劉 璐，吳江麗，楊金桃，唐忠月，曾雪峰*

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種由谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化谷氨酸合成的抑制性神經遞質[1]，普遍分布于動植物體內。研究表明，GABA不僅具有降低神經元性、防止神經細胞過熱的作用，還具有防止動脈硬化、調節(jié)心律失常、降低血脂、增強肝功能等生理功效[2-4]。隨著年齡的增長和精神壓力不斷變大會影響人體內谷氨酸轉化為GBAB，并且當人體缺乏GABA時，會出現(xiàn)焦躁、失眠、疲勞等癥狀，而通過日常飲食攝入GABA是補充該功效物質的一種有效方式，因此GABA的大規(guī)模生產及其作為生物活性食品成分在現(xiàn)代食品工業(yè)中的應用成為人們關注的焦點。近年來，一些安全性高的微生物，如乳酸菌[5]、酵母菌[6]、曲霉菌[7]被用于發(fā)酵合成GABA。而利用微生物中GAD脫羧形成GABA，具有成本低、富集含量高、安全性高的優(yōu)點[8]。

乳酸菌是動物腸道內的正常菌群，對人體安全有利[9]，被認為是食品和藥品行業(yè)合成GABA的首選對象。傳統(tǒng)酸性發(fā)酵食品是產GABA乳酸菌重要的分離來源，許多研究表明乳酸菌具有GAD活性，可以催化谷氨酸脫羧產生GABA。很多研究者從泡菜、酸奶、干酪等發(fā)酵食品中分離出大量產GABA的植物乳桿菌[10-12]、短乳桿菌[13]、副干酪乳桿菌[14]、乳酸乳球菌[15]、布氏乳桿菌[16]等多種乳酸菌。Min等[17]從韓國泡菜中分離出一株高產GABA的短乳桿菌Lactbacillus brevis，因其較高的GABA產量，較好的環(huán)境適應性等特點，可作為發(fā)酵食品的潛在發(fā)酵劑進行應用。Di等[18]從干酪中分離出一株高產GABA的植物乳桿菌Lactbacillus plantarum，可用于生產功能性飲料或作為護膚品研發(fā)的新用途。Su等[19]從發(fā)酵水產品中分離出來的產GABA香腸乳桿菌Lactbacillus farciminis，會對發(fā)酵魚產品中GABA積累有影響，可能有助于提高傳統(tǒng)發(fā)酵漁業(yè)產品的健康效益和商業(yè)價值。

魚醬酸是我國黔東南地區(qū)極具苗族原生態(tài)飲食文化特色的發(fā)酵調味品[20]，其利用自身攜帶或環(huán)境中的微生物在自然條件下發(fā)酵而成，具有營養(yǎng)價值高、酸香濃郁、色澤鮮亮等特點。魚醬酸中蘊含種類繁多、數(shù)量豐富、且具有較好發(fā)酵性能的乳酸菌，而酸性環(huán)境、富含底物谷氨酸為乳酸菌合成GABA提供了有利條件。當前關于魚醬酸中產GABA的乳酸菌的研究還鮮有報道，本研究以魚醬酸作為原料，篩選出發(fā)酵特性和益生效果較好、產GABA量高的乳酸菌用于魚醬酸接種發(fā)酵，以此改進傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，提升產品品質，以期為實現(xiàn)富含GABA的魚醬酸產品開發(fā)及工業(yè)化生產提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無鱗小泥鰍、二荊條紅辣椒、生姜、食鹽、白酒市購。

MRS液體培養(yǎng)基 青島海博生物公司；L-谷氨酸、L-谷氨酸標準品、GABA標準品、豬膽鹽、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、酪氨酸、RNA酶、溶菌酶 北京索萊寶科技有限公司；茚三酮 國藥集團化學試劑有限公司；四硼酸鈉 天津市永大化學試劑有限公司；次氯酸鈉、溴甲酚紫 天津市致遠化學試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖 美國Biowest公司。

