李青，劉武軍，郭瀟佳，王倩，趙宗保

（1 中國科學院大連化學物理研究所生物技術研究部，遼寧 大連 116023；2 中國科學院大學，北京 100049）

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）及其還原性形式（NADH）是生命體中氧化還原反應的重要輔因子[1]。在自然界中，NAD有兩個異頭物，即β-NAD和α-NAD（圖1），其中與煙酰胺環(huán)N1位共價結合的異頭碳原子的絕對構型分別為R和S。因為β-NAD 是細胞內(nèi)的主導構型，而且大多數(shù)野生型NAD 依賴型酶偏好于β-NAD，因此除另有說明，文獻和本文中使用的NAD 都為β-NAD。通常NAD依賴型氧化還原酶以β-NAD 為輔因子時具有很高活性，而利用α-NAD 時幾乎檢測不到活性[2-4]。除氧化還原酶外，許多其他酶，包括聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARPs）、去乙酰化酶及環(huán)腺苷二磷酸核糖（cADPR）合成酶等，都以β-NAD 為底物完成其生物學功能[5-7]。α-NAD 被認為是β-NAD 的代謝副產(chǎn)物，可能導致細胞內(nèi)氧化還原輔因子通量的減少[8]。僅個別酶能識別α-NAD，腎胺酶抗體氧化異構化α-NADH為β-NAD[9]，腺苷二磷酸核糖受體水解酶降解α-NAD 為腺苷二磷酸核糖和煙酰胺[5,10]。因此，NAD 依賴型天然酶被認為已進化出可區(qū)別煙酰胺周圍立體構型的NAD結合口袋。

NAD 依賴型氧化還原酶廣泛應用于手性醇類和手性胺類化合物的高效制備。開發(fā)高效NAD 類似物降低NAD 使用成本一直是生物催化領域的研究熱點。許多結構簡單的合成NAD 類似物（圖1）已被制備并應用于多種氧化還原酶，以評價其作為氧化還原輔因子的潛力[11-20]，如1-甲基-3-氨甲酰基吡啶（MNA）用于硫辛酰胺脫氫酶[21]、1-苯乙基-3-氨甲?；拎ぃ≒2NA）用于葡萄糖脫氫酶[22]及研究最廣泛的1-芐基-3-氨甲?；拎ぃ˙NA）用于馬肝醇脫氫酶[23]、細胞色素P450 BM3 突變體（P450 BM3 R966D/W1046S）[24]、2-羥基聯(lián)苯3-單加氧酶[25]和烯醇還原酶[22,26-27]，但這些類似物中與煙酰胺N1 共價連接的碳原子（Cα）為非手性，而且其催化活性有待提高。此外，煙酰胺核糖（NAR）作為NAD 重要的前體物質(zhì)之一，NAR 類似物對于揭示NAR 在細胞生化過程中的作用及開發(fā)新型藥物具有重要意義[28]；在呋喃糖環(huán)或煙酰胺部分單原子取代的穩(wěn)定的NAD 類似物可作為NAD 消耗酶的抑制劑[17,29]；腺嘌呤部分取代的NAD類似物可作為熒光探針于實時監(jiān)測各種NAD 消耗酶[30]，腺嘌呤替換為胞嘧啶的NAD 類似物用于開發(fā)生物正交氧化還原體系[15,31]；但這些類似物中與煙酰胺N1共價連接的碳原子（Cα）立體化學與β-NAD 相同。因為酶的輔因子結合口袋被視為手性環(huán)境，因此探索酶對具有Cα立體化學的手性NAD 類似物的差異性識別以及設計特定手性中心的NAD 類似物具有積極的研究意義，也是不對稱生物催化工程的預期應用目標之一。

