賈 飛，閆文杰，戴瑞彤，劉 毅，李興民,*

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是革蘭氏陰性菌，屬于假單胞菌屬，具有單級鞭毛[1]。銅綠假單胞菌是條件致病菌，可引起呼吸道以及泌尿系統感染，并且其耐藥力極強，因此該菌引起的感染是最常見的感染之一[2-4]。除了在飲用水中存在之外，銅綠假單胞菌還是肉品和水產品中最常見的腐敗菌，會造成食品的腐敗變質，產生惡臭氣味，同時也給食品安全帶來巨大隱患[5]。我國將銅綠假單胞菌列為致病菌，雖然在普通食品中不要求檢測，但是在飲用天然礦泉水中必須檢測[6]。GB 8538—2016《飲用天然礦泉水檢驗方法》規(guī)定銅綠假單胞菌菌群指標（同一批次產品采樣5 個、微生物指標可接受水平限量值為0且不允許超出此限量值）[7]。美國、歐洲、加拿大和日本等國對飲用水中銅綠假單胞菌的限量標準為大腸菌群最可能數（most probable number，MPN）小于3 MPN/L，或每250 mL不得檢出[8]?？紤]到銅綠假單胞菌對食品安全的巨大威脅，建立快速靈敏可靠的檢測方法勢在必行。

目前，已經有很多研究者開發(fā)銅綠假單胞菌的快速檢測新方法。Lee[9]和Lavenir[10]等分別建立基于實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）定量檢測水和環(huán)境中的銅綠假單胞菌的方法，二者分別以特征基因gyrB和exfX為目標基因，通過設計不同引物實現定量擴增并完成檢測。相比傳統平板計數法，PCR檢測方法極大縮短檢測時間，并且檢測特異性好；Zhang Shuhong等[11]以銅綠假單胞菌的特征基因exfX為目標，采用環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術進行檢測，此方法雖然靈敏度高，但是容易出現假陽性，且操作繁瑣。Das等[12]采用電化學傳感器檢測水中的銅綠假單胞菌，其用適配體作為捕獲探針，通過引入酶促信號放大系統催化底物從而提升檢測靈敏度，在60 min的檢測時間內，對目標菌的檢出限達到60 CFU/mL；Yue Huan等[13]建立無標記的電化學發(fā)光（electrochemiluminescent，ECL）傳感器檢測銅綠假單胞菌的方法，其用噬菌體作為信號識別元件以結合目標菌，用石墨烯修飾電極以提高靈敏度，在優(yōu)化條件中，該ECL傳感器對目標菌的檢測線性范圍為1.4×102～1.4×106CFU/mL，檢出限為56 CFU/mL，此方法方便、快速，但是檢測靈敏度需進一步優(yōu)化。除此之外，Cámara-Martos等[14]也建立近紅外快速檢測食品中銅綠假單胞菌的方法，該方法操作簡便，但是檢測假陽性高，且易受其他微生物的干擾。Yilmaz等[15]研究拉曼技術在銅綠假單胞菌檢測中的應用，該方法靈敏度高，但也存在檢測特異性不足的問題。因此，建立靈單細胞水平、敏度高、特異性好、操作簡單的快速檢測銅綠假單胞方法，具有重要意義。

電化學阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）技術是超靈敏的電化學分析手段，其機理是在電化學系統中，通過對界面施加一個頻率不同的小振幅正弦波進行微干擾，然后測得的交流電勢與電流的比值為阻抗[16]。作為一種“準穩(wěn)態(tài)”方法，EIS研究電極表面的暫時動力學特征，擾動信號不會導致電極表面極化現象，因而此方法對檢測樣品無損。相比于安培型傳感器，EIS的靈敏度更高，檢測穩(wěn)定性也更強[17-18]。因此，基于阻抗滴定的生物傳感器檢測法具有快速、超靈敏、無需引入標記物、不損傷樣品等優(yōu)點，已經用于食品安全快速檢測中[19-21]。

