胡 濤， 盧仁泉， 郭 林

（復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新發(fā)原發(fā)性肝癌約90萬例，居所有腫瘤發(fā)病率的第6位，約有83萬患者死于肝癌，占腫瘤總體死亡例數(shù)的8.3%，居腫瘤死亡率的第4位；其中，東亞地區(qū)的肝癌發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他地區(qū)，平均每10萬人中約有36人被新確診為肝癌[1]。肝癌中最常見的病理類型是肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular cancer，HCC），約占原發(fā)性肝癌的80%[1]。目前，HCC常用的腫瘤標(biāo)志物是甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）[2]，但部分良性疾病，如急性和慢性肝炎會(huì)因壞死性炎癥而出現(xiàn)AFP升高[3]，因此血清AFP診斷HCC的特異性和敏感性略顯不足。在臨床找到敏感性和特異性更佳的新型HCC標(biāo)志物前，可以通過現(xiàn)有標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的辦法來提高HCC的診斷效率。胸腺嘧啶核苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物，與細(xì)胞分裂周期中的S期相關(guān)，通常用于淋巴瘤和白血病的治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后分析和生存評(píng)估[4]。有研究結(jié)果顯示，一些實(shí)體腫瘤，如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、腎癌患者的腫瘤細(xì)胞、組織及血清TK1水平明顯升高[4-5]，具有潛在的疾病診斷及預(yù)后評(píng)估價(jià)值。在健康人群中，血清TK1≥2.0 pmol/L者患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)是TK1正常者的3～5倍[6]，因此TK1或可成為腫瘤早期篩查及隨訪的潛在的生物標(biāo)志物。目前，關(guān)于TK1在HCC中的應(yīng)用尚未見相關(guān)報(bào)道，本研究擬探討血清TK1在HCC中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年1月—2020年1月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診為HCC的患者123例（HCC組），其中男94例、女29例，年齡18～83歲。所有患者均經(jīng)病理檢查確診，根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]分為Ⅰ期33例、Ⅱ期35例、Ⅲ期36例、Ⅳ期19例。所有患者均未進(jìn)行化療、放療及手術(shù)治療、介入治療。另選取同期復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院未進(jìn)行過治療的其他肝臟疾病患者83例（疾病對(duì)照組），其中男53例、女30例，年齡22～88歲，包括肝硬化20例、乙型肝炎42例、肝血管瘤10例、脂肪肝11例。以同期復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院體檢中心健康體檢者97名為正常對(duì)照組，其中男77名、女20名，年齡24～64歲，均無心血管疾病、消化代謝類疾病、基礎(chǔ)免疫系統(tǒng)類疾病，肝功能均正常。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批文號(hào)：050432-4-1212B），所有對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 收集HCC患者的一般資料，包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、飲酒史、病理TNM分期、腫瘤細(xì)胞分化程度、乙型肝炎病毒感染情況、肝壞死情況、血紅蛋白水平、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）水平和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.2.2 樣本采集及檢測(cè) 采集所有患者治療前、正常對(duì)照者體檢時(shí)的靜脈血3～4 mL，1 200×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存待測(cè)。采用NRM411全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光定量分析儀（南京諾爾曼公司）及配套試劑檢測(cè)血清TK1水平。根據(jù)試劑盒說明書，以TK1≥2.00 pmol/L為陽(yáng)性。采用cobas e801全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測(cè)血清AFP、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）水平。根據(jù)試劑盒說明書，以AFP≥10 ng/mL為陽(yáng)性，以CA19-9≥37 ng/mL為陽(yáng)性。

1.2.3 隨訪 對(duì)123例HCC患者中的114例進(jìn)行介入治療或手術(shù)切除治療后12個(gè)月的隨訪，根據(jù)隨訪結(jié)果分為復(fù)發(fā)組和無進(jìn)展組。對(duì)123例HCC患者中的33例進(jìn)行術(shù)后TK1動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，分別于術(shù)后1周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月檢測(cè)血清TK1水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)診斷HCC的價(jià)值。采用Kaplan-Meier生存曲線和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)評(píng)估HCC患者的預(yù)后，采用多因素Cox比例回歸分析評(píng)估HCC復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組、疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組血清TK1水平的比較

HCC組、疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組血清TK1水平依次降低，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表1。

表1 3組血清TK1水平比較 pmol/L，M（P25～P75）

2.2 不同臨床病理特征HCC患者之間血清TK1水平比較

123例HCC患者中，血清TK1陽(yáng)性68例，陽(yáng)性率為55.3%。在不同臨床病理特征的HCC患者中，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者血清TK1水平高于Ⅰ～Ⅱ期者（P<0.05）：其他不同臨床病理特征的HCC患者之間血清TK1水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征HCC患者血清TK1水平及陽(yáng)性率比較

2.3 各項(xiàng)指標(biāo)輔助診斷HCC的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清TK1、AFP、CA19-9輔助診斷HCC的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.798、0.903、0.683。采用Logistic回歸模型分析3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的不同組合，得出最優(yōu)聯(lián)合檢測(cè)組合為TK1+AFP，聯(lián)合檢測(cè)模型為L(zhǎng)ogit（P）=1.679×TK1+0.170×AFP-4.195，輔助診斷HCC的AUC為0.922。見表2、圖1。

圖1 TK1、CA19-9、AFP單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的ROC曲線

表3 各項(xiàng)指標(biāo)輔助診斷HCC的ROC曲線參數(shù)

2.4 HCC患者的Kaplan-Meier生存曲線分析

根據(jù)ROC曲線分析得出的TK1的最佳臨界值，并結(jié)合文獻(xiàn)[8]的研究結(jié)果，將術(shù)前TK1≥2.00 mol/L作為高TK1水平，TK1<2.00 pmol/L作為低TK1水平。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，術(shù)前高TK1水平者無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）短于低TK1水平者（P<0.001）。見圖2。