圖1 NAD及其類似物的結構

從P2NA的結構出發(fā)，在Cα位引入一個官能團來取代其中一個氫原子，非手性類似物P2NA可以轉(zhuǎn)化為手性化合物。當羧基被引入時，相應的NAD 類似物為α-氨基-3-苯丙酸（即苯丙氨酸，Phe）的煙酰胺化衍生物。因此，本文利用具有生物相容性并且易于建立Cα手性中心的光學純芳香族氨基酸作為手性源制備手性NAD 類似物。本研究以光學純α/β-氨基-3-苯丙酸為原料通過Zincke反應合成了兩對手性NAD 類似物對映異構，并應用于巨型芽孢桿菌來源的細胞色素P450 BM3 突變體（P450 BM3 R966D/W1046S）[24]和來源于硫化葉菌的葡萄糖脫氫酶突變體（SsGDH I192T/V306I）[22]兩種氧化還原酶。

1 材料和方法

1.1 材料

煙酰胺，ABCR公司；2,4-二硝基氯苯及D-苯丙氨酸（D-Phe），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇，天津大茂試劑廠；二氯甲烷，北京化工廠；L-苯丙氨酸（L-Phe），北京索萊寶科技有限公司；S-3-氨基-3-苯丙酸（3S-Phe）及R-3-氨基-3-苯丙酸（3R-Phe），薩恩化學技術（上海）有限公司；12-對硝基苯氧基十二烷酸（12-pNCA），成都卡麥爾醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器

核磁共振波譜儀（NMR），AVANCE III 400 MHz型，瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司；高分辨飛行時間質(zhì)譜（HRMS），Q-TOF 6540 型，美國Agilent 公司；旋光儀，MCP200型，奧地利Anton Paar公司；紫外分析儀，WD-9403F 型，北京市六一儀器廠；多功能微孔酶標儀，BIO-TEK Synergy H1型，美國BioTek Instruments公司。

1.3 NAD類似物的合成

1.3.1 1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲?；拎ぢ然}（Zincke鹽）的合成

將煙酰胺（2.44g，20mmol）和2,4-二硝基氯苯（12.15g，60mmol）加到25mL 圓底燒瓶中，加熱到90℃，反應2h，待反應冷卻至室溫，加入甲醇溶解，加入乙醚重結晶，重復3次后，得到黃色泡沫狀固體1-(2’,4’-二硝基苯基)-3-氨甲?；拎ぢ然}（5.38g, 82.9%）。1H NMR (400MHz, D2O)δ: 9.60 (s, 1H), 9.34 (d, J = 2.4Hz, 1H), 9.28 (d, J =6.4Hz, 1H), 9.21 (d, J = 8.4Hz, 1H), 8.88 (dd, J = 8.8,2.4Hz, 1H), 8.43 (dd, J = 8.4, 6.4Hz, 1H), 8.20 (d, J =8.8Hz, 1H)。13C NMR (101MHz, D2O) δ: 165.0, 149.8,147.5,147.3,145.6,142.7,138.3,134.2,131.1,130.7,128.6,122.8。

1.3.2 手性NAD類似物合成

手性NAD類似物合成方法見本文2.1節(jié)，具體步驟如下：分別向含有L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、S-3-氨基-3-苯丙酸或R-3-氨基-3-苯丙酸（1mmol）的2mL 甲醇溶液中，滴加含有Zincke 鹽（357mg，1.1mmol）的2mL 甲醇溶液，滴加完畢后，加入三乙胺1mmol，分別在反應0h、4h、9h 分3 次加入，室溫下攪拌24h 后，薄層色譜法（TLC）檢測（展開劑為二氯甲烷∶甲醇=3∶1，體積比）原料Zincke salt反應完全。過濾除去反應液中的不溶物，濾液減壓濃縮除溶劑，硅膠柱層析純化，二氯甲烷及甲醇梯度洗脫，洗脫劑梯度為二氯甲烷→二氯甲烷∶甲醇=10∶1→二氯甲烷∶甲醇=7∶1→二氯甲烷：甲醇=5∶1→二氯甲烷∶甲醇=3∶1→二氯甲烷：甲醇=2∶1→二氯甲烷∶甲醇=1∶1→甲醇，合并含NAD 類似物的洗脫液，減壓濃縮除溶劑，加水溶解并冷凍干燥，獲得橙色粉末狀固體。

