高向陽，張 芳

（1.鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064；2.鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室，河南 鄭州 450064）

釀造醬油是以大豆、小麥或麩皮為原料，經(jīng)一定工藝和微生物發(fā)酵制成的具有特殊色、香、味的紅褐色或棕褐色液體調(diào)味品，醬香較濃、味鮮咸適口[1-3]、營養(yǎng)豐富[4]，且有抗氧化[5-6]、降血壓的作用[7-9]，是大眾日用必備功能性調(diào)料。GB 18186—2000《釀造醬油》規(guī)定氨基酸態(tài)氮（以氮計）含量大于等于0.80 g/100 mL為特級；大于等于0.70 g/100 mL為一級；大于等于0.60 g/100 mL為二級（低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油）、大于等于0.55 g/100 mL為二級（高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油）；大于等于0.40 g/100 mL為三級[10]。

GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮含量的測定》的第一法為酸度計法[11]，其選用NaOH標準溶液滴定，因pH玻璃電極可產(chǎn)生顯著的“鈉差”[12-14]，使結(jié)果明顯偏低[15-17]；而且該法未考慮甲醛試劑可能含有的甲酸[18]對測定結(jié)果的影響[19-21]。該法加入甲醛轉(zhuǎn)化氨基酸態(tài)氮前，試液用NaOH標準溶液滴定至pH 8.2，加入甲醛后滴定至pH 9.2為終點，此滴定過程違背定量分析中的“等物質(zhì)的量轉(zhuǎn)化和反應(yīng)原則”[22]。酸度計不但受溫度的影響，且需要用電和標準溶液及時校正[23-25]。滴定劑用量需代入公式計算結(jié)果，判斷不直觀、工作效率較低。

本實驗擬建立衡量釀造醬油氨基酸態(tài)氮含量符合一定級別的快速檢測方法，無需用電源和酸度計等儀器，以消除電極的“鈉差”，并避免響應(yīng)時間“滯后”導(dǎo)致標準溶液滴過終點的不足。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加加草菇生抽、加加金標生抽 鄭州加加味業(yè)有限公司；李錦記精選生抽、李錦記味極鮮醬油、李錦記錦珍老抽 李錦記（新會）食品有限公司；魯花自然鮮醬油 山東魯花生物科技有限公司；廚邦海鮮醬油廣東美味鮮調(diào)料食品有限公司；海天老抽 佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司。

活性炭200 目 上海市易恩化學技術(shù)有限公司；中性甲醛（質(zhì)量分數(shù)為37%～40%） 西隴科學有限公司；氫氧化鉀、NaOH（均為分析純） 國藥集團化學試劑上海有限公司；pH 6.8的蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

電子萬用爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；UV-2800AH型紫外-可見分光光度計、UV-4802H型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；PXSJ-216離子計 上海儀點科學儀器股份有限公司；機械型超聲波清洗儀 上海合金超聲設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別稱取NaOH 2.857 0、3.929 0、4.286 0、5.000 0、5.714 0 g放置于小燒杯中，加50 mL蒸餾水溶解后，分別移入5 個250 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻以配制0.285 7、0.392 9、0.428 6、0.500 0、0.571 4 mol/L NaOH標準溶液備用。

1.3.2 紫薯色素的制備[26-27]

取鮮紫薯5 g切成片狀，于研缽中研磨成糊狀，按料液比1∶5（g/mL）加入蒸餾水（pH 6.8），移入100 mL比色管中，置于功率500 W的55 ℃超聲波清洗器中，提取15～20 min后過濾得到紫薯色素，置于滴瓶中備用。

1.3.3 中性甲醛的配制

向36%～38%甲醛溶液中滴加4～6 滴紫薯色素，混勻后逐滴滴加NaOH溶液，當溶液顏色由紅橙色變?yōu)槌然疑?0 s內(nèi)不褪色時，停止滴定，密閉保存，備用。

1.3.4 pH值與紫薯色素顯色關(guān)系的測定

取12 個100 mL小燒杯，各加約40 mL蒸餾水，酸度計上逐滴滴加0.10 mol/L HCl或0.10 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)至pH值分別為2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00、13.00，然后各滴加4 滴紫薯色素，搖勻后，分別移取5 mL溶液于25.00 mL比色管中，觀察紫薯色素在不同pH值溶液中的顏色變化，并記錄pH值及其對應(yīng)溶液顏色。

1.3.5 樣品的脫色

取1.00 mL李錦記味極鮮醬油于試管中，加9.00 mL水和0.12 g活性炭振蕩，靜置2 min，混合液過濾，用加入0.40 g活性炭處理的樣液為空白，于336.0 nm波長處測定吸光度。再分別用0.16、0.20、0.24、0.28、0.30、0.32 g活性炭處理后的醬油溶液用上述同樣的方法測定其吸光度并按式（1）計算脫色率：