1.2 儀器與設備

XSS-2電子顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物技術有限公司；SW-CJ-10超凈工作臺 蘇州凈化有限公司；PHS-3E pH計、L5S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；A300梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 杭州朗基科學儀器有限公司；GIS-630凝膠成像儀 杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備工藝流程

樣品制備工藝流程如下：

1.3.2 魚醬酸中優(yōu)勢乳酸菌初步鑒定

從發(fā)酵的魚醬酸中取第1、3、5、9、15、21、30天樣品，制成樣液；依次進行梯度稀釋，涂布后于37 ℃培養(yǎng)48 h。每個平板隨機挑取5 個單菌落，進行劃線培養(yǎng)，至菌株純化[21-22]。觀察分離純化后的菌株菌落形態(tài)，進行革蘭氏染色、過氧化氫酶實驗、葡萄糖產酸產氣實驗完成對疑似乳酸菌菌株的初步鑒定。

1.3.3 產GABA菌株定性定量分析

L-谷氨酸液體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入10 g/L的L-谷氨酸，調節(jié)pH值至6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)液：取活化兩代后的菌株菌液，接3%（V/V）于L-谷氨酸液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，備用。

薄層色譜法：取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL，離心（16 000×g、15 min），取上清液。用毛細管取適量發(fā)酵上清液點于G型硅膠薄層板上。以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶3，V/V）配制展開劑，添加0.4%茚三酮，做密閉上行展開，經90 ℃顯色15 min。同時以L-谷氨酸液體培養(yǎng)基、1 g/L GABA標準液、1 g/LL-谷氨酸標準液作為對照。

Berthelot比色法：參考肖君榮[23]的方法，取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL，離心（16 000×g、15 min），取上清液600 μL，加入0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖液2 mL，6%苯酚溶液800 μL（V/V），混勻，再加入10%次氯酸鈉溶液900 μL，振蕩混勻，沸水浴10 min后，冰浴20 min，待出現(xiàn)藍綠色后，加入60%乙醇溶液4 mL，振蕩均勻，靜置后于645 nm波長處測定其吸光度。

1.3.4 產GABA菌株鑒定

生理生化指標：進行產黏性、葡萄糖產氣、明膠液化、硝酸鹽還原、淀粉水解、產硫化氫等實驗。

16S rDNA擴增：將明顯具有產GABA能力的試驗菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，活化至兩代，對其進行基因鑒定。按照天根細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株的DNA，采用細菌通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系（25 μL）：2×T5 Direct PCR Mix 12.5 μL，正反向引物各1 μL，模板DNA 1.5 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經過2%瓊脂糖電泳分析，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果在NCBI上進行BLAST比對。

1.3.5 耐酸性實驗

參考Zeng Xuefeng等[24]的方法稍作修改。吸取0.5 mL活化菌液轉至裝有10 mL磷酸鹽緩沖液的試管中，滴加5 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值至2.5，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，以平板活菌數(shù)計數(shù)法測定存活菌數(shù)，按照下式計算菌株存活率：

1.3.6 耐膽鹽性實驗

分別向MRS液體培養(yǎng)基中加入0.1%、0.2%、0.3%的豬膽鹽，再分別接入1%（V/V）的活化菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，于600 nm波長處測定其OD值，以不加豬膽鹽的組作為對照。

1.3.7 氨基酸脫羧酶活性實驗

吸取100 μL活化的菌液接至加入1%過濾滅菌后的酪氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸溶液的MRS液體培養(yǎng)基中（含0.6 g/L溴甲酚紫作為指示劑），未加菌液的作為對照組，37 ℃培養(yǎng)3～7 d，觀察其顏色，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)樽仙瑒t為氨基酸脫羧酶陽性。