L-PheNA,110mg，產(chǎn)率36.0%，1H NMR(400 MHz,D2O) δ∶9.06 (s, 1H), 8.88 (d, J = 6.4Hz, 1H), 8.77 (d,J = 8.0Hz, 1H), 8.04 (dd, J = 8.0, 6.4Hz, 1H), 7.30-7.15 (m, 3H), 7.07 (dd, J = 7.6, 1.8Hz, 2H), 5.58 (dd,J = 10.8, 4.8Hz, 1H), 3.83 (dd, J = 14.8, 4.8Hz, 1H),3.47 (dd, J = 14.8, 10.8Hz, 1H)。13C NMR (101MHz,D2O) δ: 171.1, 165.5, 146.64 144.5, 144.3, 135.2,133.2, 129.1, 128.7, 127.7, 127.6, 77.5, 38.9。HRMS:C15H15N2O3+計算值271.1077，檢測值271.1074.[α]20D=-5.50o。

D-PheNA,93mg，產(chǎn)率30.5%，1H NMR(400MHz,D2O) δ∶9.11 (s, 1H), 8.92 (d, J = 6.0Hz, 1H), 8.83 (d,J = 8.0Hz, 1H), 8.09 (dd, J = 8.0, 6.0Hz, 1H), 7.38–7.25 (m, 3H), 7.13 (dd, J = 7.2, 1.8Hz, 2H), 5.63 (dd,J = 11.2, 4.8Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 14.8, 4.8Hz, 1H),3.53(dd,J=14.8,11.2 Hz,1H)。13C NMR(101MHz,D2O)δ 171.1,165.6,146.6,144.4,144.2,135.2,133.3,129.2,128.7,127.8,127.6,77.5,39.0，HRMS:C15H15N2O3+計算值271.1077，檢測值271.1086。[α]20D=+5.50o。

3S-PheNA,202mg，產(chǎn)率66.0%，1H NMR(400MHz,D2O) δ∶9.39 (s, 1H), 9.15 (d, J = 6.0Hz, 1H), 8.87 (d,J = 8.0Hz, 1H), 8.17 (dd, J = 8.0, 6.4Hz, 1H), 7.69–7.44(m,5H),6.38(t,J=7.6Hz,1H),3.46(d,J=8.0Hz,2H)。13C NMR (101MHz, D2O) δ: 175.6, 165.7, 145.6,144.6,143.3,134.9,134.1,130.2,129.6,128.6,127.8,73.6,41.4。HRMS:C15H15N2O3+計算值271.1077,檢測值271.1085。[α]20D=-83.49o。

3R-PheNA，224mg，產(chǎn) 率73.2%，1H NMR(400MHz,D2O)δ:9.39(s,1H),9.15(d,J=6.0Hz,1H),8.87(d,J=8.0Hz,1H),8.17(t,J=6.8Hz,1H),7.65–7.44(m,5H),6.38(t,J=7.6Hz,1H),3.46(d,J=7.6Hz,2H)。13C NMR (101MHz, D2O) δ: 175.6, 165.7, 145.6,144.6,143.3,134.9,134.1,130.2,129.6,128.6,127.8,73.6, 41.4。HRMS: C15H15N2O3+計算值271.1077，檢測值271.1082。[α]20D=+73.99o。

1.3.3 NAD類似物BNA及其還原型BNAH的合成BNA及BNAH按參考文獻[27]方法合成。

1.4 手性NAD 類似物作為氧化還原輔酶的反應行為

1.4.1 氧化還原酶的表達純化

具有N 端組氨酸標簽的pET30a-P450 BM3 F87A 質(zhì)粒獲贈于中國科學院青島生物能源與過程技術研究所李盛英教授。利用定點突變技術引入P450 BM3雙位點突變R966D/W1046S，引物序列及蛋白表達純化同文獻報道[24]。SsGDH I192T/V306I基因是由中國蘇州泓迅生物科技公司合成，并插入在pET28a 質(zhì)粒的EcoR I 和Hind III 酶切位點之間，獲得具有N 端組氨酸標簽質(zhì)粒pET28a-SsGDH I192T/V306I，蛋白表達純化按照參考文獻[22]的方法進行。

