潘 瑩， 甄遠(yuǎn)航， 徐光輝， 謝凌波， 張 菡， 江 波*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫214122；2.中糧屯河崇左糖業(yè)有限公司 廣西壯族自治區(qū)認(rèn)定企業(yè)技術(shù)中心，廣西 崇左532200；3.中糧糖業(yè)控股股份有限公司 新疆維吾爾自治區(qū)甜菜制糖工程研究中心，新疆 昌吉831100）

糖蜜作為制糖業(yè)的加工副產(chǎn)品，是一種深褐色、呈黏稠狀、半流動(dòng)的液體，僅在蔗糖加工過(guò)程中每年就能產(chǎn)生350萬(wàn)噸的廢料糖蜜。糖蜜中可溶性碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，含有40%～50%，蔗糖在所含糖類中質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)50%，還含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%～10%的礦物質(zhì)和少量的蛋白質(zhì)[1]。作為益生元的重要組成部分，低聚果糖（FOS）根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為兩類：葡萄糖-果糖型（GFn）和果糖-果糖型（Fn），GFn型FOS一般由蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）組成[2]。FOS因具有良好的溶解性、熱穩(wěn)定性及較低的甜度，常用于提升食品口感與延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期[3]。此外，優(yōu)良的保健功能和特殊的生理活性，如具有促進(jìn)消化道有益菌的生長(zhǎng)、吸附腸道病原菌、刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫因子和提高飼料利用率等作用，使FOS逐漸被大眾所關(guān)注，并被視為取代抗生素的可能配料之一。因此，將糖蜜作為原料利用雙酶法制備低聚果糖具有重大意義[4-5]。

β-果糖基轉(zhuǎn)移酶（FTase，亦稱β-呋喃果糖苷酶）通過(guò)水解蔗糖分子上葡萄糖和果糖間的β（1→2）糖苷鍵，使果糖基與另一蔗糖分子連接而生成FOS[6]。Reddy等報(bào)道以2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甘蔗糖蜜和0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）豆粕為底物，使Aspergillus nigerPSSF21產(chǎn)出的β-呋喃果糖苷酶（FFase）酶活最高，生成的主要產(chǎn)物為GF2和GF3[7]。以甜菜糖蜜為原料，Zhang通過(guò)發(fā)酵法制取低聚果糖，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單易行，操作方便，但該方案中僅利用微生物產(chǎn)生的果糖基轉(zhuǎn)移酶水解糖蜜，長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵使低聚果糖含量大幅度降低，使低聚果糖在行業(yè)中的應(yīng)用受到限制[8]。Khatun等鑒定出一種高效產(chǎn)低聚果糖的菌株Aureobasidium pullulan，以此作為全細(xì)胞生物催化劑，從而避免了昂貴的酶回收和純化的需要[9]。但菌株的培養(yǎng)及活化通常需要36～72 h，二級(jí)種子液也至少需要發(fā)酵72 h，耗費(fèi)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。糖蜜中含有10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的膠體含量，其中膠體的主要成分是果膠質(zhì)，較高的膠體含量引起糖蜜黏度過(guò)大，導(dǎo)致糖蜜利用困難，因此利用果膠酶（Pectinase）去除果膠質(zhì)是糖蜜生產(chǎn)FOS的一個(gè)良好前提[10]。當(dāng)前研究均以果糖基轉(zhuǎn)移酶為單一酶，而作者以糖蜜為原料，利用果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶為復(fù)合酶液，制備高轉(zhuǎn)化率的低聚果糖，提高了制糖副產(chǎn)物的利用率及附加值，降低了飼料級(jí)低聚果糖的生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖蜜：中糧屯河崇左糖業(yè)有限公司提供；D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；蔗 果 三 糖（GF2）、蔗 果 四 糖（GF3）、蔗 果 五 糖（GF4）：Sigma公司產(chǎn)品；果膠酶（800 U/mL）、果糖基轉(zhuǎn)移酶（5 000 U/mL）：作者所在實(shí)驗(yàn)室提供；所用其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

夾層酶反應(yīng)器：上海申迪玻璃儀器有限公司產(chǎn)品；DF0825型浸入式高低溫恒溫循環(huán)裝置：南京百思禾生物科技有限公司產(chǎn)品；RVDV-II+P型黏度計(jì)：美國(guó)Brookfield公司產(chǎn)品；FE20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；FreeZone冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Labconco公司產(chǎn)品；Carbolite馬弗爐：弗爾德（上海）儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；K-360型凱氏定氮儀：瑞士Buchi公司產(chǎn)品；Waters e2695高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品成分分析及檢測(cè)方法蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法；總糖含量測(cè)定參照GB 5009.7—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測(cè)定》中直接滴定法；水分含量測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法；灰分含量測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》。糖組分及含量測(cè)定通過(guò)高效液相色譜儀和示差折光檢測(cè)器聯(lián)用測(cè)定。色譜條件如下：色譜柱為ZORBAX NH2柱（Agilent，4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相配比為V（乙腈）∶V（水）=70∶30；流量1 mL/min；進(jìn)樣量10μL；柱溫30℃。

