徐冰冰，張九凱，趙貴明，韓建勛，胡 靜，邢冉冉，王 瑋，陳 穎,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.石家莊工商職業(yè)學院，河北 石家莊 050091）

沙棘又稱為醋柳果、醋刺果或黑刺果，為胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬落葉灌木或小喬木植物[1]。沙棘油是采用精選的優(yōu)質(zhì)沙棘果實或種子為原料，經(jīng)過壓榨分離、壓濾或采用全精煉、超臨界CO2萃取等系列工藝加工而成的棕紅色清澈透明植物油，具有沙棘特有的芳香氣味[2]。沙棘油含有多種不飽和脂肪酸（且不飽和脂肪酸的含量較橄欖油更高、種類更豐富）[3]、類胡蘿卜素、生育酚、植物甾醇、游離氨基酸及黃酮類等大量生物活性物質(zhì)[4-5]，具有醒脾健胃、抗炎生肌、促進潰瘍愈合、緩解干眼癥、保護心血管等功效[6-8]。國內(nèi)現(xiàn)行沙棘油的相關(guān)標準僅1 項即SL 493—2010《沙棘籽油》，該標準主要規(guī)定了合格沙棘籽油的相關(guān)準則。部分不法商販為牟取暴利，將低價植物油如葵花籽油[9]、大豆油[10]等摻入沙棘油中，從而導致沙棘油產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，而有效的真?zhèn)舞b別方法是保障消費者利益，維護市場經(jīng)濟秩序的重要手段之一。

目前國內(nèi)外學者針對食用油類的鑒別方法主要有聚合酶鏈式反應法[11]、聚合酶鏈式毛細管電泳法[12]、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法[13]、紫外-可見分光光譜法[14]、熒光光譜法、近紅外光譜法[15-16]、傅里葉紅外光譜法[17]、拉曼技術(shù)[18-19]、核磁共振法[20]、氣相色譜法和高效液相色譜法等，但已報道的關(guān)于沙棘油鑒別的研究相對較少，李宗朋等[10]通過應用近紅外光譜技術(shù)將沙棘籽油與10 種常見摻假油進行鑒別，發(fā)現(xiàn)近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學計量學分析具有較高識別正確率，表明此方法不但可以鑒別純正的沙棘籽油，還可識別沙棘籽油摻假類型。但該方法未對沙棘油及其摻假油組分進行詳細表征；Hurkova等[9]應用高效液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測器，根據(jù)類胡蘿卜素含量差異對沙棘油補充劑進行檢測，發(fā)現(xiàn)該補充劑并不含沙棘油，而是葵花籽油添加β-胡蘿卜素替換所得，但同樣未有詳細的組分表征。

代謝組學是指對生物體內(nèi)所有小分子代謝物（一般指小于1 000 Da的內(nèi)源小分子）進行定性定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對關(guān)系的研究方法，是新興“組學”之一[21]。其中高效液相色譜法是代謝組學研究的主要技術(shù)之一，較氣相色譜法分析速率、靈敏度及分離度都有很大提升[22]，基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOFMS）的非靶標代謝組學方法，具有更高的分辨率和高通量，能夠?qū)τ蜆又行》肿犹卣骰衔镞M行精確定性定量。本實驗采用UPLC-QTOF-MS結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）等化學計量學方法，通過構(gòu)建沙棘油指紋圖譜，對沙棘油及其對照油的非揮發(fā)性特征化合物進行推測，以期為沙棘油產(chǎn)品質(zhì)量控制和真實性鑒別提供支持及經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品主要包括20 種沙棘油、16 種葵花籽油、16 種菜籽油和16 種大豆油，均收集于進口及國內(nèi)各食用油企業(yè)，經(jīng)相關(guān)機構(gòu)認定及實驗證明其真實屬性。樣品涵蓋不同等級的壓榨、浸出、超臨界CO2萃取、離心分離等加工方式。沙棘油、葵花籽油、菜籽油、大豆油樣品命名為SJY、KHZY、CZY、DDY，樣品信息見表1。

表1 沙棘油、葵花籽油、菜籽油和大豆油樣品信息Table 1 Information about samples of sea buckthorn oil, sunflower seed oil, rapeseed oil and soybean oil tested in this study

甲醇（色譜級） 美國Honeywell公司；水、甲酸（均為色譜級） 美國Fisher公司；乙酸銨（色譜級）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

