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        不同季節(jié)新鮮鴨蛋表面污染細(xì)菌的多樣性分析

        2021-09-28 03:27:34盧昌麗熊香元龔慧可任佑華陳力力
        食品科學(xué) 2021年18期
        關(guān)鍵詞:鴨蛋菌群季節(jié)

        盧昌麗,熊香元,龔慧可,任佑華,陳力力*,劉 焱*

        (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410128)

        據(jù)報(bào)道2019年我國禽蛋產(chǎn)量高達(dá)3 308.98萬 t,其中鴨蛋約占禽蛋總量的20%,鴨蛋生產(chǎn)已成為我國禽蛋的重要組成部分[1]。鴨蛋富含蛋白質(zhì)、磷脂、磷脂、VA、VB2、VB1、VD、礦物質(zhì)及人體必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]?!夺t(yī)林纂要》記載,鴨蛋補(bǔ)心清肺,止熱嗽,治喉痛。百沸湯沖食,清肺火,解陽明結(jié)熱[4]。長期以來鴨蛋備受消費(fèi)者的喜愛,近十年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明,人們對禽蛋的需求量逐年遞增[5]。同時(shí),鮮鴨蛋的質(zhì)量與衛(wèi)生直接關(guān)系到消費(fèi)者的食用安全,因此也備受關(guān)注[6]。

        鴨的生活習(xí)性喜水、好合群,人們常利用江河、湖泊、水塘等天然養(yǎng)殖場,采用放養(yǎng)、散養(yǎng)的飼養(yǎng)方式[7]。鴨的腹大腿短,臀部豐滿且略下垂,羽毛容易受環(huán)境污染[8];另外鴨下蛋無固定場所,使蛋殼表面很容易黏有污泥、墊草、糞便,導(dǎo)致細(xì)菌生長繁殖;隨著貯藏時(shí)間延長,蛋殼表面的細(xì)菌能經(jīng)過蛋殼上的氣孔水平傳播進(jìn)入蛋內(nèi),在條件適宜時(shí)會大量生長繁殖[9]。前期研究表明鴨蛋殼表面帶菌數(shù)在106以上,其表面菌落總數(shù)與同一環(huán)境中飼料、墊草及空氣的菌落總數(shù)呈正相關(guān)[10]。

        由于一年四季的氣溫、濕度、降雨量、光照等氣候條件有所不同,因此,不同季節(jié)生產(chǎn)的鴨蛋衛(wèi)生品質(zhì)也有所差別[11]。高通量測序技術(shù)作為近十年發(fā)展最迅猛的生物技術(shù),因其相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)和國標(biāo)法具有高覆蓋度、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低成本等特點(diǎn),在食品微生物生態(tài)學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用,目前已在分析食品微生物多樣性、評價(jià)食品發(fā)酵和貯藏過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化、監(jiān)測食源性病原菌動態(tài)特征以及控制食品質(zhì)量等方面發(fā)揮出無可比擬的優(yōu)勢[12]。張雅靖等[13]采用Illumina高通量測序方法,對撒壩火腿表面和內(nèi)部細(xì)菌的16S rDNA V3-V4區(qū)和真菌ITS2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測序,分析群落構(gòu)成和多樣性,結(jié)果表明樣品細(xì)菌的豐度及多樣性高于真菌,且內(nèi)部真菌和細(xì)菌微生物多樣性和豐度均高于表面,并且發(fā)現(xiàn)曲霉和葡萄球菌是撒壩火腿表面和內(nèi)部的優(yōu)勢菌群。Mu Yu等[14]利用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行盤縣火腿加工過程中的微生物群落分析時(shí),同樣得出細(xì)菌群落比真菌群落更為復(fù)雜的結(jié)論。毛俊龍等[15]為了探究茶黃素對低溫貯藏大黃魚表面附著微生物組成的影響,對不同處理大黃魚表面附著微生物進(jìn)行基因組DNA提取及高通量測序、多樣性指數(shù)分析比較,證明0.3 mol/L茶黃素對冷藏和凍藏大黃魚分別進(jìn)行浸泡處理,相較于空白處理和0.3 mol/L VC溶液浸泡處理而言,具有較好的抗氧化性,對脂肪含量較高的大黃魚表面微生物菌落組成有一定的影響,可以抑制部分菌屬生長,延長大黃魚貯藏時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)擬通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析春夏秋冬不同季節(jié)鴨蛋殼表面細(xì)菌的多樣性,從多樣性指數(shù)、不同分類水平物種種群及豐度的差異性和相似性比較季節(jié)因素對鴨蛋表面細(xì)菌污染的影響,為鴨蛋的潔蛋、保鮮以及加工過程中相關(guān)措施的制定提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        從洞庭湖區(qū)定點(diǎn)養(yǎng)殖場分別在春、夏、秋、冬季節(jié)(3月、6月、9月、12月),參照國家“獸藥殘留抽樣檢測技術(shù)操作要點(diǎn)”的抽樣辦法[16],定期采集新鮮鴨蛋80 枚,分別裝入無菌采樣袋,帶回實(shí)驗(yàn)室并在12~20 h內(nèi)處理。

