李志超 譚國(guó)慶 徐展望 薛海鵬**

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000)

甲狀腺功能亢進(jìn)是臨床常見(jiàn)內(nèi)分泌性疾病，甲狀腺功能亢進(jìn)癥引起骨量減少，增加骨折風(fēng)險(xiǎn)已得到公認(rèn)[1]。甲狀腺素主要通過(guò)作用下丘腦-垂體-甲狀腺軸實(shí)現(xiàn)對(duì)骨系統(tǒng)的內(nèi)分泌調(diào)控[2]。在骨骼發(fā)育成熟過(guò)程中，成骨細(xì)胞的骨形成及破骨細(xì)胞的骨吸收之間保持動(dòng)態(tài)平衡，普遍認(rèn)為甲狀腺功能亢進(jìn)癥時(shí)高水平的甲狀腺素會(huì)加快骨轉(zhuǎn)換速率，造成骨代謝紊亂，促進(jìn)骨吸收造成骨質(zhì)疏松[3]。應(yīng)用生物信息學(xué)整合甲狀腺功能亢進(jìn)及骨質(zhì)疏松的基因數(shù)據(jù)，不僅能較為科學(xué)的從分子層面闡述甲狀腺功能亢進(jìn)與骨質(zhì)疏松間的影響機(jī)制，而且也為藥物同時(shí)干預(yù)兩種疾病提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

分別以骨質(zhì)疏松及甲狀腺功能亢進(jìn)為關(guān)鍵詞在相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(Disgenet、TTD、OMIM、Drugbank、Genecards)中篩選相關(guān)靶點(diǎn)，其中Disgenet篩選評(píng)分≥0.3，Genecards篩選相關(guān)度≥5。將兩組基因通過(guò)uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成uniprot ID進(jìn)行去重整合，獲得已明確的疾病靶點(diǎn)。然后將兩組靶點(diǎn)映射取得韋恩圖，將得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)string數(shù)據(jù)庫(kù)制作靶點(diǎn)間相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)TSV格式導(dǎo)進(jìn)Cytoscape3.7.2，篩選節(jié)點(diǎn)連接度(degree)≥35的靶點(diǎn)制作核心靶點(diǎn)圖。通過(guò)基因功能注釋DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO(Gene Ontology)生物過(guò)程富集分析以及 KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析使基因信息可視化，分別將篩選出的前20個(gè)GO條目與KEGG條目，依據(jù)Omicshare云平臺(tái)制作高級(jí)氣泡圖。

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)基因庫(kù)搜索、轉(zhuǎn)換ID查重整合后共選出與骨質(zhì)疏松癥和甲狀腺功能亢進(jìn)相關(guān)基因875個(gè)和271個(gè)。映射出關(guān)鍵靶點(diǎn)99個(gè)，生成韋恩圖(見(jiàn)圖1)。經(jīng)string數(shù)據(jù)庫(kù)在0.4中信度下生成相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖2)，其中96個(gè)靶點(diǎn)之間有958條相互作用關(guān)系。以篩選節(jié)點(diǎn)連接度(degree)≥35篩選到核心靶點(diǎn)16個(gè)(如圖3)，所獲核心靶點(diǎn)均直接或間接影響甲狀腺功能亢進(jìn)與骨質(zhì)疏松。經(jīng)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得44項(xiàng)GO富集結(jié)果(P<0.05)及45條KEGG信號(hào)通路(P<0.05)，以P值升序排列，分別篩選出符合條件的20個(gè)生物過(guò)程和信號(hào)通路，并將其以氣泡圖的形式展現(xiàn)出來(lái)(見(jiàn)圖4、圖5)。通路下所含靶點(diǎn)分別見(jiàn)表1。

表1 KEGG通路下所含靶基因(前20條)

圖1 甲狀腺功能亢進(jìn)與骨質(zhì)疏松映射關(guān)鍵靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖(0.4中置信度)

圖3 核心靶點(diǎn)圖(核心靶點(diǎn)大小為degree大小)

圖4 GO富集分析氣泡圖(前20條)

圖5 KEGG通路分析氣泡圖(前20條)