1.3.8 抑菌實驗

1.3.8.1 菌液及發(fā)酵上清液的抑菌實驗

采用紙片瓊脂擴散法測定每株菌的抑菌性，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，將0.1 mL活化的指示菌菌液接入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中進行涂布，使用無菌鑷子在培養(yǎng)基上放置無菌的濾紙片（6 mm），吸取15 μL活化后的菌液點于無菌濾紙片上，平板置于4 ℃冰箱2 h，再經37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑菌圈大小。參考胡彥新等[25]的方法并稍加改動，對經紙片瓊脂擴散法已經顯現(xiàn)出抑菌活性的菌株，其發(fā)酵液經4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，同樣進行抑菌實驗。

1.3.8.2 排除過氧化氫抑菌作用實驗

用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調節(jié)發(fā)酵上清液至過氧化氫酶的最適作用pH 7.0；將發(fā)酵上清液用1 mol/L過氧化氫酶處理于37 ℃水浴1 h，最后調節(jié)回對照pH值，以未經酶處理的發(fā)酵上清液作為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小[25]。

1.3.8.3 排除有機酸抑菌作用實驗

取發(fā)酵上清液，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH 6.0，進行排除有機酸抑菌作用實驗[25]。

1.3.8.4 蛋白酶敏感實驗

將胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶分別加入發(fā)酵上清液中至終質量濃度為1 mg/mL，利用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值至各蛋白酶最適宜范圍：胰蛋白酶pH 7，胃蛋白酶pH 2，中性蛋白酶pH 7，37 ℃水浴2 h，調回上清液初始pH值，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小[25]。

1.3.9 菌株生長曲線、pH值及菌株產酸速率實驗

分別以2%（V/V）的接種量將活化后的待測菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測定其OD600nm和pH值，以時間為橫坐標，繪制菌株生長曲線和pH值變化曲線。將篩選出的產GABA菌株分別接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，以無菌MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照組，測定其pH值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 魚醬酸中優(yōu)勢乳酸菌的分離純化及初步鑒定結果

從發(fā)酵魚醬酸中分離純化得到387 株疑似乳酸菌，菌株的菌落形態(tài)呈現(xiàn)出透明、不透明、白色、乳白色，表面光滑較圓，表面較圓微隆起。鏡檢結果為短棒狀、桿狀、長桿狀、球狀、鏈狀，符合乳桿菌、乳球菌的形態(tài)學特征。對分離出的387 株菌進行革蘭氏染色、葡萄糖產酸、接觸酶實驗。根據(jù)革蘭氏染色陽性、可利用葡萄糖產酸、接觸酶陰性的結果，有117 株符合乳酸菌的生理生化特點，可初步判斷為乳酸菌。

2.2 產GABA菌株定性定量實驗

將初篩得到的117 株菌接入L-谷氨酸液體培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵48 h，獲得105 株渾濁度高、生長速率快的菌株，經薄層色譜定性得到15 株具有明顯產GABA能力的菌株。如圖1所示，分別為Y113、Y123、Y133、Y64、Y271、Y273、Y63、Y278、Y272、Y274、Y61、Y341、Y343、Y346、Y279，將這15 株菌作為實驗菌株。

圖1 部分菌株的發(fā)酵上清液薄層色譜圖Fig.1 TLC profiles of fermentation supernatants of selected bacterial strains

利用Berthelot比色法對篩選出的15 株產GABA菌株進行定量分析，由圖2可知：Y113、Y279及Y64產GABA的量較高，其質量濃度分別為0.239、0.209、0.192 mg/mL，說明魚醬酸中蘊含具有產GABA能力的乳酸菌，其酸性環(huán)境及富含底物谷氨酸可以為合成GABA提供較好的條件。

圖2 15 株菌發(fā)酵48 h后GABA質量濃度Fig.2 GABA production by 15 strains after fermentation for 48 h

2.3 產GABA菌株的鑒定結果

2.3.1 生理生化鑒定

對15 株實驗菌進行生理生化實驗，菌株均不產氣、不產H2S，明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗、淀粉水解實驗結果為陰性，符合乳酸菌生理生化特征。