式中：A0為稀釋至10 倍醬油樣品未脫色時測定的吸光度；A為稀釋至10 倍醬油樣品加入不同量活性炭脫色后測定過濾液的吸光度。

1.3.6 醬油樣品的等級及其參數(shù)測定

用移液槍移取1.00 mL醬油原樣于25 mL比色管中，加入9.00 mL蒸餾水稀釋，加0.30 g活性炭，用玻璃棒輕輕攪動脫色，2 min后過濾，用移液槍取1.00 mL過濾澄清液于10 mL比色管中，滴加2～3 滴天然紫薯色素，此時溶液為紅色或紅橙色。用滴管逐滴加0.050 mol/L NaOH標準溶液至顏色為橙灰色時加入2.00 mL中性甲醛，把所取1.00 mL醬油過濾液中的氨基酸態(tài)氮完全轉(zhuǎn)化為酸性羧基（—COOH），此時溶液為紅色或紅橙色，然后加入1.00 mL符合各級別等物質(zhì)量的NaOH標準溶液，輕搖2～3 s后觀察溶液顏色，根據(jù)表1所示顏色及對應(yīng)參數(shù)細則判斷所屬釀造醬油等級。若溶液呈紅色、紅橙色、橙灰色，則為合格產(chǎn)品；若溶液呈藍灰、綠土或黃棕色，則為不合格產(chǎn)品。各級別產(chǎn)品溶液中剩余的酸性物質(zhì)的量大小順序為紅色＞紅橙色＞橙灰色。溶液中剩余NaOH的量大小順序為黃棕色＞綠土色＞藍灰色。被檢測溶液酸堿“等量點”顯示指示劑紅橙色、藍灰色的混合色，即橙灰色。

表1 釀造醬油中的氨基酸態(tài)氮各級別參數(shù)Table 1 Minimum amino acid nitrogen concentration for each grade of brewed soy sauce

2 結(jié)果與分析

2.1 溶液pH值與紫薯色素呈現(xiàn)顏色

由圖1可知，紫薯色素在pH 2.00～3.00的溶液中為紅色，pH 4.00～7.00的溶液中為紅橙色，pH 8.00時為橙灰色；pH 9.00時為藍灰色，在pH 10.00～11.00的溶液中為綠土色，pH 12.00～13.00時為黃棕色，是溶液酸度指示的理想食用呈色劑。

圖1 紫薯色素在不同pH值下的呈色圖Fig.1 Color of purple sweet potato colorant under different pH conditions

2.2 NaOH標準溶液目標濃度的設(shè)定

氨基酸加入中性甲醛后，堿性氨基（—NH2）與甲醛結(jié)合，堿性消失，而呈現(xiàn)酸性的—COOH與NaOH標準溶液發(fā)生等物質(zhì)的量反應(yīng)。各級別產(chǎn)品加入中性甲醛轉(zhuǎn)化氨基酸態(tài)氮時，要求氮的最低濃度即要求的氨基酸最低濃度，也是轉(zhuǎn)化后要求羧基的最低目標濃度，因此，各級合格產(chǎn)品中—COOH的最低目標濃度應(yīng)等于其氮的最低濃度除以氮的摩爾質(zhì)量，各級別合格產(chǎn)品對應(yīng)的最低質(zhì)量濃度為：三級、二級（對高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油）、二級（對低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油）、一級和特級。

配制相應(yīng)級別同濃度的NaOH標準溶液，當其與樣品中的—COOH發(fā)生“等物質(zhì)的量反應(yīng)”后，若羧基剩余，則相應(yīng)級別產(chǎn)品中氨基酸的含量高，判定為合格的產(chǎn)品；若羧基不足，強堿（—OH）剩余，則釀造醬油中氨基酸的含量低于相應(yīng)級別的要求，判定為不合格產(chǎn)品。若所取樣品中—COOH的物質(zhì)的量與加入NaOH的物質(zhì)的量相等，反應(yīng)正好達到所要求級別最低指標的理論終點，溶液呈現(xiàn)的是指示劑紅橙色和藍灰色的混合色，即橙灰色，此情況較為罕見。

2.3 NaOH標準溶液的標定和調(diào)節(jié)

分別準確稱取105 ℃烘至恒量的鄰苯二甲酸氫鉀基準試劑0.6～1.2、0.8～1.6、0.8～1.8、1.0～2.0、1.2～2.5 g（均準確至0.000 1 g）于潔凈錐形瓶中，加蒸餾水約40 mL溶解，各加入紫薯色素4 滴，分別用0.285 7、0.392 9、0.428 6、0.500 0、0.571 4 mol/L NaOH標準溶液標定，當溶液由紅橙色變?yōu)槌然疑?0 s內(nèi)不褪色時為滴定終點，記錄消耗NaOH溶液的體積V1（mL），同時取40 mL蒸餾水進行空白實驗和顏色比對，按式（2）計算濃度：

式中：C（NaOH）為NaOH標準溶液的濃度/（mol/L）；m為稱取鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量/g；204.22為鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質(zhì)量（g/mol）；V0為空白液所消耗NaOH溶液的體積/mL；V1為標定質(zhì)量為m的鄰苯二甲酸氫鉀所消耗NaOH溶液的體積/mL。