本實驗采用高靈敏度EIS技術結合納米材料優(yōu)異的導電特性設計阻抗型適配體傳感器，并以食品中常見的銅綠假單胞菌為目標展開超靈敏檢測。首先自主合成還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）/碳納米管（carbon nano-tube，CNT）-納米金（gold nanoparticles，AuNPs）復合納米材料并將其固定在電極表面。隨后，通過設計一段能夠特異性結合銅綠假單胞菌的適配體序列，采用金硫鍵將一端巰基化的適配體結合到電極表面，構建能特異性捕獲目標菌的工作電極。當與目標菌孵育之后，細菌被固定在電極表面，導致電流傳輸被抑制，阻值明顯增大，根據電阻變化值以實現對銅綠假單胞菌的定量檢測。由于rGO/CNT-AuNPs復合納米材料優(yōu)異的電子傳輸性能，本實驗的檢測能力明顯優(yōu)于其他快速檢測方法。相比于常見的電化學傳感器，本實驗制備的傳感器無需引入標記物，操作簡便，檢測模式直接，能檢測銅綠假單胞菌，可通過更換適配體的方式快速、靈敏檢測其他食源性致病菌或有毒有害物質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉 市購。

銅綠假單胞菌ATCC 27853、沙門氏菌ATCC 14028、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸桿菌ATCC 25922、副溶血性弧菌ATCC 17802 上海復祥生物科技有限公司。巰基化核酸適配體序列：5’-SH-CCCCCGTTGCTTTCGCT TTTCCTTTCGCTTTTGTTCGTTTCGTCCCTGCTTCCTTT CTTG-3’由生工生物工程（上海）股份有限公司合成[22]。本實驗室保藏于-20 ℃保存以上材料。

氯金酸、牛血清白蛋白（純度均大于等于98%）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、石墨粉 美國Sigma公司；瓊脂、蛋白胨、酵母浸膏、濃硫酸 國藥集團化學試劑北京有限公司；多壁碳納米管 南京先豐納米材料科技有限公司；實驗中所用試劑均為分析純。本實驗所用的水均是電阻率為18.2 MΩ·cm的超純水。

1.2 儀器與設備

CHI660E電化學工作站 上海辰華儀器有限公司；Tecnai G20透射電子顯微鏡、Super-Nuova加熱磁力攪拌器 美國賽默飛世爾科技公司；Nova Nano SEM掃描電子顯微鏡 美國FEI科技公司；5424R臺式高速冷凍離心機 德國艾本德儀器有限公司；AR2140電子天平美國新澤西奧豪斯儀器有限公司；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；THZ-22臺式恒溫振蕩器 江蘇太倉華大實驗儀器科技有限公司；Direct-Q?3超純水系統 美國Milipore公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；AirT超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；WH-861旋渦混合器 北京華利達有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

阻抗型電化學適配體傳感器的構建流程和檢測銅綠假單胞菌的機理如圖1所示。首先采用電化學沉積的方法將GO/CNT復合納米材料修飾到電極表面，用電化學還原的方法將GO還原為rGO。相比于包含大量含氧雜環(huán)官能團的GO，rGO有更優(yōu)異的電子傳輸性能，可提升檢測靈敏度[23]；隨后，再次用電化學沉積的方法將一層AuNPs材料修飾在電極表面，形成最終的rGO/CNT-AuNPs復合納米材料，AuNPs能提升電流傳輸速度，進而提高系統中電流的信號響應速度，因此信號強度增大，檢測靈敏度更理想，且AuNPs較大的比表面積為適配體的結合提供位點，可負載更多捕獲探針[24-26]；此外，本實驗將能特異性捕獲銅綠假單胞菌的適配體一端修飾巰基，這樣適配體可通過金硫鍵共價結合到電極表面，得到適配體修飾的rGO/CNT-AuNPs工作電極。當與目標菌孵育后，適配體會特異性將細胞捕獲到電極表面，細菌阻礙電流傳輸，引起阻值增大。細菌濃度升高，被捕獲到電極表面的細菌數量也變大，阻值的變化幅度會增大，根據EIS法測得電阻變化值以實現對銅綠假單胞菌的定量檢測。

圖1 電化學適配體傳感器檢測銅綠假單胞菌的設計原理圖Fig.1 Schematic illustration of the electrochemical aptasensor for detecting P.aeruginosa

1.3.2 菌種的活化與處理

配制pH值為7.4的LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉質量濃度分別為10、5、10 g/L）并高壓滅菌處理，將銅綠假單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，副溶血性弧菌則接種于pH 8.5且含質量分數3%氯化鈉的堿性蛋白胨溶液（蛋白胨、氯化鈉質量濃度分別為10、30 g/L）中培養(yǎng)。置于37 ℃振蕩培養(yǎng)活化增菌，隨后將菌液置于4 ℃、3 000 r/min離心5 min，留沉淀去除上清液后，用0.1 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）清洗3 遍以去除殘余的培養(yǎng)基，用生理鹽水溶解，得到初始菌液。