圖2 HCC患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.5 HCC復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)因素分析

多因素Cox比例回歸分析結(jié)果顯示，AFP和TK1是預(yù)測(cè)HCC復(fù)發(fā)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）分別為1.000、1.016，95%CI分別為1.000～1.001、1.010～1.023]，不受年齡、體質(zhì)量指數(shù)、TNM分期、血紅蛋白、AST、ALT、合并肝壞死、飲酒和HBsAg陽(yáng)性的影響。見表3。

表4 單因素和多因素Cox比例回歸分析

2.6 HCC患者術(shù)前、術(shù)后血清TK1水平動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果

根據(jù)有無復(fù)發(fā)將33例進(jìn)行血清TK1動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的HCC患者分為復(fù)發(fā)組（12例）和無進(jìn)展組（21例）。復(fù)發(fā)組和無進(jìn)展組術(shù)后1周血清TK1水平均低于術(shù)前（P<0.05、P<0.01）。復(fù)發(fā)組術(shù)后1個(gè)月血清TK1水平開始逐漸升高，術(shù)后6個(gè)月時(shí)的血清TK1水平顯著高于術(shù)前（P<0.05）；無進(jìn)展組術(shù)后1個(gè)月、術(shù)后3個(gè)月、術(shù)后6個(gè)月血清TK1水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。復(fù)發(fā)組術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后1個(gè)月、術(shù)后3個(gè)月、術(shù)后6個(gè)月血清TK-1水平均高于同期無進(jìn)展組（P<0.001）。HCC復(fù)發(fā)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清AFP水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），無進(jìn)展組術(shù)前及術(shù)后1周、術(shù)后1個(gè)月、術(shù)后3個(gè)月血清AFP水平逐漸下降（P<0.05）；復(fù)發(fā)組各時(shí)間點(diǎn)AFP水平與無進(jìn)展組同時(shí)間點(diǎn)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 HCC患者術(shù)前及術(shù)后6個(gè)月TK1動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果

進(jìn)一步分析12例HCC復(fù)發(fā)患者血清TK1和AFP水平的反彈時(shí)間（血清學(xué)水平降低后首次出現(xiàn)升高，且高于參考區(qū)間上限的時(shí)間），結(jié)果顯示，血清TK1的平均反彈時(shí)間為2.58個(gè)月，早于血清AFP的反彈時(shí)間（4.50個(gè)月）（P<0.05）。見圖4。

圖4 HCC復(fù)發(fā)患者血清AFP和TK1反彈時(shí)間比較

3 討論

TK1在多種腫瘤中具有診斷和預(yù)后評(píng)估價(jià)值[4-5，9]。細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果表明，TK1可能通過E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）通路聯(lián)合乳腺癌1號(hào)基因（breast cancer 1，BRCA1）通路參與HCC的疾病進(jìn)展[10]。但TK1在HCC中的臨床價(jià)值尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，本研究探討了血清TK1在HCC輔助診斷及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，HCC組血清TK1水平顯著高于疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組（P<0.001）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清TK1、AFP、CA19-9輔助診斷HCC的AUC分別為0.798、0.903、0.683；在3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的組合中，TK1與AFP聯(lián)合檢測(cè)輔助診斷HCC的效能最高（AUC為0.922）。雖然TK1的敏感性較低，但特異性較高，AFP與TK1聯(lián)合檢測(cè)可進(jìn)一步提高診斷HCC的特異性和敏感性，且診斷效能優(yōu)于各項(xiàng)指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)。

細(xì)胞角蛋白19片段、甲胎蛋白異質(zhì)體、異常凝血酶原等標(biāo)志物也可用于HCC的預(yù)后分析[11-12]，但目前臨床最常用的指標(biāo)還是AFP[12]。有研究結(jié)果顯示，AFP為20～400 ng/mL的腫瘤患者1、3、5年無瘤生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）[13]。因此，AFP在相關(guān)腫瘤預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值略顯不足。本研究Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，術(shù)前高TK1水平者PFS短于低TK1水平者（P<0.001）。多因素Cox比例回歸分析結(jié)果顯示，TK1是預(yù)測(cè)HCC復(fù)發(fā)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（HR=1.016，95%CI為1.010～1.023），不受年齡、體質(zhì)量指數(shù)、TNM分期、血紅蛋白、AST、ALT、合并肝壞死、飲酒和HBsAg陽(yáng)性的影響。本研究術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組術(shù)后6個(gè)月血清TK1水平顯著升高，血清TK1的平均反彈時(shí)間早于AFP（P<0.05）。相對(duì)于AFP，TK1可以覆蓋所有HCC患者，而且不受其他影響因素干擾，是更為優(yōu)異的HCC預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。本研究結(jié)果可以與LIU等[10]在細(xì)胞層面的研究結(jié)果相互印證。

本研究中有5例HCC復(fù)發(fā)患者術(shù)前TK1<2 pmol/L（陰性），在復(fù)發(fā)時(shí)TK1轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。原因可能是HCC復(fù)發(fā)時(shí)腫瘤細(xì)胞釋放TK1進(jìn)入細(xì)胞外液[14]，形成具有不同相對(duì)分子質(zhì)量和酶活性的復(fù)合物[15]，導(dǎo)致血清TK1由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。

綜上所述，血清TK1在HCC的輔助診斷和療效評(píng)估方面均有一定的價(jià)值。術(shù)前血清TK1是預(yù)測(cè)HCC復(fù)發(fā)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。術(shù)后血清TK1水平的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有助于HCC患者的療效評(píng)價(jià)及預(yù)后分層。