1.3.2 糖蜜酶解液的制備方法取一定量的糖蜜制備為水溶液，將糖蜜與水混合后攪拌至糖蜜完全溶解于水中并調(diào)整其固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，在一定的溫度及pH條件下加入果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)合酶液進(jìn)行反應(yīng)，定時(shí)取樣，通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)溶液的糖分組成[11]。

1.3.3 不同復(fù)合酶液比例對(duì)FOS轉(zhuǎn)化率的影響取1 L溶解后的糖蜜水溶液在反應(yīng)溫度為55℃、pH 5.5的條件下，加入12.5 mL不同比例的果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)合酶液（果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶體積比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1），并與單獨(dú)加入果膠酶及果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶解液進(jìn)行比較，反應(yīng)過(guò)程中定時(shí)取樣檢測(cè)低聚果糖的轉(zhuǎn)化率及黏度。

黏度測(cè)定：調(diào)節(jié)黏度計(jì)高度，使轉(zhuǎn)子逐漸浸入樣品中并穩(wěn)定3 min后開(kāi)始測(cè)量，當(dāng)2號(hào)轉(zhuǎn)子以100 r/min的轉(zhuǎn)速在液體中旋轉(zhuǎn)20圈后讀數(shù)，每個(gè)樣品測(cè)量3次。

1.3.4 不同反應(yīng)溫度對(duì)FOS轉(zhuǎn)化率的影響將溶解后的糖蜜水溶液在反應(yīng)溫度分別為40、45、50、55、60℃，pH 5.5的條件下，加入果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)合酶液（果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比為20∶1），反應(yīng)過(guò)程中定時(shí)取樣檢測(cè)。

1.3.5 不同反應(yīng)pH對(duì)FOS轉(zhuǎn)化率的影響將溶解后的糖蜜水溶液在反應(yīng)溫度為55℃，pH分別控制為4.5、5.0、5.5、6.0的條件下，加入果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)合酶液（果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比為20∶1），反應(yīng)過(guò)程中定時(shí)取樣檢測(cè)。

1.3.6 冷凍干燥將所得酶解液沸水浴滅酶10 min，F(xiàn)OS糖漿濃縮至80%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）后放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，調(diào)節(jié)真空冷凍干燥機(jī)的溫度為-60℃，干燥得到固體。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0進(jìn)行曲線擬合和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖蜜樣品成分分析

對(duì)糖蜜樣品的組成成分進(jìn)行分析（見(jiàn)表1）。糖蜜中總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.03 g/hg，其中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.29 g/hg，占總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的60.5%，與報(bào)道結(jié)果基本吻合[12]。

表1 糖蜜樣品成分分析Table 1 Composition analysis of molasses

2.2 復(fù)合酶液比例對(duì)FOS轉(zhuǎn)化率的影響

研究了果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的比例對(duì)FOS轉(zhuǎn)化率的影響。由圖1可知，果膠酶單獨(dú)使用時(shí)對(duì)糖的組成幾乎沒(méi)有影響，果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)配較單一使用果糖基轉(zhuǎn)移酶可以顯著提高FOS的轉(zhuǎn)化率，且反應(yīng)10 h后FOS轉(zhuǎn)化率基本保持平衡。當(dāng)果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比從10∶1增加到25∶1時(shí)，F(xiàn)OS的轉(zhuǎn)化率不斷增加，最高達(dá)41.5%。而果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比由20∶1增加到25∶1時(shí)，F(xiàn)OS的轉(zhuǎn)化率增加不明顯。因此，選用果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比為20∶1。袁偉崗[13]利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖時(shí)，當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在45%～65%時(shí)，F(xiàn)OS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)40%。而本文中底物僅含約25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的蔗糖即可達(dá)到相同的效果。

圖1 果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶不同添加比例對(duì)低聚果糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effects of different ratio of pectinase to FTase on recovery of FOS

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)FOS轉(zhuǎn)化率的影響

溫度過(guò)高會(huì)使維持酶蛋白空間構(gòu)象的次級(jí)鍵發(fā)生斷裂從而導(dǎo)致酶變性失活，溫度太低則導(dǎo)致酶的轉(zhuǎn)化率降低[14]。考慮到果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)溫度，研究了反應(yīng)溫度對(duì)FOS轉(zhuǎn)化率的影響。由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度從40℃升至55℃時(shí)，F(xiàn)OS的轉(zhuǎn)化率逐漸升高，最高達(dá)35%。而隨著溫度進(jìn)一步升高至60℃，F(xiàn)OS的轉(zhuǎn)化率有所下降。由此表明，酶反應(yīng)的最佳溫度為55℃。當(dāng)溫度低于55℃時(shí)，反應(yīng)速率受到影響，當(dāng)高于55℃時(shí)，由于酶的部分失活，產(chǎn)物的合成受到抑制，這也反映出酶的穩(wěn)定性與溫度呈一定的相關(guān)性[15]。Zhang[8]的研究結(jié)果表明，溫度對(duì)FOS的產(chǎn)量有顯著影響，發(fā)酵溫度為30℃時(shí)FOS產(chǎn)量達(dá)到最高，而升至35℃后，F(xiàn)OS的產(chǎn)量就下降了22%。