在無菌條件用10 倍濃度梯度稀釋的方法將原始菌液制成1∶10的樣品，每次稀釋之后均充分振蕩混合。隨后吸取100 μL菌液注入LB固體平板培養(yǎng)基（胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉質量濃度分別為10、5、10、15 g/L）上培養(yǎng)，副溶血性弧菌則接種于含3%氯化鈉的營養(yǎng)瓊脂平板進行計數，每個濃度做3 個平行。置于37 ℃培養(yǎng)并觀察計數。計數選取菌落數在30～300之間的平板，并用菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示菌落總數。根據稀釋倍數和菌落個數即可計算初始菌液的濃度。

1.3.3 GO/CNT復合納米材料的制備

參考Hummers等[27]的方法并稍作修改。在冰水浴中加入33.5 mL濃硫酸，加入1.0 g的石墨粉和0.8 g硝酸鈉，再緩慢加入4.5 g高錳酸鉀并小心攪拌，控制反應溫度10 ℃，攪拌反應30 min。隨后升溫到35 ℃，繼續(xù)攪拌反應2 h。隨后加入50 mL超純水，以約5 ℃/min升溫至90 ℃并加入5 mL雙氧水以還原殘余的氧化劑，待溶液變?yōu)榱咙S色后用孔徑為0.22 μm的尼龍微孔濾膜濾去除溶劑。依次用質量分數5%鹽酸和去離子水洗滌3 遍，烘干后得到GO，并制成質量濃度1 mg/mL的溶液，室溫存儲備用。

采用差速離心方法制備GO-CNT復合材料[28]。將1 mL質量濃度1 mg/mL GO溶液與1 mL質量濃度1 mg/mL的碳納米管（carbon nanotube，CNT）溶液混合，超聲處理2 h。先于4 ℃、8 000 r/min離心30 min，漏斗過濾以去除沉淀。再將上清液置于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，過濾留沉淀。將沉淀重溶于水中，后置于4 ℃、14 000 r/min離心30 min并重復3 次。待充分洗滌后，得到GO/CNT溶液，用于電沉積合成復合納米材料。

1.3.4 還原rGO/CNT-AuNPs工作電極的組裝

1.3.4.1 電極清洗

電極需用物理打磨和化學清洗的方式去除表面的雜質，以保持電極之間的一致性。用鐵氰化鉀電解液驗證電極被打磨干凈的程度，觀察循環(huán)伏安曲線相鄰2 段還原峰的電位差值，至65 mV附近時說明電極已經充分清洗干凈，最后將電極氮氣吹干備用。

1.3.4.2 rGO/CNT-AuNPs工作電極制備

本實驗選用玻碳電極為工作電極，銀/飽和氯化銀電極為參比電極，鉑絲電極為對電極的三電極體系。取5 mL按1.3.3節(jié)制備的GO/CNT溶液，在電化學工作站中，用電化學沉積的方法將其沉積在工作電極表面。沉積電位為1.6 V，沉積時間為15 min，得到表面修飾GO/CNT復合納米材料的工作電極。隨后將電極在5 mL濃度為0.1 mol/L的磷酸二氫鉀電化學還原液中用循環(huán)伏安法將GO還原，去除GO含氧雜官能團，得rGO，還原參數為掃描速率0.1 V/s，掃描圈數為180 圈，得到rGO/CNT修飾的工作電極。

用電化學沉積的方法將納米金進一步修飾在電極表面。取5 mL含質量分數1%氯化鉀的氯金酸溶液，在0.2 V恒電位沉積30 s，得到rGO/CNT-AuNPs復合納米材料修飾的工作電極。待電極晾干之后，取10 μL巰基化銅綠假單胞菌適配體小心滴加在電極表面，適配體依靠“金硫鍵”共價結合在電極表面，通風晾干。為了避免納米金材料的非特異性吸附，用巰基乙醇封閉電極1 h，得到表面修飾適配體的rGO/CNT-AuNPs工作電極，并放置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.3 電極表征