1.4.2 P450 BM3 R966D/W1046S 利用手性NAD 類似物的活性及動力學

用Bio-Tek 酶標儀在25℃下測定P450 BM3 R966D/W1046S 對手性NAD 類似物的活性及動力學，反應體積100μL，每個樣品3 個平行。P450 BM3 R966D/W1046S消耗還原型輔因子，因此反應中應用的手性NAD 類似物、BNA 及NAD 為經(jīng)Na2S2O4原位還原的儲備液。原位還原輔因子的制備方法如下：將手性NAD類似物或BNA或NAD（10mmol/L）用四倍摩爾當量的Na2S2O4和Na2CO3在脫氧H2O 中還原30min，得到的溶液作為儲備溶液。

P450 BM3 R966D/W1046S 利用手性NAD 類似物的活性測定。體系如下：100mmol/L pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液，50μmol/L 12-pNCA、0.8μmol/L P450 BM3 R966D/W1046S，0.5mmol/L 手性NAD 類似物。分別以BNA 和NAD 為對照，以不添加輔因子樣品為陰性對照，以還原型BNAH和商品化NADH為陽性對照。記錄10min 內(nèi)410nm 處的吸光值的變化。標準曲線法測定對硝基酚在相應酶標儀測定條件的表觀消光系數(shù)為4.1L/mmol。一個酶活力單位為25℃下每分鐘產(chǎn)生1.0μmol對硝基苯酚的酶量。

P450 BM3 R966D/W1046S 對手性NAD 類似物的動力學測定。體系如下：100mmol/L pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液，50μmol/L 12-pNCA, 0.8μmol/L P450 BM3 R966D/W1046S，梯度濃度還原型輔因子。記錄10min 內(nèi)410nm 的吸光值的變化。每個濃度3 個平行實驗。測定結果用OriginPro 8.5.1 軟件對Michaelis-Menten 方程進行擬合。還原型輔因子的制備方法

1.4.3 手性NAD類似物作為SsGDH I192T/V306I的輔酶

用Bio-Tek酶標儀在45℃下測定手性NAD類似物在SsGDH I192T/V306I 中的活性，反應體積100μL，每個樣品3 個平行。反應體系如下：100mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，10mmol/L D-葡萄糖，0.1mg/mL SsGDH I192T/V306I， 2.0mmol/L 手 性NAD 類似物或BNA 或NAD。以不添加輔因子樣品為陰性對照。每個樣本重復3 次。記錄60min 內(nèi)NAD 類似物樣品在360nm 處（或NAD 樣品在340nm處）吸光值的變化。一個酶活力單位定義為在45℃下1min生成1μmol還原型輔因子的酶量。