2.3.2 16 S rDNA擴增和序列結果分析

對上述15 株產GABA菌株進行DNA提取及PCR擴增，瓊脂糖電泳結果見圖3。將16S rDNA基因序列結果在NCBI上進行BLAST比對，15 株實驗菌與參考菌株同源性均在99%以上。如表1所示，共鑒定出4 個菌種。其中，11 株為植物乳桿菌，2 株為食竇魏斯氏菌，1 株為熊蜂魏斯氏菌，1 株為戊糖乳桿菌。同其他發(fā)酵產品類似，魚醬酸發(fā)酵過程中除了存在能產GABA的植物乳桿菌，還存在能產GABA的魏斯氏菌，包括2 株食竇魏斯氏菌和1 株熊蜂魏斯氏菌。其中食竇魏斯氏菌Y113產GABA量較高于其他菌株，為0.239 mg/mL。Bao等[26]發(fā)現(xiàn)，接種食竇魏斯氏菌，同時添加低聚木糖作為益生元進行豆?jié){發(fā)酵，能提高GABA的含量，但并未明確是否是食竇魏斯氏菌的作用使其含量增加。魏斯氏菌多存在于醬油、豆豉、泡菜、酸奶、奶酪、香腸等發(fā)酵產品中，目前多被應用于食品、醫(yī)藥、微生物等領域，迄今為止有關食竇魏斯氏菌合成GABA的研究鮮有報道。

圖3 15 株菌的16S rDNA擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA genes from 15 strains

表1 15 株菌的16S rDNA鑒定結果Table 1 Results of 16S rDNA identification of 15 strains

2.4 耐酸性實驗結果

魚醬酸發(fā)酵過程中由于各種微生物產生有機酸，使其體系的pH值逐漸降低。用于接菌發(fā)酵的菌株應具備較好的耐酸性，既能在酸性體系內展現(xiàn)其發(fā)酵特性，又能承受人體胃部的低酸性環(huán)境發(fā)揮其益生性。由表2可以看出，具有產GABA能力的15 株乳酸菌，耐酸性各不同，但均能在pH 2.5條件下存活，這表明在低酸性環(huán)境下也有較好的生長活力。其中Y113、Y123、Y133這3 株魏斯氏乳酸菌的耐酸能力低于其他菌株，這可能與其適宜在pH 3.0～9.5范圍內生長有關[27]。此外，植物乳桿菌在魚醬酸發(fā)酵后期逐漸成為優(yōu)勢菌種，快速產酸縮短發(fā)酵周期，其較強的耐酸能力可能是多種耐酸機制共同作用的結果，如中和過程、生物膜和細胞密度、質子泵、保護和修復細胞大分子、前期適應和交叉保護使用保護物質等[28]。

表2 15 株菌在pH 2.5培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后的存活情況Table 2 Survival of 15 strains after cultured pH 2.5 medium for 3 h

2.5 耐膽鹽性實驗結果

小腸內膽鹽質量分數(shù)在0.3%左右，一般食物通過需要1～4 h，因此作為接種發(fā)酵的菌株應具備一定的耐膽鹽性，能在通過小腸時仍然保持活力發(fā)揮益生作用。有學者對發(fā)酵產品中的乳酸菌進行膽鹽耐受性實驗，發(fā)現(xiàn)大部分乳酸菌能夠耐受0.2%～0.4%的膽鹽，有些菌的膽鹽耐受性更高[29-30]。由圖4可以看出，15 株具有產GABA能力的乳酸菌在含質量分數(shù)0.3%的膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后仍顯示出較好的耐膽鹽能力。其中，Y113、Y64、Y271、Y272、Y279顯示出較強的耐受能力。高濃度的膽汁可溶解磷脂，破壞細胞膜脂質雙層結構，引起裂解、細胞內物質丟失、葡萄糖攝取喪失和細胞死亡，除此之外，還會引起蛋白質錯誤折疊、DNA和RNA氧化損傷以及細胞內酸化。由于膽汁和膽鹽產生的應激反應的復雜性，微生物膽鹽耐受性就需要不同的耐受機制，包括外排泵的存在、膽鹽水解酶的數(shù)量、細胞維持細胞內穩(wěn)態(tài)的內在能力以及細胞膜結構和組成的改變[31]。乳酸菌較強的耐膽鹽性可能與其菌體中脂肪酸的構成相關，飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比例高有利于菌株在含膽鹽的環(huán)境中維持細胞的完整性[32]。同時，乳酸菌在膽鹽存在環(huán)境中可以分泌膽鹽水解酶來降低膽鹽對自身細胞的危害。