不同規(guī)格移液器、Centrifuge 5418R型離心機德國Eppendorf公司；SA 300振蕩器 北京華威中儀科技有限公司；ME403E分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；KQ-205B超聲波清洗儀 江蘇超聲儀器有限公司；渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；TripleTOF 6600型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀美國AB SCIEX公司；Kinetex C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，100 ?） 美國Phenomenex公司；Millex-GP 0.22 μm聚四氯乙烯膜過濾器北京博爾金科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

實驗過程共進行3 次技術(shù)重復，分別稱取0.1 g純沙棘油（n=20）、葵花籽油（n=16）、菜籽油（n=16）、大豆油（n=16）于1.5 mL的小離心管中，加入0.3 mL體積分數(shù)80%的甲醇溶液，設置振蕩器速率為最大，振蕩5 min混合均勻，放于離心機中，以6 000 r/min離心10 min，取上清液于新離心管中，向原離心管中加入0.3 mL 80%的甲醇溶液，重復上述提取步驟3 次，經(jīng)0.22 μm聚四氯乙烯膜過濾器過濾至1.5 mL質(zhì)譜進樣小瓶中，并進行標記。

吸取同等質(zhì)量純油樣品均勻混合，記為質(zhì)控樣品（QC），樣品處理方式同上，設置空白為80%的甲醇溶液；同時隨機選取葵花籽油（n=2，KHZY6、KHZY14）、菜籽油（n=2，CZY3、CZY8）和大豆油（n=2，DDY2、DDY8），以0%、1%、5%、10%、20%、40%、80%、100%的質(zhì)量比摻入到沙棘油（n=2，SJY11、SJY19）中，模擬摻假樣品。

1.3.2 UPLC-QTOF-MS分析條件

色譜條件：Kinetex C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，100 ?），配制流動相A為水溶液（0.025%甲酸，5 mmol/L乙酸銨），流動相B為甲醇-乙酸銨溶液（0.025%甲酸，5 mmol/L乙酸銨）進行二元梯度洗脫，梯度洗脫比例：0～1 min，60% A、40% B；1～9 min，60%～5% A、40%～95% B；9～13 min，5% A、95% B；13～15 min，5%～60% A、95%～40% B；柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量3 μL。

質(zhì)譜條件：四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜進行非靶標代謝組學檢測，應用大氣壓化學電離，配備DuoSpray離子源，使用Analyst TF 1.7.1軟件在正、負離子模式下對數(shù)據(jù)進行采集，采集模式設置full-scan TOF MS及MS/MS；單針注射時建立動態(tài)背景扣除、信息依賴采集及實時多重質(zhì)量虧損。

質(zhì)譜離子源參數(shù)：氮氣為工作氣，霧化氣、輔助加熱氣和氣簾氣壓力分別為50、55、30 psi，離子源溫度550 ℃，一級MS條件，正、負離子模式噴霧電壓和去簇電壓分別為5 500、-4 500 V，80、-80 V，滯留時間200 ms，質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 000；二級質(zhì)譜MS/MS正、負離子模式碰撞能量分別為35、-35 eV，擴展碰撞能量15 eV，滯留時間50 ms，質(zhì)量掃描范圍為m/z50～1 000，自動校準裝置系統(tǒng)每5 個樣品校正一次。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與化學計量學分析

應用MarkerView（Ver1.3.1 AB SCIEX公司）軟件對質(zhì)譜所得數(shù)據(jù)進行預處理，設置MarkerView算法條件，對m/z100～1 000、保留時間0.5～18 min的離子進行初步篩選，將經(jīng)數(shù)據(jù)分組后所得出峰表導入SIMCA（Ver15 MKS Data Analytics Solutions，原Umetrics公司）軟件中，進行置換檢驗、PCA和OPLS-DA。

1.3.4 特征化合物的篩選與鑒定

根據(jù)MarkerView結(jié)合SIMCA軟件OPLS-DA模型計算的變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）對樣品潛在的特征化合物進行篩選，記錄離子精確質(zhì)荷比及保留時間；采用PeakView（Ver2.2 AB SCIEX公司）提取相對應的離子峰，設置Formula Finder條件為C（n≤80）、H（n≤200）、O（n≤40）、N（n≤40）、P（n≤10）、Cl（n≤10）和S（n≤10），篩選質(zhì)量誤差小于百萬分之一的特征化合物化學式；將實驗圖譜、化學式與MSFINDER（Ver3.24）軟件及HMDB（http://www.hmdb.ca）、ChemSpider（http://www.chemspider.com）、Massbank（https://massbank.eu/MassBank/）和Metlin（https://metlin.scripps.edu ）等線上數(shù)據(jù)庫進行比對，借助Formula Finder功能及MSFINDER軟件對未知化合物的一級和二級離子碎片信息進行對比，從而推測其可能的分子結(jié)構(gòu)及化學式，并通過下載文獻對推測結(jié)果進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘油及其對照油化學計量學分析