        細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司;無菌采樣袋(229 mm×140 mm) 北京士博瑞科技有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        1704467 瓊脂糖凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司;ABI GeneAmp9700型PCR儀 愛普拜斯公司;SP-752紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;Quanti Fluor TM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品處理

        隨機(jī)從每批樣品鴨蛋中抽取20 枚,各加入100 mL無菌生理鹽水,常溫條件下置于超聲波清洗器中處理50 s,收集洗蛋水混合液作為春夏秋冬四季的樣品(Y1、Y2、Y3、Y4),隨后將4 個(gè)混合液樣品各分為4 份,編號LY1、DY1、HY1、YY1春季樣品;LY2、DY2、HY2、YY2春季樣品;LY3、DY3、HY3、YY3春季樣品;LY4、DY4、HY4、YY4春季樣品。備用。

        1.3.2 細(xì)菌總基因組DNA提取

        上述16 個(gè)樣液各取5 mL收集菌體,按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書抽提出總的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的完整性后,利用紫外分光光度計(jì)測定OD260,得到DNA濃度,并考察OD260/OD280。

        1.3.3 PCR序列擴(kuò)增和Illumina MiSeq測序

        過濾總序列中不合格的DNA模板,對合格的文庫根據(jù)Illumina MiSeq測序區(qū)域(V4+V5),采用合成帶有barcode的特異引物進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增,引物分別為Primer 338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和Primer 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化,高通量測序工作上海美吉生物工程有限公司完成。

        1.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

        根據(jù)barcode序列區(qū)分各個(gè)樣本reads。然后去除嵌合序列,得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù),即Clean reads。用相應(yīng)的軟件進(jìn)行細(xì)菌操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)(在97%的相似水平下)聚類分析和繪制稀釋曲線;α多樣性指數(shù)分析,包括有計(jì)算菌群豐度指數(shù)Chao和ACE,菌群多樣性指數(shù)Shannon和Simpson,測序深度指數(shù)覆蓋率?;谝陨蠑?shù)據(jù)分析的合理性,用Venn圖統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目,再一步進(jìn)行UniFrac的主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA),差異性和相似性;分析門、科、屬和種各水平上物種組成的豐度和多樣性,將聚類后屬水平上的數(shù)據(jù)表示在熱圖上,可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集,通過顏色梯度及相似程度反映多個(gè)樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 Illumina MiSeq測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與質(zhì)量分析

        樣品總基因組DNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明,電泳目的條帶清晰,OD260/OD280比值表明其濃度和純度均符合用于PCR擴(kuò)增。通過對16 個(gè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Illumina MiSeq測序,共獲得697 244 條優(yōu)化序列,按97%的相似度聚類后歸為650 個(gè)OTU,包括35 個(gè)門,298 個(gè)屬。隨機(jī)抽取樣品基因組中一定數(shù)量的序列個(gè)數(shù)與它們所代表的物種數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線,如圖1所示,稀釋曲線逐漸趨于平坦,說明測序數(shù)量足夠充分合理,可以進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)分析。

        圖1 相似度為97%條件下各樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of each sample at similarity of 97%