3 討論

甲狀腺功能亢進(jìn)與骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，受多方面調(diào)控作用影響，作為兩種常見(jiàn)的臨床代謝性疾病，各自具有龐大的基因網(wǎng)絡(luò)，兩組基因網(wǎng)絡(luò)中又包含部分重合的基因信息。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)尋找到16個(gè)核心靶點(diǎn)，直接或間接調(diào)控兩種疾病進(jìn)程。INS(胰島素)及IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1)在糖代謝中具有重要作用，同時(shí)也影響骨質(zhì)疏松及甲狀腺功能亢進(jìn)的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，具有毒性作用；同時(shí)葡萄糖在7～25 mmol·L-1濃度時(shí)能夠調(diào)控破骨細(xì)胞維持最大化的骨吸收活動(dòng)[4-5]。甲狀腺功能亢進(jìn)癥患者往往因胰島β細(xì)胞代償性分泌增加、胰島素抵抗等原因伴有不同程度的糖代謝異常[6]。此外高葡萄糖同樣可增加TNF-α(腫瘤壞死因子α)、IL-6(白介素-6)的表達(dá)，降低礦物質(zhì)的質(zhì)量，并且TNF-α水平與患者骨量成反比[7]。TNF-α、IL-6作為炎癥細(xì)胞釋放的炎癥因子參與甲亢病情的進(jìn)展[8]。謝光云等通過(guò)對(duì)血清IL-6檢測(cè)后認(rèn)為其同樣參與甲亢的發(fā)生、發(fā)展，且對(duì)甲亢復(fù)發(fā)具有一定臨床意義[9]，IL-6又與TNF水平正相關(guān)，考慮其與甲亢性肝損害免疫功能失調(diào)有關(guān)[10]。研究顯示糖尿病患者ALB(血清白蛋白)水平較低，并可能是糖尿病與骨質(zhì)疏松的標(biāo)志物[11]；甲亢患者血清ALB值也明顯低于對(duì)照組，其原因在于高水平甲狀腺激素降低了肝細(xì)胞合成ALB速率[12]。綜上所述諸多核心靶點(diǎn)相互影響，協(xié)同作用于兩種疾病，甲亢與骨質(zhì)疏松間影響機(jī)制可能在于影響體內(nèi)糖代謝水平及肝細(xì)胞生物功能，進(jìn)而引起體內(nèi)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。

通過(guò)生物功能富集分析顯示出關(guān)鍵生物過(guò)程在于對(duì)各種生物因子的調(diào)控作用，因此細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用通路顯得尤為重要，通過(guò)調(diào)控生物因子及其受體作用于多條通路發(fā)揮生理功能。Jak-STAT通路作為細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一在骨的發(fā)育及代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，研究顯示IL-6可通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)破壞骨細(xì)胞分化[13]。有數(shù)據(jù)表明通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路同樣可參與促甲狀腺激素的信號(hào)傳導(dǎo)[14]，同時(shí)多項(xiàng)研究認(rèn)為JAK/STAT信號(hào)通路與甲狀腺癌關(guān)系密切。PI3K/Akt作為經(jīng)典的骨代謝通路，通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和骨形成而參與骨質(zhì)疏松的抑制[15]。研究發(fā)現(xiàn)甲亢大鼠PI3K和p-Akt表達(dá)高于正常大鼠[16]，張潔等研究認(rèn)為雷公藤可能通過(guò)此通路來(lái)改善小鼠甲狀腺功能，降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平[17]。HIF-1除能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞外[18]，還能調(diào)節(jié)組織、細(xì)胞適應(yīng)低氧或缺氧環(huán)境，有研究顯示缺氧對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的骨形成能力起到抑制作用[19]。甲亢患者血中HIF-1α也與體內(nèi)甲狀腺素水平正相關(guān)，影響甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展[20]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為IBD是骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，甚至認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥是其最為嚴(yán)重的并發(fā)癥，其作用機(jī)制可能在于IBD患者高水平IL-6、TNF-α,破壞了骨的平衡代謝[21]，而IL-6、TNF-α介導(dǎo)的炎癥性和自身免疫反應(yīng)被認(rèn)為是IBD與甲亢之間的影響機(jī)制[22]。

作為兩種臨床常見(jiàn)內(nèi)分泌疾病必然有著密切聯(lián)系，諸多細(xì)胞因子直接或間接通過(guò)多條通路調(diào)節(jié)體內(nèi)各種激素水平、炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)很少有學(xué)者研究通路同時(shí)對(duì)甲亢及骨質(zhì)疏松產(chǎn)生的影響。本研究依據(jù)生物信息學(xué)找到甲亢與骨質(zhì)疏松相關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)，并通過(guò)基因可視化，使網(wǎng)絡(luò)樣作用關(guān)系愈加清晰，當(dāng)然具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步臨床觀察及試驗(yàn)驗(yàn)證。