對制備電極的每一步用循環(huán)伏安法進行表征，取5 mL含0.1 mol/L氯化鉀的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]（1∶1，m/m）電解液，在三電極體系中進行循環(huán)伏安測量。參數設置：電壓范圍為-0.4～0.8 V，掃描速率100 mV/s。

1.3.5 銅綠假單胞菌檢測

用構建的電化學傳感器檢測不同濃度的銅綠假單胞菌。首先將電極浸入1 mL濃度依次為10、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL的銅綠假單胞菌菌液中，在37 ℃振蕩孵育40 min。用超純水清洗后，用交流阻抗法測量響應信號。EIS工作條件如下：電解液為0.1 mol/L KCl溶液的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]（1∶1，m/m）溶液，外加電壓為0.26 V，振幅為5 mV，電壓頻率變化范圍10-1～105Hz。

1.3.6 實際樣品的測定

1.3.6.1 雞肉樣品中的回收率測定

選用市售雞肉中銅綠假單胞菌為樣本，用加標回收實驗進行驗證。在無菌環(huán)境中取25 g雞肉樣品，在滅菌乳缽內用滅菌剪刀剪碎，隨后加入滅菌水225 mL，混合均質10 min，過濾去除大分子顆粒和懸浮物，制得1∶10稀釋液。隨后加入不同濃度的銅綠假單胞菌，混勻后用1.3.5節(jié)方法進行檢測。將快速檢測結果與平板計數結果比較，計算回收率，對構建的銅綠假單胞菌電化學適配體傳感器進行準確性評估。

1.3.6.2 飲用水中的回收率測定

飲用水取自中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院實驗室，首先將1 mL水樣靜置30 min，過濾去除水中大分子顆粒。隨后4 ℃、14 000 r/min離心30 min，去除小分子懸浮顆粒，留上清液。隨后在上清液中加入不同濃度的銅綠假單胞菌，混勻后用進行檢測。將快速檢測結果與平板計數的結果比較，計算回收率，對構建的銅綠假單胞菌電化學適配體傳感器進行準確性評估。

1.3.7 電阻變化值的計算

實驗數據采集自CHI660E電化學工作站，以加入銅綠假單胞菌前后測得的電阻變化值ΔR展開數據分析，阻值由等效電路擬合得到，ΔR按下式計算：

式中：R0為制備工作電極在空白對照組中測得的適配體阻值/Ω；R1為工作電極和菌液充分孵育之后測得的銅綠假單胞菌適配體阻值/Ω。

1.4 數據處理

實驗數據使用SPSS 8.5軟件進行統計處理。運用Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 復合納米材料的表征

采用透射電鏡和掃描電鏡對制備的材料、修飾后的電極進行表征。圖2A中褶皺狀的薄層為GO的典型結構，能看到GO底層很薄，證明GO層數很少，在水中分散性好、結構完整，沒有過多的折疊結構。其中互相折疊纏繞的管裝結構為直徑約15 nm的碳納米管。電化學沉積納米金操作后的掃描電鏡圖如圖2B所示，電極表面覆蓋一層較厚的金層，電極明顯存在小范圍團聚現象，粒徑約100 nm，尺寸較為統一，且分布均勻，這種表面結構也為固定適配體提供良好且充足的負載位點。

圖2 復合納米材料的表征Fig.2 Characterization of the prepared nanomaterial

2.2 電極制備過程的電化學表征

用循環(huán)伏安法對電極制備的每一個步驟進行表征。由圖3a線可知，典型循環(huán)伏安圖的一對可逆還原氧化峰，峰電流值為112 μA。將GO/CNT材料電化學沉積到電極表面之后，由于GO表面含有大量的羥基、羧基和環(huán)氧基等含氧基團，其破壞石墨烯的共軛結構，影響電子傳輸效率，同時GO占據電極表面的活性位點，會影響電解液中[Fe(CN)6]3-/4-向電極表面擴散，因此造成峰電流值下降至95 μA；當將材料電化學還原為rGO/CNT時，GO上的酚羥基環(huán)氧基團被還原，并使石墨烯平面內的碳原子重新排列，形成穩(wěn)定、重復的連續(xù)環(huán)狀結構，導致rGO的導電能力遠強于GO[29]，因此峰電流值明顯上升至123 μA，比較b、c線也能證明GO被成功還原；d線峰電流值為150 μA，遠高于裸電極和修飾rGO/CNT電極，這是AuNPs材料可增大電極表面的電活性面積，同時也能提升電流傳輸能力，起電化學信號放大的作用。最后在電極表面固定適配體，由于帶負電荷的堿基與[Fe(CN)6]3-/4-間存在的靜電排斥引起峰電流值略微下降。e線峰電流值為140 μA，相比d線下降10 μA，其表明銅綠假單胞菌適配體被成功固定到電極表面。