        2.2 細(xì)菌群落的多樣性分析

        2.2.1α多樣性分析

        如表1所示,樣本中序列被測出的概率高達(dá)99%,說明該數(shù)據(jù)能有效代表樣本中微生物的真實(shí)情況。冬季樣品Y4組(LY4、DY4、HY4、YY4)的ACE指數(shù)和Chao指數(shù)值最大,平均分別為587.5±17.82和596.5±22.29,菌群豐度明顯高于其他3 組季節(jié)樣品;Shannon指數(shù)最大和Simpson指數(shù)最小,平均分別為3.52±1.02和0.1±0.07,種群復(fù)雜度表現(xiàn)最為突出。不同季節(jié)的菌群多樣性排序?yàn)閅4(冬季樣品)>Y1(春季樣品)>Y2(夏季樣品)>Y3(秋季樣品),其中HY4菌群多樣性最高。

        表1 α多樣性指數(shù)Table 1 α-Diversity index

        2.2.2 Venn圖分析

        Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本在相似水平為97%下所共有和獨(dú)有的物種OTU數(shù)目,可以比較直觀地表現(xiàn)樣本的物種數(shù)目組成相似性及重疊情況。由圖2可知,4 組樣品有35 個(gè)共有OTU,分別占各樣品OTU數(shù)目的0.06%~70%,重疊度較小,說明各個(gè)季節(jié)鴨蛋殼表面的菌群種類具有較大的差異性。獨(dú)有的OTU數(shù)目分別為Y1 9 個(gè)、Y2 0 個(gè)、Y3 17 個(gè)、Y4 496 個(gè),在Y1獨(dú)有的OTU中占比最大的為變形桿菌門(Proteobacteria)的淤泥假單胞菌(Pseudomonas_caeni),有研究表明淤泥假單胞菌是抗生素耐藥基因的主要宿主菌[17],會加速耐藥致病菌的產(chǎn)生;Y3中豐度較大是水中最為常見細(xì)菌之一弧菌屬(Vibrio),可引起腸道感染的細(xì)菌,它會引發(fā)腸胃炎和霍亂等疾病[18];Y4主要有Candidate_division_SR1門,變形菌門的β-變形菌綱脫氯菌屬(Dechloromonas)屬于反硝化細(xì)菌可以抑制植物性致病菌,梭狀芽孢桿菌的小紡錘狀菌屬(Fusibacter)和擬桿菌門的Bacteroidetes_vadinHA17科等其他微生物共同作用下降解為反硝化過程提供碳源的物質(zhì)[19]。湖南冬季氣溫較低,陰濕多雨,氣候環(huán)境并不適宜細(xì)菌繁殖,但冬季鴨群喜聚團(tuán)保暖,不?;顒?,使鴨子抵抗力降低,另由于環(huán)境衛(wèi)生等因素造成鴨蛋表面微生物菌群復(fù)雜。而夏季高溫少雨,暑熱時(shí)期長,紫外照射時(shí)間長,鴨子天熱時(shí)經(jīng)常下水,鴨體較為干凈,活動較為分散,減少相互之間的細(xì)菌滋生。

        圖2 不同季節(jié)樣品共有和獨(dú)有OTU Venn圖Fig.2 Venn diagram of unique and shared OTUs of the bacterial communities in different seasons

        2.2.3 基于UniFrac的PCoA

        首先結(jié)合樣本OTU的種類及其相對豐度,通過一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后,選擇主要排在前幾位的特征值,PCoA可以找到距離矩陣中最主要的坐標(biāo),結(jié)果為數(shù)據(jù)矩陣的一個(gè)旋轉(zhuǎn),它沒有改變樣本點(diǎn)之間的相互位置關(guān)系,只是改變了坐標(biāo)系統(tǒng)。UnifracPCoA基于進(jìn)化距離,在進(jìn)化水平上挖掘影響樣品群落組成差異的潛在主成分,繪制PCoA聚類圖。PC1的貢獻(xiàn)率為70.14%,PC2的貢獻(xiàn)率為15.12%,當(dāng)PC1和PC2的總解釋度達(dá)40%就可用于后續(xù)的樣品差異性分析。由圖3可知,16 個(gè)樣品中,每個(gè)季節(jié)的樣品組聚類效果均較優(yōu),其中春季(Y1)組和夏季(Y2)組的樣品相互聚類到一起,而其他組別均出現(xiàn)明顯差異。整體來看,組內(nèi)菌群差異不顯著,但組間菌群豐度差異顯著。