采用高通量、高靈敏度的UPLC-QTOF-MS技術(shù)分別對正離子及負離子模式下的沙棘油、葵花籽油、菜籽油、大豆油4 種食用油樣品進行信息采集，生成基峰色譜圖。由于正離子模式下離子的響應明顯優(yōu)于負離子，且正離子模式下提取離子峰為8 000 個，明顯高于負離子峰（3 331 個），因此后續(xù)實驗將主要采用正離子采集模式對數(shù)據(jù)處理過程進行分析。根據(jù)所得每個時間點質(zhì)譜圖中最強的離子強度，發(fā)現(xiàn)正離子模式下沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油之間峰形相差較大（圖1）。每種食用油間峰的強度、數(shù)量及時間均有明顯差異，表明依據(jù)化學計量學對樣品特征離子進行分析、篩選可行。

圖1 沙棘油（A）、葵花籽油（B）、菜籽油（C）及大豆油（D）正離子模式基峰圖Fig.1 Base peak chromatograms of sea buckthorn oil (A),sunflower seed oil (B), rapeseed oil (C) and soybean oil (D) identified in positive ion mode

將UPLC-QTOF-MS在正離子模式下采集的原始數(shù)據(jù)導入MarkerView軟件，對所得離子峰進行識別，將數(shù)據(jù)存為表格模式后，再次導入SIMCA軟件進行PCA、OPLS-DA及置換檢驗，并利用SIMCA軟件中VIP（以VIP＞1作為篩選標準）功能與MarkerView軟件中的二級圖譜相結(jié)合，衡量各代謝物表達模式對各組樣品分類判別的影響強度和解釋能力，從而對樣品中可能存在的特征離子峰進行篩選，記錄其精確離子質(zhì)荷比及保留時間。

PCA是一種通過減少數(shù)據(jù)維度，使數(shù)據(jù)盡可能可視化的保留原始數(shù)據(jù)中的信息的技術(shù)[23]，可用于對樣品的初步分析。數(shù)據(jù)分析表明，PCA所得圖譜可表明不同食用油各組分之間存在一定差異，但難以明顯區(qū)分（圖2A、B），推測可能是同一種食用油受產(chǎn)地、生產(chǎn)工藝、等級等因素的影響，會產(chǎn)生較大的組內(nèi)差異。OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，其運用PLS-DA建立代謝物表達量與樣品之間的關(guān)系模型，可降低樣品組內(nèi)差異、放大組間差異，排除無關(guān)因素對實驗數(shù)據(jù)造成的影響，從而實現(xiàn)對不同樣品的有效預測，因此本實驗又采用了OPLS-DA模型對樣品進行分析。OPLS-DA模型中，RX2、RY2分別表示模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示所建模型的預測能力，RX2、RY2統(tǒng)稱為R2。理論上，R2、Q2數(shù)值越接近于1說明模型的預測能力及擬合準確性越高，通常情況下，R2、Q2高于0.5較好。分析結(jié)果表明：正離子模式下OPLS-DA模型數(shù)值為=0.595，=0.964，Q2=0.954，表明模型的解釋及預測能力較好，樣品聚類分離效果明顯，沙棘油可同葵花籽油、菜籽油及大豆油進行明顯區(qū)分（圖2C、D）。

圖2 沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油正離子模式下PCA（A、B）、OPLS-DA（C、D）得分圖及載荷圖Fig.2 Score plots and loading plots of PCA (A, B) and OPLS-DA (C, D)for sea buckthorn oil, sunflower seed oil, rapeseed oil and soybean oil identified in positive ion mode

對OPLS-DA模型進行置換檢驗，判別其是否發(fā)生過度擬合。置換檢驗中，若模型右側(cè)Q2值大于左側(cè)任意一個Y變量隨機排列模型Q2值，且位于y軸上的截距小于0，則認為OPLS-DA模型較好，無過度擬合現(xiàn)象。正離子模式下200 次循環(huán)迭代后的置換檢驗圖譜如圖3所示，Q2交與y軸負半軸，RY2（0.0，0.513）、Q2（0.0，-0.371），表明模型可用于沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油的組間對比區(qū)分，且模型可靠。

圖3 正離子模式下200 次循環(huán)迭代OPLS-DA置換檢驗圖Fig.3 Permutation test of OPLS-DA model with 200 cycles in positive ion mode