圖4 15 株菌在不同質量分數(shù)膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的OD600 nm值Fig.4 OD600 nm measured for 15 strains cultured in medium with different concentrations of bile salts for 24 h

2.6 氨基酸脫羧酶活性實驗結果

生物胺廣泛存在于人體、動物、植物、微生物體內以及人類日常食品中，但是生物胺總量超過危害值時會引起中毒現(xiàn)象。發(fā)酵魚制品的加工滿足生物胺形成的幾個條件[33]：大量游離氨基酸、具有氨基酸脫羧酶活性的微生物、適合具有脫羧酶活性及脫羧酶合成的微生物的生長環(huán)境。游離氨基酸在發(fā)酵過程中易被微生物產生的特定脫羧酶脫羧形成生物胺，而氨基酸脫羧酶呈陰性的菌株則能夠很大程度降低發(fā)酵制品中生物胺的含量，提高產品的安全性。15 株產GABA乳酸菌中，均未出現(xiàn)培養(yǎng)基變?yōu)樽仙默F(xiàn)象，說明菌株不具備氨基酸脫羧酶活性，無法促進生物胺的形成。將其用于接菌發(fā)酵，既能改進魚醬酸發(fā)酵工藝，又可保障魚醬酸的安全性。

2.7 抑菌實驗結果

存在于傳統(tǒng)發(fā)酵制品的乳酸菌可以產生一些抗菌物質，如細菌素。細菌素是一類新型天然防腐劑，它是由某些細菌在代謝過程通過核糖體合成機制產生的分泌在胞外的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽[34-35]。乳酸菌作為細菌素的主要產生菌株，可應用于接菌發(fā)酵或作為抑菌劑加入到食品中產生作用。如表3所示，15 株菌的菌液顯示出明顯的抑菌作用，很有可能是由于菌液中存在微生物競爭、過氧化氫或有機酸。為排除菌體或其代謝產物引起的抑菌作用，將離心所得上清液進行抑菌實驗，排除有機酸、過氧化氫的抑菌實驗。結果顯示Y113、Y123、Y133未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，而其他菌株仍然具有抑菌性，這說明具有抑菌性的菌株可能是在生長代謝過程中產生了其他的抑菌物質。為進一步確定產生的抑菌物質是否具有蛋白質性質，使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶對發(fā)酵上清液進行處理。結果顯示其余12 株具有抑菌性的菌株，對蛋白酶較敏感，其發(fā)酵上清液基本無抑菌效果。這表明12 株菌可能產生蛋白質類的抑菌物質，若用于接菌發(fā)酵，可提升產品的安全性，但仍需對這些蛋白質類的抑菌物質作進一步的研究。

表3 15 株菌的抑菌性Table 3 Antibacterial activity of 15 strains

2.8 基于PCA的多變量分析

采用基于PCA的多變量分析對不同分離菌株的數(shù)據(jù)進行技術表征，以合成GABA的量、耐酸性、耐膽鹽性、氨基酸脫羧酶活性、抑菌性為指標。如圖5所示，不同菌株在GABA含量及發(fā)酵特性上存在顯著差異。菌株Y64和菌株Y279在耐膽鹽性、耐酸性、抑菌性上表現(xiàn)較佳，同時有較高的GABA合成能力，又兼具較好的發(fā)酵性能。3 株魏斯氏菌中Y113在GABA合成能力上表現(xiàn)更佳，但在發(fā)酵性能上稍欠缺。因此，選擇菌株Y279、Y64和Y113進行菌株生長特性的研究。