        圖3 基于UniFrac的PCoA聚類分析Fig.3 PCoA clustering analysis based on UniFrac

        2.3 樣品物種組成分析

        2.3.1 門和科水平物種組成分析

        本研究共注釋得到35 個(gè)門,其中絕大多數(shù)是厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria),分別占比59%和38%,其余的33 個(gè)門水平物種不到3%。在科分類水平上,共得到200 個(gè)科,圖4為各樣品相對豐度大于1%的科水平物種的多樣本柱狀圖(相對豐度低于1%的部分合并為other)。在4 組樣品中占比較大的有5 個(gè)科,分別為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)占比28.22%(18.53%~33.34%),桿菌科(Bacillaceae)占比17.77%(10.20%~25.42%),腸球菌科(Enterococcaceae)占比17.18%(12.41%~23.63%),梭菌科_1(Clostridiaceae_1)占比9.21%(4.20%~15.45%),扁球菌科(Planococcaceae)占比6.41%(3.19%~8.85%)。

        圖4 不同季節(jié)多樣品科水平菌種群組成圖Fig.4 Phylum-level composition of microflora in different seasons

        2.3.2 屬水平物種相對豐度及熱圖分析

        物種組成分析顯示,大部分OTUs都可以注釋到屬水平。為了解菌群的分布情況,采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,統(tǒng)計(jì)在屬分類水平上每個(gè)樣品的菌群組成,共得到298 個(gè)屬,其中Y1擁有49 個(gè)屬,Y2擁有32 個(gè)屬,Y3有85 個(gè)屬,Y4有285 個(gè)屬。由表2可知,各樣品的優(yōu)勢菌屬,其中Y1埃希氏菌屬-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)相對豐度最大(25.61±10.42)%;Y2腸球菌屬(Enterococcus)相對豐度最大(19.74±9.31)%;Y3和Y4的芽孢桿菌屬(Bacillus)相對豐度最大,分別為(25.42±18.16)%和(18.27±14.09)%。這說明氣溫對芽孢桿菌屬無明顯影響,在蛋殼表面普遍存在,但氣溫對志賀菌影響顯著,過高(Y2)或過低(Y4)都能抑制其生長。Y4的others(即相對豐度低于1%)物種占比為(22.53±20.01)%,說明其物種多樣性明顯高于其他3 組樣品。此外在屬水平上發(fā)現(xiàn)有腸桿菌(Enterobacter)、溶菌桿菌(Lysinibacillus)、梭菌(Clostridium_sensu_stricto_1)、厭氧桿菌(Aneurinibacillus)等普通方法難以分離鑒定的細(xì)菌序列。

        表2 不同季節(jié)屬水平樣品相對豐度分布統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of relative abundance distribution at genus level in different seasons

        熱圖可以用顏色變化反映樣品物種豐度的數(shù)據(jù)信息,直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示,如圖5所示,顏色由藍(lán)色到紅色分別代表相對豐度為0%~50.53%。通過顏色的梯度及相似程度,能更清晰地反映各樣品屬水平上群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異性。圖5中冬季(DY4、HY4、LY4、YY4)樣品中的顏色明顯比其他3 組偏綠,說明其菌群的相對豐度高于其他3 個(gè)季節(jié)的菌群豐度,且物種多樣性也明顯比其他3 組高。從橫向看樣品中有不同深淺顏色的深綠色、亮黃色到紅色,表示這些菌群在樣品之間有較高的相似度,雖然存在顏色差異,豐度有些許不同,但也說明它們是樣品中普遍存在的群落,都含有梭狀芽孢桿菌1型屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希氏菌屬-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、消化鏈球菌屬(Peptoclostridium)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)[20]。在其他某些藍(lán)色的區(qū)域出現(xiàn),則說明只是一部分的菌屬或樣品具有相似度,例如,酸性氨基桿菌屬(Acidaminobacter)、未分類禽桿菌(Rhodocyclaceae_unclassified)和擬桿菌(Marinilabiaceae)僅Y4中有存在草綠色區(qū)域,其他均為藍(lán)色;禽桿菌科(Rhodocyclaceae)的陶厄氏菌屬(Thauera)和Parcubacteria_norank在Y3和Y4為黃綠色區(qū)域,其他均為藍(lán)色,說明兩兩菌屬之間具有較高的豐度相似度,但樣品間的差異極大。