為驗證不同比例對照油的區(qū)分效果，本實驗將不同比例的對照油（0%、1%、5%、10%、20%、40%、80%、100%）分別摻入到沙棘油中進行模型驗證（標識如下：沙棘油質(zhì)量分數(shù)1%，菜籽油質(zhì)量分數(shù)99%，則記為SJY-CZY-1），用以表征各個梯度對照樣品的可檢測性及良好的預測能力。圖4分別為沙棘油與葵花籽油、菜籽油、大豆油及其不同比例摻假油OPLS-DA模型圖（R2和Q2均大于0.95）。純沙棘油及對照油聚合區(qū)分度明顯，不同比例摻假油位于沙棘油及對照油之間，摻假比例越大越靠近對照油，反之則越靠近沙棘油，這表明該模型具有良好的區(qū)分辨別能力及預測能力，可以較為準確對沙棘油摻假進行區(qū)分。

圖4 正離子模式下沙棘油及其對照食用油不同比例OPLS-DA驗證圖Fig.4 OPLS-DA verification of pure and adulterated sea buckthorn oil in positive ion mode

2.2 特征離子篩選及鑒定

為篩選得到不同食用油中的特征標識化合物，進一步對模型進行驗證，從而對OPLS-DA載荷圖進行分析。根據(jù)OPLS-DA載荷圖（圖2D）中，距離原點越遠為特征離子可能性越大的規(guī)律，分別由外向原點對離子進行篩選，選擇僅一種食用油中檢測到，而在其他3 種食用油中均檢測不到的物質(zhì)作為特征化合物，對其進行進一步推測鑒定（圖5）。

圖5 正離子模式下4 種油特征離子圖譜Fig.5 Mass spectra showing characteristic ions of sea buckthorn oil, sunflower seed oil, rapeseed oil and soybean oil identified in positive ion mode

根據(jù)MarkerView及SIMCA軟件中的VIP功能對特征化合物進行篩選，將篩選并記錄的差異化合物應用PeakView軟件中的Formula Finder功能，依據(jù)記錄的精確質(zhì)荷比及保留時間結(jié)合二級離子碎片信息，對差異化合物的化學式進行預測，設置元素信息為：C（n≤80）、H（n≤200）、O（n≤40）、N（n≤40）、P（n≤10）、Cl（n≤10）和S（n≤10），質(zhì)量誤差小于百萬分之一。MSFINDER可以從精確質(zhì)量數(shù)、MS/MS圖譜的碎片信息以及氫重排規(guī)則等方面對數(shù)據(jù)信息進行綜合考量、排序，排名前列的未知化合物是該特征化合物的可能性越高[24-25]。為提高結(jié)果的準確性，將所得二級圖譜與線上數(shù)據(jù)庫參考圖譜進行對比，并結(jié)合實驗和相關(guān)文獻進行驗證，最終推測正差異化合物共14 種，其中，沙棘油有6 種，葵花籽油有3 種，菜籽油有4 種，大豆油有1 種（表2）。

沙棘油富含多種營養(yǎng)素，如醇類、酮類、有機酸類、醛類及萜烯類等物質(zhì)，本實驗中沙棘油在正離子模式下推測得特征離子化合物分別為松油醇、黨參炔醇、蓖麻油醇、豯薟精醇、因香酚、環(huán)滿酯。其中，根據(jù)1號特征化合物m/z309.28、保留時間11.069 min，化學式為C20H36O2，二級圖譜中碎片離子豐度高低排列順序為m/z81.069 7＞95.085 2＞109.100 5＞245.226 2，推測其為松油醇，松油醇是沙棘中重要的揮發(fā)性物質(zhì)之一[26]，對沙棘的感官風味具有較大的影響；根據(jù)精確質(zhì)荷比與保留時間（[M+H]+m/z285.28，11.462 min）結(jié)合正離子模式下所測二級圖譜碎片離子信息m/z175.075 1、235.133 3，經(jīng)MarkerView軟件分析，對比MSFINDER及線上數(shù)據(jù)庫，推測2號特征化合物為黨參炔醇，3號特征化合物為蓖麻油醇，4號特征化合物為豯薟精醇，5號特征化合物為因香酚，6號特征化合物為環(huán)滿酯。其中，因香酚作為一種抗氧化活性物質(zhì)，而被檢測出存在于研究價值極高的藥材——紙乳香樹脂中[27]。

葵花籽油正模式下推測得特征化合物包括：咖啡豆醇/丹參酚酮、抗干眼烯和甲潑尼龍。將7號、8號和9號特征化合物二級與HMDB、ChemSpider等數(shù)據(jù)庫進行匹配，發(fā)現(xiàn)其分別可能為咖啡豆醇或丹參酚酮，抗干眼烯和甲潑尼龍。因文獻報道少，具體尚未明確。

