江 虹，龐向東，蔣 翠，冉紅杰，付 玲，劉 璐

（長(zhǎng)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 408100）

食品中常用色素分為天然色素和合成色素兩大類，合成色素具有價(jià)廉、色鮮且不易褪色的優(yōu)點(diǎn)，在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。但合成色素若食用過(guò)多，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的不安全性或危害性（如頭痛、腹瀉、哮喘、過(guò)敏甚至致癌等），因此，對(duì)食品中合成色素進(jìn)行研究有著重要意義。為了保障人們的身體健康及飲食安全，GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)添加劑的使用作出專項(xiàng)的限量規(guī)定，明確指出，飲料中檸檬黃和日落黃的加入量不得超過(guò)0.10 g/kg，可見，建立快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)食品中共存色素的方法具有重要的研究意義。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)檸檬黃和日落黃的檢測(cè)研究主要有電化學(xué)法[1-9]、高效液相色譜法[10-16]、高效薄層色譜法[17]、熒光法[18]及分光光度法[19-26]等，GB 5009.35—2016《食品中合成著色劑的測(cè)定》采用高效液相色譜法，這些方法通常需對(duì)共存色素進(jìn)行吸附分離處理后進(jìn)行測(cè)定，操作較為復(fù)雜。所報(bào)道的分光光度法除用較復(fù)雜的吸附分離處理外，還可根據(jù)吸收曲線的重疊情況采用較復(fù)雜的解聯(lián)立方程組的辦法解決共存色素的含量檢測(cè)問(wèn)題[23-26]。本實(shí)驗(yàn)以乙基紫作為探針，采用控制酸度的吸收光譜法研究飲料中共存色素——檸檬黃與日落黃的含量問(wèn)題，此法不需分離，只需在同一體系中控制溶液酸度，便可直接測(cè)定共存的檸檬黃和日落黃。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飲料：橙味、蘋果味、香蕉味、檸檬味、橙味、蘇打味、橙蜜味、橙味、橙汁、青檸汁（編號(hào)依次為1#～10#），均購(gòu)自本地超市。

檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（≥98%，Lot：A3J6L1）、日落黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（≥98%，Lot：JN1103RA14）均為北京盛世康普化工技術(shù)研究院生產(chǎn)，由北京普析科技有限公司提供。

乙基紫（分析純） 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（HCl）、氨水（NH3·H2O）（均為分析純） 重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；氨丁三醇（Tris）（分析純）河南天孚化工有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3010型紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司；KQ-200VDE型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C型酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取一定量的檸檬黃和日落黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（精確至±0.000 1 g），用水溶解并分別定容至250 mL，配成1.00×10-3mol/L貯備液，操作液為1.00×10-4mol/L，存于4 ℃冰箱中；乙基紫溶液：準(zhǔn)確稱取適量乙基紫，用水溶解并定容至500 mL，配成1.00×10-3mol/L；HCl溶液：0.10 mol/L；Tris溶液：0.20 mol/L；Tris-HCl溶液：用酸度計(jì)測(cè)定，配成pH 3.5～9.5。

1.3.2 樣品處理

精密移取1#～10#飲料各30.0 mL，并準(zhǔn)確稱其質(zhì)量（精確至±0.000 1 g），分別置于小燒杯中，45 ℃超聲20 min，加適量水，攪拌，再超聲10 min，用NH3·H2O調(diào)至中性，再超聲10 min，取出，冷至室溫，定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法

精密移取適量檸檬黃（或日落黃）標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL具塞比色管中，加入1.00 mL pH 5.69 Tris-HCl溶液（檸檬黃體系）和1.00 mL pH 8.68 Tris-HCl溶液（日落黃體系），再各加入2.00 mL乙基紫溶液，用水定容至10 mL，搖勻，待反應(yīng)10 min后，以試劑空白作參比，在波長(zhǎng)506 nm處測(cè)定檸檬黃體系溶液的吸光度，在波長(zhǎng)646 nm處測(cè)定日落黃體系溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Origin軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收光譜特征

反應(yīng)機(jī)理：乙基紫是一種三苯甲烷類的堿性染料，在溶液中以陽(yáng)離子形式存在；檸檬黃結(jié)構(gòu)上有磺酸根離子和羧酸根離子，日落黃結(jié)構(gòu)上有磺酸根離子，在溶液中Na+離去后，均以陰離子形式存于溶液中；于是陰、陽(yáng)離子以靜電引力相作用分別生成乙基紫-檸檬黃和乙基紫-日落黃的二元離子締合物，其體系吸收光譜見表1。

表1 檸檬黃-乙基紫體系與日落黃-乙基紫體系在不同酸度下的吸收光譜特征Table 1 Absorption spectral characteristics of tartrazine-ethyl violet system and sunset yellow-ethyl violet system under different acidities

從圖1A可知，單獨(dú)的檸檬黃溶液和單獨(dú)的日落黃溶液分別在波長(zhǎng)426 nm和480 nm處有一較大的吸收峰（曲線1和曲線2），兩曲線間有重疊（即相互間有干擾），因此不能直接分別測(cè)定2 種物質(zhì)的含量。