        圖5 不同季節(jié)的樣品屬水平熱圖Fig.5 Heatmap showing bacterial community structure at genus level in different seasons

        2.3.3 種水平物種組成分析

        在種水平上,16 個(gè)樣品能鑒定出447 個(gè)種,其中Y1擁有62 個(gè)種,Y2擁有39 個(gè)種,Y3有109 個(gè)種,Y4有427 個(gè)種,但各個(gè)種的豐度都較小,而且大部分為沒有得到明確種的分類(unclassified)。如表3所示,列出各組樣品在種水平上總序列數(shù)大于700的物種,其主要為未分類芽孢桿菌(Bacillus_unclassified)、未分類埃希氏菌屬-志賀菌屬(Escherichia-Shigella_unclassified)、未分類腸球菌(Enterococcus_unclassified)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium_perfringens_NCTC_8239)和未分類腸桿菌(Enterobacter_unclassified),與在屬水平分析的物種組成結(jié)果差異不大。結(jié)果表明,從種水平上看,不同季節(jié)的樣品各相同物種序列數(shù)差異大且多樣性更為復(fù)雜,在表中樣品細(xì)菌種類多但豐度小難以進(jìn)行明確的分類。

        表3 不同季節(jié)樣品種水平物種組成Table 3 Bacterial community composition at genus level in different seasons

        3 討 論

        目前對于禽蛋類殼表面細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)研究大部分以雞蛋為主[21],而鴨蛋表面的細(xì)菌菌群多樣性分析較少。這是因?yàn)?,盡管資料表明,從蛋白質(zhì)方面看鮮鴨蛋及其制品的營養(yǎng)價(jià)值與鮮雞蛋相當(dāng),甚至在脂肪和礦物質(zhì)含量上優(yōu)于雞蛋,可作為雞蛋的有益補(bǔ)充,完善膳食結(jié)構(gòu)[22],但消費(fèi)者對雞蛋的認(rèn)知度高、需求量大,雞蛋的產(chǎn)銷量高于鴨蛋,雞蛋更容易成為人們研究的熱點(diǎn);另外,長期以來,鴨蛋多被生產(chǎn)加工成皮蛋和咸蛋等蛋制品;鴨蛋的污染菌種類多而復(fù)雜,普通的菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基無法觀察到,比如硝化螺旋菌門[23](Nitrospirae)、米氏硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillus)等有著嚴(yán)格的培養(yǎng)要求,其深入研究有一定難度[24]。由于鴨的生活習(xí)性與雞有差別,2 種禽蛋殼被污染的菌群有一定區(qū)別,石一等[25]從3 個(gè)不同養(yǎng)殖場取樣分析雞蛋殼表面多樣性結(jié)果得出其表面細(xì)菌以厚壁菌門和放線菌門為主。從本實(shí)驗(yàn)不同季節(jié)鴨蛋殼表面的細(xì)菌菌群多樣性分析結(jié)果表明,鴨蛋殼表面菌群35 個(gè)門,其中最主要的是厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria),比雞蛋殼物種豐度高些。