圖5 利用PCA篩選15 株菌中潛能菌株Fig.5 PCA plot for discrimination of 15 strains

2.9 生長曲線、pH值及產酸速率實驗

經以上發(fā)酵特性實驗，從15 株實驗菌中得到一株耐酸、耐膽鹽、無氨基酸脫羧酶活性，產GABA量最高的食竇魏斯氏菌Y113及2 株耐酸、耐膽鹽、無氨基酸脫羧酶活性，具有較好的抑菌性、產GABA能力較好的植物乳桿菌Y64及Y279。對3 株產GABA乳酸菌進行生長曲線及pH值的測定，結果如圖6所示，3 株菌培養(yǎng)至第2小時后進入對數(shù)生長期，當培養(yǎng)至第10小時后進入穩(wěn)定生長期，說明3 株菌都能迅速達到適宜的活力，其中Y113在進入穩(wěn)定期時出現(xiàn)下降趨勢，可能是因為此時的生長條件、滲透環(huán)境或pH值不適宜菌株生長，促使菌體發(fā)生自溶。pH值變化趨勢同生長曲線的趨勢基本吻合，3 株菌在進入對數(shù)生長期后pH值迅速降低，其中2 株植物乳桿菌Y64和Y279呈現(xiàn)出快速產酸的能力。

圖6 3 株菌的生長曲線（A）和pH值（B）Fig.6 Growth curves (A) and acid production curves (B) of three selected strains

用于接種發(fā)酵的菌株應具有較好的產酸能力，乳酸菌利用碳水化合物快速發(fā)酵產生有機酸和抑菌物質，這樣既可在發(fā)酵過程中抑制其他有害微生物的生長繁殖，又可縮短發(fā)酵周期，促進營養(yǎng)物質及色澤風味的形成。以菌株培養(yǎng)36 h內的產酸情況作為評價菌株產酸速率的指標，3 株菌株在37 ℃、36 h內的產酸速率如圖7所示，Y113、Y64及Y279快速產酸，使所在體系pH值迅速下降。植物乳桿菌具有更高的產酸速率，3 株菌比較，Y113、Y64、Y279在第36小時的pH值分別為4.23、3.84和3.79。從pH值下降的趨勢也可以看出，植物乳桿菌產酸速率快于食竇魏斯氏菌，顯示出更快的產酸速率。因此，選用植物乳桿菌Y279或Y64進行接種發(fā)酵，可以縮短發(fā)酵周期，保障產品的安全性。

圖7 3 株菌在36 h內的產酸速率Fig.7 Acid-producing activity of three strains

3 結 論

魚醬酸蘊含產GABA乳酸菌與它優(yōu)良品質的形成之間有密切聯(lián)系，但此前并未對其產GABA乳酸菌進行研究。本研究從發(fā)酵魚醬酸中篩選出117 株革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性、可利用葡萄糖產酸的疑似乳酸菌。利用薄層色譜法及比色法對117 株疑似乳酸菌進行定性定量，得到15 株具有明顯產GABA能力的菌株，經過生理生化實驗得出15 株產GABA菌株均不產黏性、不產氣、不產H2S，過氧化氫酶實驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗、淀粉水解實驗結果均為陰性。對這15 株產GABA菌株進行一系列發(fā)酵特性實驗，得到一株產GABA量最高的食竇魏斯氏菌Y113及2 株發(fā)酵性能和益生效果優(yōu)良，產GABA量較高的植物乳桿菌Y279和Y64?；诰闥279在發(fā)酵性能、益生效果和產GABA能力上的表現(xiàn)較為優(yōu)秀，可將其用于魚醬酸進行接種發(fā)酵。本研究為改善魚醬酸發(fā)酵工藝，篩選出可應用于接種發(fā)酵的產GABA乳酸菌，對提升產品風味、營養(yǎng)價值，工業(yè)化生產提供了一定的理論依據(jù)。