圖3 復合電極材料的循環(huán)伏安表征Fig.3 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

2.3 實驗條件的優(yōu)化

對實驗中加入的適配體濃度進行優(yōu)化。首先制備好rGO/CNT-AuNPs復合納米材料修飾的工作電極，隨后將濃度分別為20、40、60、80、100 μmol/L巰基適配體溶液滴加在電極表面，晾干后封閉電極。隨后將電極置于濃度為106CFU/mL的銅綠假單胞菌菌液中孵育40 min，并用空白組作對照。取出電極進行ΔR測量，結果如圖4所示。隨適配體濃度的增大，ΔR呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢。當適配體濃度從20 μmol/L上升至40 μmol/L時，ΔR從328 Ω上升至514 Ω，其原因為適配體濃度的增大，固定在電極表面的適配體總量隨之增多，能夠捕獲更多的目標菌，從而引起阻值的上升。當適配體濃度繼續(xù)增大至100 μmol/L時，ΔR的變化并不明顯，在60、80、100 μmol/L分別為526、528、534 Ω，其原因為40 μmol/L濃度適配體與目標菌的結合已經達到飽和，在電極表面沒有剩余的結合位點供適配體結合，捕獲的目標菌數量也達到穩(wěn)定，ΔR并未顯著變化。這也與電極表面納米金的修飾量有關。適配體通過金硫鍵固定在納米金修飾的工作電極表面，因此納米金的表面積決定修飾到電極表面的適配體的量，也間接決定電極表面銅綠假單胞菌的結合位點數量。因此，本實驗中最適的適配體濃度為40 μmol/L。

圖4 適配體濃度的優(yōu)化Fig.4 Optimization of aptamer concentration

孵育時間是影響檢測靈敏度和可靠性的條件之一。為優(yōu)化適配體捕獲探針與目標菌孵育的時間，取濃度為105CFU/mL的銅綠假單胞菌菌液，與適配體修飾的工作電極孵育，置于在37 ℃恒溫振蕩，分別孵育10、20、30、40、50、60 min，隨后進行電化學測量，結果如圖5所示。0～40 min范圍內時，隨孵育時間的延長，ΔR明顯變大，從初始的80 Ω增大到351 Ω；而當孵育時間在40～60 min范圍內時，ΔR在360～363 Ω范圍內變化不明顯，僅增大10 Ω，到達穩(wěn)定狀態(tài)。孵育時間低于40 min時，隨孵育時間的延長，適配體慢慢依靠空間構象和化學鍵與目標菌結合，并將目標菌固定在電極表面，并逐漸達到適配體-靶標特異性結合的飽和狀態(tài)[30]。而孵育時間多于40 min時，幾乎沒有可供結合的位點。因此本實驗最佳的孵育條件為37 ℃孵育40 min。

圖5 孵育時間優(yōu)化Fig.5 Optimization of incubation time

2.4 電化學檢測方法的建立

將制備電極與不同濃度的銅綠假單胞菌菌液在37 ℃孵育40 min后，將電極置于三電極體系中進行電化學測量，結果如圖6所示，半圓的半徑長度與測得的阻值相關，其表示高頻段電子傳遞限制過程，而直線部分則為低頻溶液擴散限制過程[31]。隨菌液濃度的增加，半圓部分的半徑越大，電極界面的阻值越高。

圖6 構建的傳感器檢測不同濃度銅綠假單胞菌的阻抗響應圖Fig.6 Nyquist plots obtained when detecting P.aeruginosa at different concentrations

用圖7等效電路進行擬合，電極溶液接觸面形成雙層電容，Zw是由溶液中的電解質離子向電極表面擴散引起的Warburg阻抗，電極表面的電子傳遞電阻為需測定的阻值[32]。在最佳實驗條件中，銅綠假單胞菌的濃度在10～106CFU/mL時，銅綠假單胞菌濃度和ΔR呈明顯線性關系，線性方程為Y=80.976 5X-39.141（自變量為lgC），相關系數為0.978 3，檢出限為4 CFU/mL（信噪比為3）。在制備好電極的情況中，只需40 min孵育時間和5 min電化學測量即可完成整個檢測，所需時間遠小于常規(guī)檢測方法和基于分子生物學的檢測方法。