2 結果與討論

2.1 手性NAD類似物的合成

Zincke反應是通過Zincke鹽與伯胺在正丁醇溶劑中加熱回流進行胺交換反應制備吡啶鹽類化合物的反應[32]，已被用于合成NAD[33]及其類似物[34-36]，并且保留原有的手性中心。本研究通過Zincke反應以光學純α/β-氨基-3-苯丙酸為原料合成兩對手性NAD 類似物對映異構體L/D-PheNA 和3S/3RPheNA（圖2）。因手性原料中含有羧基酸性基團，伯氨基已形成質(zhì)子化狀態(tài)，不利于氨基對Zincke鹽2 位的親和進攻，故研究選擇三乙胺（Et3N）作為堿催化劑抑制氨基質(zhì)子化，促進Zincke反應過程中的質(zhì)子傳遞，反應可進行完全。兩對手性NAD 類似物對映體具有十分相似的核磁共振結果。以LPheNA 為例，其氫譜中化學位移5.58 的dd 峰歸屬于手性Cα上的氫原子，因Cα立體構型及苯環(huán)的空間位阻導致與Cα相鄰亞甲基上的兩個氫原子相對于Cα氫原子的空間位置分別在Cα—C鍵的同側(cè)（化學位移3.47）和異側(cè)（化學位移3.83），其中同側(cè)氫原子與Cα氫原子的耦合常數(shù)為10.8Hz，異側(cè)氫原子與Cα氫原子的耦合常數(shù)較小為4.8Hz，而亞甲基的兩個非等位氫原子間的耦合常數(shù)為14.8Hz。對于3S/3R-PheNA，其Cα相鄰亞甲基相連基團為羧基，空間位阻較小，導致與Cα相鄰亞甲基的C—C單鍵可自由旋轉(zhuǎn)，該亞甲基上的兩個氫原子的核自旋環(huán)境相同，因此Cα氫（化學位移6.38）為三重峰而亞甲基氫（化學位移3.46）為雙峰。兩對對映異構體具有相反的旋光性且大小相近，進一步表明，類似物保留了手性氨基酸原料的立體化學。

圖2 手性NAD類似物對映體的合成

2.2 手性NAD類似物作為氧化還原輔酶的活性及動力學

2.2.1 P450 BM3 R966D/W1046S 利 用 手 性NAD 類似物的活性

為了確定氧化還原酶是否僅偏好一種手性NAD類似物對映體，選擇利用還原型BNA（BNAH）為輔因子來催化脂肪酸羥基化的P450 BM3 突變體P450 BM3 R966D/W1046S[24]。 P450 BM3 R966D/W1046S活性測定是利用經(jīng)Na2S2O4原位還原的手性NAD 類似物為輔因子，以12-pNCA 為模式底物進行的[37]。其中12-pNCA 被氧化為ω-氧十二烷酸和對硝基苯酚，對硝基苯酚在410nm處有吸收。以不添加輔因子樣品為陰性對照，以商品化β-NADH或合成的BNAH 為陽性對照，測定結果（圖3）表明P450 BM3 R966D/W1046S 對所有還原型輔因子都有活性，而對陰性對照無活性，表明酶活性的確是由原位還原的輔因子引起的，而不是的Na2S2O4自身。盡管P450 BM3 R966D/W1046S 對還原型手性NAD 類似物的活性比陽性對照的活性低，但重要的是，P450 BM3 R966D/W1046S對L-PheNAH和3S-PheNAH 的活性比其對映體的活性高得多，這表明P450 BM3 R966D/W1046S更偏好S構型的輔因子而不是R構型的輔因子。

圖3 P450 BM3 R966D/W1046S對還原型手性NAD類似物的活性

2.2.2 P450 BM3 R966D/W1046S 利 用 手 性NAD 類似物的動力學

測定P450 BM3 R966D/W1046S 對不同還原型輔因子的動力學，酶反應速率對輔因子濃度曲線為雙曲線且輔因子濃度和飽，表明P450 酶動力學曲線符合Michaelis-Menten 方程曲線（圖4）。手性NAD 類似物對映體之間的動力學曲線存在明顯差異，L-PheNAH 和3S-PheNAH 的最大反應速率vmax值均高于其對映體[圖4(a)]。P450 酶對原位還原的BNAH 和β-NADH 的動力學特征與P450 酶對陽性對照的合成BNAH和商品化β-NADH的動力學特征非常相似，具有基本相同的Vmax[圖4(b)]，以上結果證明利用原位還原輔因子測定動力學是可行的。