圖1 檸檬黃-乙基紫體系與日落黃-乙基紫體系的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of tartrazine-ethyl violet system and sunset yellow-ethyl violet system

如果在檸檬黃和日落黃的pH 5.69 Tris-HCl溶液中加入乙基紫溶液，乙基紫與檸檬黃和日落黃均可以靜電引力結(jié)合生成離子締合物，在光譜曲線上出現(xiàn)具有多個(gè)特征吸收峰的新光譜，圖1A中曲線4和曲線5，與曲線3的吸收峰（594 nm）比較，曲線4和曲線5均有波移現(xiàn)象，這說(shuō)明乙基紫與檸檬黃和日落黃均可反應(yīng)生成新物質(zhì)。再比較曲線4和曲線5可知，檸檬黃體系在酸性條件（pH 5.69）下波長(zhǎng)506 nm處有一較大的負(fù)吸收峰，而日落黃在此處的吸收幾乎近于0；檸檬黃體系在波長(zhǎng)420 nm和波長(zhǎng)655 nm處分別還有一較大的正吸收峰，但日落黃在此兩波長(zhǎng)下也有較大吸收；故可選擇在波長(zhǎng)506 nm處測(cè)定檸檬黃，日落黃不干擾。日落黃體系在pH 5.69酸性條件下，雖有較大特征吸收峰，但檸檬黃也有較大吸收，對(duì)其干擾嚴(yán)重，因此在酸性條件下不能單獨(dú)測(cè)定共存的日落黃。

由圖1B可知，在pH 8.68 Tris-HCl條件下，乙基紫可與檸檬黃和日落黃反應(yīng)，檸檬黃體系出現(xiàn)2 個(gè)較大的負(fù)吸收峰（曲線2），日落黃體系出現(xiàn)1 個(gè)較大的正吸收峰（曲線1）。比較曲線1和曲線2可知，在此弱堿性條件下，均不能在波長(zhǎng)496 nm和波長(zhǎng)626 nm處單獨(dú)測(cè)定檸檬黃（日落黃有干擾），但可以在波長(zhǎng)646 nm處單獨(dú)測(cè)定日落黃（檸檬黃的吸光度近于0，不干擾日落黃的測(cè)定）。

從圖1C可知，在波長(zhǎng)506 nm處，檸檬黃在一定范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度與體系的負(fù)吸光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系，可用于檸檬黃的定量分析。從圖1D可知，在波長(zhǎng)646 nm處，日落黃在一定范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度與體系吸光度也有良好的線性關(guān)系，可用于日落黃的定量分析。故可以在波長(zhǎng)506 nm處，pH 5.69 Tris-HCl條件下，單獨(dú)測(cè)定共存的檸檬黃（日落黃不干擾）；在波長(zhǎng)646 nm處，pH 8.68 Tris-HCl條件下，單獨(dú)測(cè)定共存的日落黃（檸檬黃不干擾）。

2.2 適宜條件的選擇

2.2.1 溶液酸度及用量

考察檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)操作液為1.00 mL，乙基紫溶液為2.00 mL時(shí)，1.00 mL不同pH值的Tris-HCl溶液對(duì)波長(zhǎng)506 nm和波長(zhǎng)646 nm處的檸檬黃-乙基紫體系與日落黃-乙基紫體系吸光度絕對(duì)值（|A|）的影響，見圖2?？芍诓ㄩL(zhǎng)506 nm及pH 5.69的Tris-HCl條件下，檸檬黃體系有相對(duì)最大的|A|（曲線1），日落黃體系的|A|近于0（曲線2），即在pH 5.69條件下，可以在波長(zhǎng)506 nm處測(cè)定檸檬黃，日落黃不干擾；在波長(zhǎng)646 nm及pH 8.68 Tris-HCl條件下，檸檬黃體系的|A|近于0（曲線4），而日落黃體系則有相對(duì)最大的|A|（曲線3），即在pH 8.68 條件下，可以在波長(zhǎng)646 nm 處測(cè)定日落黃，檸檬黃不干擾。同時(shí)考察pH 5.69和pH 8.68的用量對(duì)各體系|A|的影響，結(jié)果表明，最適宜的用量均為1.00 mL。實(shí)驗(yàn)選用1.00 mL pH 5.69 Tris-HCl（檸檬黃體系）和1.00 mL pH 8.68 Tris-HCl（日落黃體系）分別在波長(zhǎng)506 nm測(cè)定檸檬黃和在波長(zhǎng)646 nm測(cè)定日落黃。

圖2 溶液pH值對(duì)吸光度絕對(duì)值的影響Fig.2 Effect of solution pH on absolute absorbance value