各做4 次平行標定，檢驗無可疑值后取平均值，若濃度低于或高于目標濃度，計算既有濃度后，添加固體NaOH或計算并添加蒸餾水，直至重新標定后達到目標濃度。

2.4 活性炭用量對樣品脫色的影響

如圖2所示，加入活性炭后靜置2 min，活性炭最佳用量為0.30 g，脫色率為92.56%，脫色效果理想。

圖2 活性炭用量對醬油脫色的影響Fig.2 Effect of activated carbon dosage on the decolorization of soy sauce

2.5 對照測定結(jié)果

按GB 5009.235—2016的第一法酸度計法對樣品進行測定，將試樣溶液的顏色、氨基酸態(tài)氮含量與商品標注值進行比較，結(jié)果如表2所示。GB 5009.235—2016法樣品測定結(jié)果均高于商品標注值。

表2 釀造醬油原樣品對照測定結(jié)果Table 2 Results of determination of amino acid nitrogen in original samples of brewed soy sauce

2.00 mL中性甲醛可將所取100 μL原醬油樣品中的氨基酸態(tài)氮完全轉(zhuǎn)化為等物質(zhì)量的酸性物質(zhì)（—COOH）[10-11]。用移液槍加目標濃度的NaOH溶液100 μL，輕搖2～3 s后觀察溶液顏色，此時溶液仍為紅色、紅橙色或橙灰色且30 s內(nèi)不褪色，則產(chǎn)品為合格的發(fā)酵醬油，若為灰藍色、綠土色或黃棕色且30 s內(nèi)不褪色，則產(chǎn)品為不合格。

2.6 驗證實驗結(jié)果

將醬油原樣按照一定的比例用蒸餾水稀釋后作為樣品，根據(jù)GB 5009.235—2016第一法平行測定3 次，檢驗無可疑值后取平均值。釀造醬油原樣稀釋1、5 倍后的檢測結(jié)果和紫薯色素的顏色、相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別如表3、4所示。

表3 釀造醬油原樣稀釋1 倍后的檢測結(jié)果及驗證Table 3 Results of determination and verification of amino acid nitrogen in one-fold diluted brewed soy sauce

表4 釀造醬油原樣稀釋5 倍后的檢測結(jié)果及驗證Table 4 Results of determination and verification of five-fold diluted brewed soy sauce

由表3、4可知，醬油原樣品稀釋1、5 倍后作為樣品，按照GB 5009.235—2016第一法進行3 次平行測定的RSD均小于7.5%。

根據(jù)各級別釀造醬油的氨基酸態(tài)氮的合格指標，按照“等物質(zhì)的量反應(yīng)”原則，取100 μL原釀造醬油樣品，即可加入100 μL目標濃度的NaOH標準溶液進行快速鑒別。按所述步驟方法鑒別時，樣品溶液中剩余的酸性物質(zhì)（—COOH）的量從多到少的對應(yīng)順序為紅色＞紅橙色＞橙灰色；溶液中剩余的一元強堿（—OH）量從大到小對應(yīng)順序為黃棕色＞綠土色＞灰藍色。

3 結(jié) 論

根據(jù)釀造醬油不同級別氨基酸態(tài)氮參數(shù)合格的最低要求，科學設(shè)計NaOH溶液的濃度。依據(jù)等物質(zhì)的量反應(yīng)原則，加入同量的一元強堿溶液，如果所取醬油樣品中氨基酸態(tài)氮的量大于一元強堿溶液的量，用中性甲醛轉(zhuǎn)化氨基酸態(tài)氮生成的酸性物質(zhì)（—COOH）的量也大于一元強堿溶液的量。反應(yīng)完成后，酸性物質(zhì)剩余，該產(chǎn)品為合格產(chǎn)品，剩余的酸越多，產(chǎn)品質(zhì)量相對越好；若所取釀造醬油等物質(zhì)的量轉(zhuǎn)化出酸性物質(zhì)的量等于加入的一元強堿溶液的量，反應(yīng)恰好到達相應(yīng)級別醬油最低要求的理論終點，釀造醬油為符合最低指標要求的合格產(chǎn)品；若所取醬油轉(zhuǎn)化出的酸性—COOH的量小于加入的一元強堿溶液的量，強堿剩余，則該釀造醬油中的氨基酸態(tài)氮低于相應(yīng)級別的最低要求，為不符合相應(yīng)級別的產(chǎn)品，可用隨pH值增加而呈色明顯不同紫薯色素快速鑒別。紫薯色素在pH 2.00～3.00溶液中為紅色，pH 4.00～7.00的溶液中為紅橙色，pH 8.00時為橙灰色；紫薯色素呈現(xiàn)紅色、紅橙色和橙灰色時，釀造醬油為合格產(chǎn)品；紫薯色素為藍灰色、綠土色、黃棕色時釀造醬油為不合格產(chǎn)品。

該法所需樣品、試劑、標準溶液量少，無需用電和儀器，因此成本低廉，具有操作簡便、快速、判斷直觀的突出優(yōu)點，為釀造醬油產(chǎn)品質(zhì)量的快速鑒別提供新的檢測方法，有較強的推廣應(yīng)用價值。