型（H3、H3N2季節(jié)性、H5型和H7型）在本研究中并未檢出。

本研究建立的RT-PCR MassARRAY法可以對(duì)27種呼吸道病原體同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度和特異性與熒光實(shí)時(shí)RT-PCR相仿，但相較于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在核酸質(zhì)譜擴(kuò)增的重?cái)?shù)更高，本研究采用的是1個(gè)23重和1個(gè)4重2孔擴(kuò)增的模式，4重的擴(kuò)增孔可以隨著新病原體的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行相應(yīng)擴(kuò)增。MassARRAY采用的是96/384芯片，單次通量最多可進(jìn)行384個(gè)樣本的檢測(cè)，通量較高。基于這個(gè)特點(diǎn)，RT-PCR MassARRAY法非常適合臨床病原體早期篩查和地區(qū)性呼吸道病原體流行病學(xué)調(diào)查。