圖2 不同反應(yīng)溫度對(duì)低聚果糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effects of temperatures on recovery of FOS

2.4 反應(yīng)pH對(duì)FOS轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)液的pH會(huì)影響酶和底物帶電情況，從而影響酶和底物的解離和結(jié)合。因此，研究了酶反應(yīng)的pH對(duì)低聚果糖轉(zhuǎn)化率的影響，最終確定最適反應(yīng)pH。由圖3可知，pH<5.0時(shí)，過(guò)酸的反應(yīng)體系導(dǎo)致酶活力大幅度下降，因此FOS的轉(zhuǎn)化率也相應(yīng)降低。同時(shí)，pH為6.0的反應(yīng)環(huán)境對(duì)酶活力也有一定的影響，對(duì)生產(chǎn)高轉(zhuǎn)化率的FOS并無(wú)提高作用。因此，確定該反應(yīng)的最適宜pH為5.0～5.5，這與Mouelhi等[16]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖3 不同反應(yīng)p H對(duì)低聚果糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effects of p H on recovery of FOS

2.5 反應(yīng)過(guò)程中黏度變化

流體黏度是液體流動(dòng)時(shí)不同速度層分子間的動(dòng)量傳遞及分子間引力作用所產(chǎn)生的內(nèi)摩擦的表現(xiàn)，與流體內(nèi)部的微觀分子作用有關(guān)[17]。在反應(yīng)溫度55℃、pH 5.5的條件下，調(diào)節(jié)果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的體積比在最適條件下，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間下溶液黏度的變化。由圖4可知，在反應(yīng)初期，酶解液的黏度仍有2.9 mPa·s，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液的黏度下降較快，當(dāng)反應(yīng)8 h后，反應(yīng)體系黏度變化趨勢(shì)變緩，并趨于一個(gè)定值，其中一個(gè)原因是果膠酶的存在引起這一現(xiàn)象的發(fā)生[18]?？扇苄詷?shù)膠作為糖蜜的成分之一，由于兩者之間的相互結(jié)合，形成一種相對(duì)穩(wěn)定的可溶性狀態(tài)液體。果膠酶可以通過(guò)降解其中的果膠物質(zhì)破壞其混合膠體的結(jié)構(gòu)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇軤顟B(tài)，此時(shí)體系黏度則呈現(xiàn)較大幅度下降[19]。由反應(yīng)進(jìn)程可知，體系黏度的下降更易于酶反應(yīng)的進(jìn)行，傳質(zhì)狀況良好，使得反應(yīng)過(guò)程中酶解液中FOS轉(zhuǎn)化率上升。

圖4 不同時(shí)間下反應(yīng)體系黏度的變化曲線Fig.4 Viscosity curve of reaction system under different times

2.6 FOS固體粉末成分分析

在上述研究所得的最優(yōu)條件下反應(yīng)制備所得的酶反應(yīng)液，經(jīng)冷凍干燥后得到飼料級(jí)FOS固體粉末，并對(duì)其成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。與原樣品相比，經(jīng)過(guò)酶反應(yīng)后，蔗糖占總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低而低聚果糖占總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其他研究結(jié)果相似[20]。因此，所制備的FOS可以作為一種優(yōu)質(zhì)的無(wú)抗生素飼料資源。

表2 FOS固體粉末成分分析Table 2 Composition analysis of FOSsolid powder

3 結(jié)語(yǔ)

為了提高糖蜜的加工價(jià)值，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，作者利用果膠酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)合酶液，確定了酶解糖蜜生產(chǎn)FOS的最佳條件，并通過(guò)真空冷凍干燥制備低聚果糖固體粉末。該法的最優(yōu)反應(yīng)條件為果膠酶與果糖基轉(zhuǎn)移酶體積比為20∶1、反應(yīng)溫度55℃、pH 5.5、酶解時(shí)間10 h，F(xiàn)OS轉(zhuǎn)化率可達(dá)45%。干燥后的固態(tài)低聚果糖粉，比液態(tài)低聚果糖更利于運(yùn)輸，因而減少了運(yùn)輸成本，具有更廣泛的應(yīng)用范圍；該固態(tài)低聚果糖可以作為食品和飼料的添加劑，具有優(yōu)質(zhì)的加工性能，從而提高制糖工業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，為廢棄物的進(jìn)一步綜合利用提供較好的途徑，符合國(guó)家提倡的循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展理念。