圖4 P450 BM3 R966D/W1046S對NADH及類似物的動力學曲線

P450 BM3 R966D/W1046S 對不同還原型輔因子的動力學具體數(shù)據(jù)見表1。P450 BM3 R966D/W1046S 對L-PheNAH 的Km值 是D-PheNAH 的37%，對L-PheNAH 的催化效率（Kcat/Km） 比DPheNAH 高3.4 倍，表明P450 BM3 R966D/W1046S對L-PheNAH 有更高的親和力和催化效率。相似地，與3R-PheNAH 相比，P450 酶對3S-PheNAH的催化效率提高了4.0 倍。需要注意的是，原位還原的BNAH 和β-NADH 的Km值高于陽性對照的合成BNAH和商品化NADH，這可能是由Na2S2O4還原反應的不完全性或副反應引起的[38]，因為酶標儀測定100μL體系中輔因子的摩爾消光系數(shù)，其中原位還原的BNAH 和NADH 的摩爾消光系數(shù)分別為0.70L/mmol 和0.71L/mmol， 均 低 于 合 成BNAH（1.73L/mmol）和商品化NADH（1.09L/mmol）；因此需要較高的原位還原輔因子濃度來達到最大反應速率，從而表現(xiàn)出較高Km值。然而，原位還原BNAH 和β-NADH 的Kcat值與它們的陽性對照物相同，表明P450 酶對相同還原輔因子的具有相同的內(nèi)在催化性能。綜上所述，P450 BM3 R966D/W1046S 更傾向于利用S-PheNAH 而不是RPheNAH，并且手性NAD類似物中Cα的立體構型對P450酶的活性有影響。

表1 P450 BM3 R966D/W1046S對NADH及類似物的動力學數(shù)據(jù)

值得注意的是，如果將β-NAD 煙酰胺環(huán)、Cα及Cα氫原子與NAD 類似物的對應結構保持在同一平面，3S-PheNA的羧基與β-NAD的Cα所在核糖環(huán)的2,3-位羥基同側(cè)，且同為極性基團。而如果將β-NAD的Cα所在核糖環(huán)的C4—O鍵斷裂使O連接在Cα上，并使其煙酰胺環(huán)、Cα及其氫原子與NAD 類似物的對應結構保持在同一平面，則β-NAD 中Cα上O 原子與L-PheNA 的羧基在平面同側(cè)，而β-NAD 中大位阻的腺嘌呤核糖二磷酸核糖基與LPheNA 的芐基位于平面另一側(cè)。因此手性NAD 類似物的立體構型及取代基極性等因素導致P450 BM3 R966D/W1046S偏好S-構型PheNAH。

2.2.3SsGDH I192T/V306I利用NAD類似物的活性

為測定其他氧化還原酶利用手性NAD 類似物的活性，SsGDH因其具有較松馳的輔因子特異性[22]被選擇。已報道SsGDH 可以利用簡單的NAD 類似物，而且突變體SsGDH I192T/V306I 對P2NA 具有較高的活性[22]。SsGDH I192T/V306I 對手性NAD 類似物測定結果見表2，SsGDH I192T/V306I 僅對BNA 和β-NAD 有活性，對手性NAD 類似物均無活性。因L/D-PheNA 和3R/3S-PheNA 可以用氫原子取代與Cα相連的羧基和羧基甲基簡化為P2NA 和BNA，酶活性結果表明羧基或羧基甲基的存在會對SsGDH I192T/V306I 輔因子結合袋的相互作用產(chǎn)生不利影響。此外實驗數(shù)據(jù)支持氧化還原酶的輔因子結合袋可能預先決定了手性環(huán)境，因此合成的手性NAD 類似物的立體化學是與酶蛋白形成有效分子間相互作用的重要因素。因此建議未來通過定向進化[39]等先進方法改造NAD 依賴的氧化還原酶以利用手性NAD類似物。

表2 SsGDH I192T/V306I對NADH及類似物的活性

3 結論

本文利用三乙胺為質(zhì)子傳遞促進劑，通過Zincke 鹽與光學純氨基酸在室溫下的胺交換反應，制備了兩對手性NAD 類似物非對映體。原位還原的手性NAD 類似物均可作為P450 BM3 R966D/W1046S 的輔因子參與P450 催化的氧化反應，但P450 酶更偏好于利用S 構型手性NAD 類似物而不是R 構型手性NAD 類似物。結果表明需要設計更多的手性NAD 類似物來提高對氧化還原酶的催化活性。