2.2.2 乙基紫溶液的用量

考察檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)操作液為1.00 mL，pH 5.69（檸檬黃體系）和pH 8.68（日落黃體系）Tris-HCl溶液1.00 mL時(shí)，乙基紫溶液用量對(duì)波長(zhǎng)506 nm處的檸檬黃體系和波長(zhǎng)646 nm處的日落黃體系|A|的影響，見圖3。兩體系的乙基紫溶液用量為2.00 mL時(shí)，體系|A|相對(duì)最大，大于或小于2.00 mL，|A|有不同程度降低（表明乙基紫加入不夠使反應(yīng)不完全，或乙基紫加入過(guò)量，使自身聚集增強(qiáng)，從而導(dǎo)致|A|降低），故實(shí)驗(yàn)選用乙基紫的適宜用量為2.00 mL。

圖3 乙基紫用量對(duì)吸光度絕對(duì)值的影響Fig.3 Effect of ethyl violet dosage on absolute absorbance value

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間及締合物的穩(wěn)定性

在上述選定的條件下，考察5～80 min對(duì)檸檬黃體系（506 nm，pH 5.69）及日落黃體系（646 nm，pH 8.68）對(duì)|A|的影響。結(jié)果表明：兩體系在10 min內(nèi)均可反應(yīng)完全，生成締合物的穩(wěn)定時(shí)間至少1 h。故兩體系的測(cè)定時(shí)間選在10 min后的穩(wěn)定區(qū)進(jìn)行。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

準(zhǔn)確移取0.00、0.20、0.60、1.00、1.40、1.80 mL 1.00×10-4mol/L檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.00、0.20、0.60、1.00、1.40 mL 1.00×10-4mol/L日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法加入其他試劑溶液并用水定容，在選定時(shí)間及各體系波長(zhǎng)下測(cè)定各溶液的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)參數(shù)見表2?？梢?，該方法有較高靈敏度，可用于檸檬黃和日落黃的定量分析。

表2 日落黃和檸檬黃的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table 2 Analytical figures of merit of absorption spectrometry for determination of sunset yellow and tartrazine

2.4 方法的選擇性

考察波長(zhǎng)506 nm處的檸檬黃體系（pH 5.69）和波長(zhǎng)646 nm處的日落黃體系（pH 8.68）在相對(duì)誤差不大于±5%時(shí)，某些共存物對(duì)檸檬黃（5.34 mg/L）及日落黃（4.52 mg/L）測(cè)定的影響。結(jié)果表明：100 倍的K+、Na+、NH4+、NO3-、Cl-、葡萄糖、蔗糖、甜蜜素、安賽蜜、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、D-蘇氨酸、L-谷氨酸；50 倍的麥芽糖、D-果糖、D-色氨酸、L-白氨酸、甘氨酸、檸檬酸三鈉、抗壞血酸、姜黃素、誘惑紅；20 倍的Ba2+、Sr2+、Fe2+、Sn2+、Pb2+、Ca2+、Mg2+、C2O42-、CO32-、尿素、淀粉、胭脂紅、赤蘚紅；3 倍的Fe3+、Al3+等不干擾測(cè)定?？梢姡瑱幟庶S體系和日落黃體系均有良好的選擇性。

2.5 樣品分析及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

2.5.1 樣液測(cè)定

取1.3.2節(jié)的1#～10#待測(cè)液各2.00 mL，按實(shí)驗(yàn)方法加入乙基紫溶液和各體系最佳酸度的Tris-HCl溶液（檸檬黃體系pH 5.65，日落黃體系pH 8.68），在波長(zhǎng)506 nm處測(cè)定樣液中檸檬黃含量，在波長(zhǎng)646 nm處測(cè)定樣液中日落黃含量，最后求出原始飲料中共存的檸檬黃和日落黃含量，并參考文獻(xiàn)[23-26]和GB 5009.35—2016作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，其準(zhǔn)確度和精密度均無(wú)顯著性差異，本法與國(guó)標(biāo)法的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 飲料樣品分析結(jié)果（n=5）Table 3 Comparison of results of absorption spectrometry and the national standard method for sunset yellow and tartrazine in beverage samples (n = 5)

2.5.2 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

準(zhǔn)確移取1#～10#飲料各30.0 mL并準(zhǔn)確稱量后分別置于小燒杯中，準(zhǔn)確加入一定量的檸檬黃和日落黃標(biāo)準(zhǔn)貯備液，在45 ℃超聲20 min，后續(xù)操作同樣液的制備，最后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容。取該液2.00 mL，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定各加標(biāo)回收率，見表4。結(jié)果表明，方法有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表4 飲料樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（n=5）Table 4 Spiked recoveries of sunset yellow and tartrazine in beverage samples (n = 5)

續(xù)表4

3 結(jié) 論

建立乙基紫作為探針測(cè)定共存色素——檸檬黃和日落黃含量的酸度控制吸收光譜法，簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需分離和進(jìn)行復(fù)雜的數(shù)學(xué)處理，只需控制溶液酸度，便可達(dá)到分別測(cè)定共存物檸檬黃和日落黃的目的。方法有較高靈敏度、較寬線性范圍和良好的選擇性，準(zhǔn)確度和精密度滿足定量分析要求。該法適于飲料中共存檸檬黃和日落黃的定量分析。