        在生產(chǎn)過程中,蛋鴨自身感染是鴨蛋殼表面污染菌的影響因素之一,養(yǎng)殖場會在秋季人工強(qiáng)制的方法讓母鴨換羽[26],使鴨短期內(nèi)還能繼續(xù)產(chǎn)蛋,這會導(dǎo)致鴨子身體虛弱,入冬時(shí)天氣濕冷,導(dǎo)致病鴨增多,因此產(chǎn)蛋少且質(zhì)量不好。本實(shí)驗(yàn)的菌群多樣性分析出有部分腸道致病菌:芽孢桿菌是導(dǎo)致食品腐敗的主要因素之一[27];腸球菌是一類存在于人和動物消化道內(nèi)的致病菌,其中糞腸球菌能破壞腸道內(nèi)DNA,同時(shí)產(chǎn)生一定的有害化學(xué)物質(zhì),誘發(fā)直腸癌[28];埃希氏菌屬-志賀菌屬也是一種腸道致病菌,引起細(xì)菌性痢疾[29]。測序結(jié)果中還發(fā)現(xiàn):梭菌是嚴(yán)格厭氧菌屬,很難分離培養(yǎng),與長期使用抗生素有關(guān)[30],易引發(fā)炎癥;假單胞菌致腐敗能力強(qiáng),存在于糞便和肉類產(chǎn)品中[31];產(chǎn)堿菌屬存在于水和土壤以及脊椎動物腸道中,是常見的專性好氧型寄生菌,易受感染;還有一部分沒能明確屬水平的腸桿菌科等。

        禽蛋殼表面細(xì)菌的微生態(tài)系統(tǒng)是受多個(gè)因素影響的結(jié)果,楊伊磊等[32]采用細(xì)菌菌落總數(shù)進(jìn)行測定,得出結(jié)果認(rèn)為造成禽蛋表面細(xì)菌污染的主要原因均受飼養(yǎng)場的空氣、飼料、墊草的細(xì)菌污染。Shi Yi等[33]對不同面積,不同貯藏時(shí)間的雞蛋蛋殼微生物群研究,認(rèn)為蛋殼上微生物群的結(jié)構(gòu)、豐度和組成因不同環(huán)境和不同時(shí)期而異。姜慧繪等[34]研究不同天氣對新鮮鴨蛋蛋殼的細(xì)菌污染情況,實(shí)驗(yàn)表明在陰冷潮濕天氣條件下,新鮮鴨蛋蛋殼細(xì)菌群落總數(shù)、大腸菌群數(shù)不同程度高于晴朗高溫天氣。與本實(shí)驗(yàn)聚類熱圖分析的冬季(Y4)菌群相對豐度高于其他3 個(gè)季節(jié)的結(jié)果相似。

        4 結(jié) 論

        以不同季節(jié)鴨蛋蛋殼洗液樣品為研究對象,通過Illumina MiSeq測序技術(shù)對樣品殼表面中細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行測序,從稀釋性曲線證明本實(shí)驗(yàn)的測序結(jié)果具有代表性和真實(shí)性。結(jié)果表明,16 個(gè)樣品均具有較高的菌群多樣性,且各個(gè)時(shí)期都有相似的優(yōu)勢菌屬:厚壁菌門的芽孢桿菌屬和腸球菌屬,分別占比17.78%和17.16%;變形菌門的埃希氏菌屬-志賀菌屬占比17.14%。季節(jié)變化對鴨蛋表殼的菌群結(jié)構(gòu)有一定影響。芽孢桿菌和腸球菌在秋季相對于春季的豐度高些,而大腸桿菌屬-志賀菌屬受季節(jié)氣溫影響最為明顯,在冬季減少,來年春季氣溫上升并生長迅速,夏季氣溫繼續(xù)升高而豐度降低,秋季時(shí)豐度增高。夏季和秋季樣品的多樣性較低,但其優(yōu)勢菌種的相對豐度較高,占比可達(dá)80%。冬季樣品的蛋殼表面細(xì)菌菌群多樣性和相對豐度最高,也最為復(fù)雜,更有研究表明蛋殼的污染菌會侵入蛋內(nèi)容物,冬季產(chǎn)蛋加大造成污染的風(fēng)險(xiǎn),要在冬季時(shí)加強(qiáng)產(chǎn)蛋鴨的營養(yǎng)需求和生產(chǎn)管理。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)在門、科、屬和種水平上全面地分析鴨蛋表面細(xì)菌的多樣性以及其季節(jié)性變化,分析表面細(xì)菌對鴨蛋腐敗變質(zhì)的潛在影響,強(qiáng)調(diào)了養(yǎng)殖場按季節(jié)變化分期管理和定期衛(wèi)生管理的重要性,為進(jìn)一步禽蛋污染研究提供一定參考。

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