菜籽油的特征化合物主要包括度骨化醇、松柏醇、6-O-甲基啤酒甾醇和異色瞞。依據(jù)m/z413.342、保留時間10.846 min，經(jīng)Formula Finder功能認為10號特征化合物分子式為C28H44O2，離子化方式為加H+，將二級碎片離子信息與HMDB及METLIN數(shù)據(jù)庫匹配，最終推測該特征化合物為度骨化醇；根據(jù)特征化合物信息，經(jīng)MSFINDER軟件及HMDB匹配得11號特征化合物為松柏醇、松柏醇存在于多種植物中[28]，但是否存在于菜籽油中還未有報道。

大豆油測得特征化合物m/z255.065 3，保留時間為3.49 min，化學式為C15H10O4，推測其為大豆苷元。王曉波等[29]研究發(fā)現(xiàn)大豆苷元及其苯磺酸酯衍生物能夠抑制肺癌細胞的增殖活性，同時增加肺正常細胞增殖活性，且大豆苷元苯磺酸酯衍生物B能促進肺癌細胞凋亡并抑制肺正常細胞凋亡，益于人體健康。Dou Xinjing等[30]將大豆苷元作為鑒別大豆油摻假山茶油的特征標志物，證明大豆苷元為大豆油的特征化合物。

2.3 自制摻假食用油樣品的驗證

本研究對特征標識化合物在實際樣品中進行驗證，采用的樣品為實驗室自制的摻假食用油（以1%、5%、10%、20%、40%、80%的質(zhì)量比摻入到沙棘油中，樣品信息見1.3.1節(jié)）。通過MarkerView軟件提取摻假油（葵花籽油、菜籽油和大豆油）的特征標記離子，繪制其在不同樣品組中的豐度圖。圖6為通過該軟件提取的3 個鑒定效果最好的摻假油的特征標記物，分別對應表2中的特征標記化合物7、10和14。從圖6可以看出，特征標記物7（m/z315.195 8，保留時間6.258 min）只在葵花籽油、摻入葵花籽油的沙棘油以及質(zhì)控中出現(xiàn)，而在其他樣品中未檢出，因此當沙棘油中摻有葵花籽油時，可以利用特征標記物7鑒別。同理，特征標記物10（m/z413.342，保留時間10.846 min）和14（m/z255.065 3，保留時間3.49 min）可分別用于鑒別沙棘油中是否摻入菜籽油和大豆油。上述驗證結(jié)果表明所篩查得到的特征標識化合物可用于實際樣品的檢測。

圖6 代表性特征標識離子在實際食用油樣品中的豐度圖Fig.6 Relative abundance of representative characteristic maker ions in actual edible oil samples

表2 沙棘油、葵花籽油、菜籽油及大豆油差異標記化合物信息Table 2 Information about differential characteristic marker compounds among sea buckthorn oil, sunflower seed oil, rapeseed oil and soybean oil

本研究同時結(jié)合模型判別和特征標識離子方法建立了沙棘油真實性鑒別技術(shù)。其中，模型判別方法基于不同食用油的全代謝物組分，可從整體上對沙棘油的真實性進行判別；同時，由于不同種類食用油中所含有的特征化合物具有較大差異，通過檢測篩選得到的特征標識化合物即可快速實現(xiàn)沙棘油的真實性判別，并能探求摻假油的種類。兩種方法相互驗證、互為補充，能夠?qū)崿F(xiàn)對未知沙棘油樣品真實性的準確判別。

3 結(jié) 論

本實驗采用基于UPLC-QTOF-MS的非靶標代謝組學方法結(jié)合化學計量學方法成功區(qū)分了沙棘油及其對照食用油（葵花籽油、菜籽油和大豆油）。所建OPLS-DA模型聚類區(qū)分度良好，具有良好的解釋及預測能力，可對沙棘油及其摻假油進行有效區(qū)分。根據(jù)所得OPLS-DA得分圖與載荷圖，結(jié)合PeakView等分析軟件、線上數(shù)據(jù)庫、相關(guān)文獻和實驗驗證進行對比驗證分析，篩查得到不同種類食用油中的14 種特征標識化合物，進一步對區(qū)分結(jié)果進行了驗證。因此基于UPLC-QTOF-MS的非靶標代謝組學技術(shù)可以作為區(qū)分沙棘油及其摻假油的有效手段之一，為沙棘油的真實性鑒別提供了堅實理論和科學依據(jù)。