圖7 等效電路圖Fig.7 Equivalent circuit

如表1所示，GB 4789.2—2016《菌落總數測定》[33]中規(guī)定的平板計數法仍為微生物檢測普遍適用標準，可實現單個細胞檢測，但是該方法需繁瑣的增菌培養(yǎng)，且耗時很長（2～5 d）。基于PCR反應的LAMP檢出限也達到15.7 CFU/mL，但是所需檢測時間仍超過10 h。其他生物傳感器檢測方法分別基于ECL、低場核磁共振以及EIS等不同原理，雖然檢測時間可縮短至5 h以內，但是檢出限均大于50 CFU/mL。因此，本實驗構建的電化學傳感器在檢測時間（45 min）、檢出限（4 CFU/mL）上均具有明顯的優(yōu)勢。

表1 銅綠假單胞菌不同檢測方法比較Table 1 Comparison between the current method and other reported methods for P.aeruginosa detection

2.5 特異性和重復性分析

本實驗構建檢測方法的特異性取決于所用適配體對銅綠假單胞菌的特異性結合能力。考察該方法對常見的其他4 種食源性致病菌（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌）及混合樣品1（以上5 種菌的混合液）、混合樣品2（不含銅綠假單胞菌的以上4 種菌的混合液）的檢測結果的同時，用生理鹽水作為空白對照組。在最佳實驗條件中，將制備表面修飾適配體的rGO/CNT-AuNPs工作電極與以上各組菌液孵育40 min后，測量ΔR。如圖8所示，在銅綠假單胞菌菌液和含有銅綠假單胞菌的混合菌液中，測得的ΔR約為350 Ω，而在其余不含有銅綠假單胞菌的陰性處理組中，該方法測得的ΔR均約為20 Ω或者更低，表明本方法能夠有效地特異性檢測銅綠假單胞菌。

圖8 構建的電化學適配體傳感器的選擇性Fig.8 Selectivity of the developed electrochemical aptasensor

制備5 支相同的工作電極，并對濃度為105CFU/mL的銅綠假單胞菌溶液展開測量，計算5 組測量的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.2%，說明該方法制備的電極重復性良好。

2.6 實際樣品中銅綠假單胞菌的測定

將雞肉和飲用水樣品進行前處理，隨后加入3 種不同濃度的銅綠假單胞菌。在最佳條件與電極孵育40 min后，進行電化學測量，并用建立的標準曲線計算銅綠假單胞菌的濃度，同時用經典的平板計數法進行計數并做比較。如表2所示，6 組實際樣品中回收率在92.9%～109.6%之間，表明本方法與平板計數法的檢測結果不存在顯著差異，證明本方法在實際樣品中可準確、快速完成檢測。

表2 構建阻抗型電化學傳感器在水樣和肉樣中的加標回收實驗（n=5）Table 2 Recoveries of P.aeruginosa in spiked water and chicken samples using the developed impedance biosensor (n = 5)

3 結 論

本研究合成rGO/CNT-AuNPs復合納米材料，并制備電化學傳感器檢測食品中銅綠假單胞菌。復合納米材料有理想的電化學性能，能大幅提高電子傳輸效率，提升檢測靈敏度和重復性。適配體與銅綠假單胞菌間結合的高親和力確保檢測的強特異性，通過適配體-靶標特異性識別的結合方式，本方法對銅綠假單胞菌的檢測線性范圍為10～106CFU/mL，檢出限可達4 CFU/mL，為目前已知靈敏度最高的銅綠假單胞菌的快速檢測方法。本實驗建立的方法快速、簡便，只需40 min孵育和5 min電化學測量即可完成整個檢測流程，非專業(yè)檢測人員也可通過簡單培訓后完成檢測，為致病菌快速檢測提供靈敏、可靠的新手段。但電化學測試對環(huán)境要求較高，需在安靜的實驗室內完成，無法勝任現場快速檢測的要求。同時，本方法也存在無法實現高通量檢測的弊端。本實驗為開發(fā)性能更加優(yōu)良，且適用于現場檢測的快速、靈敏、高通量在線檢測方法提供參考，以及時應對突發(fā)性食品安全事件，保障消費者的食品安全。