冷旭，潘伯臣，孫陸

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院生殖中心男科，沈陽 110004）

Y染色體Yq11區(qū)無精子癥因子（azoospermia factor，AZF）是男性精子生成的決定性基因，2013年歐洲男科學會和歐洲分子遺傳學質量網(wǎng)絡聯(lián)合制定的Y染色體微缺失診斷指南中，建議無精子癥或精子濃度＜2×106/mL的嚴重少精子癥患者行微缺失檢測，并推薦三區(qū)的微缺失診斷，即AZFa、AZFb和AZFc，對應引物組sY84、sY86、sY127、sY134、sY254和sY255，該引物組可滿足常規(guī)診斷。但臨床實際工作中，各實驗室開展的Y染色體微缺失檢測位點卻不盡相同，我院所行微缺失檢測包括AZFa、AZFb、AZFc及AZFd 4個區(qū)域12個位點，本研究擬針對這些位點探討男性不育患者Y染色體微缺失的種類及其與精子檢測結果之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料：對2018年1月1日至2019年12月31日期間于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院就診的3 720例男性不育患者（均來自于遼寧、吉林、黑龍江地區(qū)）行AZF檢測。納入標準為精子濃度＜5×106/mL的嚴重少精子癥或頑固型少弱精子癥，藥物治療未見好轉。采用真空采血管采集患者靜脈全血2 mL（EDTA抗凝）。

1.1.2 試劑與儀器：Y染色體微缺失檢測試劑盒由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院遺傳研究室專門定制提供。耐熱 DNA 聚合酶（Taq酶，美國Life公司）；4種核苷酸單體（dNTPs，美國Life公司）；Roche Light-Cycler 480 Ⅱ（瑞士羅氏診斷公司）；ABI Prism 7500（美國Life公司）；Bio-Rad CFX96 熒光定量 PCR 儀（美國伯樂公司）。

1.2 方法

采用實時熒光PCR方法檢測Y染色體微缺失。檢測試劑盒由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院遺傳研究室專門定制提供，以Y染色體AZF區(qū)的12個基因位點（sY84、sY86、sY127、sY134、sY143、sY157、sY239、sY242、sY254、sY255、sY145、sY152）為靶序列，設計特異性引物及熒光探針，采用PCR及熒光標記探針技術，對每個待檢樣本進行4個三重 PCR 反應，快速檢測樣本中Y染色體AZF區(qū)12個位點是否存在缺失。Y染色體AZF區(qū)域內的12個序列標簽位點具體分類如 下：AZFa區(qū)（sY84、sY86），AZFb區(qū)（sY127、sY134、sY143），AZFc區(qū)（sY157、sY239、sY242、sY254、sY255），AZFd區(qū)（sY145、sY152）。

2 結果

本研究中，共有3 720例不育患者接受AZF微缺失檢測，檢測出Y染色體有微缺失者165例，檢出率4.43%，符合歐洲指南的解讀。我院檢測的AZFa、AZFb、AZFc以及AZFd 4個區(qū)域共對應8種缺失模式：AZFabcd、AZFa、AZFb、AZFbcd、AZFbcd（部分b，即b只缺失1個位點sY143，其余位點存在）、AZFcd、AZFc（部分c）和 AZFd。AZF微缺失構成比：AZFabcd 5.45%，AZFa 5.45%，AZFb 6.67%，AZFbcd 16.98%，AZFc 60.00%，AZFd 5.45%。其中，AZFc部分或全部缺失及AZFd部分或全部缺失的患者最多，共108例，約占總缺失數(shù)的2/3，且這些患者中約2/3正常手淫取精檢測即可見精子。見表1。

表1 AZF各位點缺失例數(shù)及占比Tab.1 The number and proportion in different types of AZF microdeletion

精子數(shù)量分析結果顯示，AZFc及AZFd是全部缺失還是部分缺失意義并不大，均可有精子的存在。AZFd缺失有精子者平均精子數(shù)量［（4.36±7.74）×106］高于AZFc缺失者［（16.79±20.94）×106］，因此，AZFd缺失對男性不育的影響相對更小。有精子存在的微缺失患者中，有1/10（11/110）是隱匿性無精子癥患者，即常規(guī)檢測未見精子，在精液離心后才找到極少量精子。見表2。

表2 有精子存在的微缺失患者的精子數(shù)量分析Tab.2 The number and sperm count of AZF microdeletion patients who have sperm

3 討論

Y染色體微缺失是僅次于Klinefelter綜合征的男性不育第二位常見遺傳病因。在過去的20余年中，Y染色體微缺失的分子診斷已成為男性不育癥診斷中的一項重要檢測內容。普通人群中，約有1/4 000的人發(fā)生Y染色體微缺失，但在不育男性中微缺失的頻率顯著增加［1］。Y染色體從1對常染色體進化而來，積累了包括SRY和其他精子發(fā)生相關基因在內的雄性特異性基因。Y染色體的結構與常染色體不同，它由多個基因拷貝、DNA序列和單倍型多態(tài)性組成，在其進化過程中發(fā)生了許多基因重排。歐洲指南推薦的多重PCR反應中使用的PCR引物組是診斷AZFa、AZFb和AZFc區(qū)微缺失的最佳選擇，即a（sY84、sY86），b（sY127、sY134），c（sY254和sY255），該引物組可滿足常規(guī)診斷，能夠檢測3個AZF區(qū)域中幾乎所有的臨床相關的缺失和95%以上的缺失，指南推薦實驗室盡量使用該組引物，統(tǒng)一實驗標準，避免過多或者過少的引物檢測，并且可以比較各個實驗室的性能和實驗室的變異性。

無精子癥男性的微缺失發(fā)生率高于少精子癥男性，不同實驗室發(fā)現(xiàn)的缺失頻率在2%～10%之間［1］。本研究發(fā)現(xiàn)，AZFc缺失是最常見的Y染色體微缺失，且約2/3 的AZFc缺失患者有精子存在，因此，對于AZFc及AZFd缺失的患者更應不放棄希望，積極鼓勵其治療并生育具有自己血緣關系的子代，但需要進行遺傳咨詢。患者如要求避免將缺失傳遞給下一代，建議行三代試管（胚胎植入前的染色體診斷）生育女性子代。有文獻［2］報道，由于c缺失中有部分人群精子并未受到影響，可以正常生育，但極有可能在生育下一代男孩的過程中出現(xiàn)更多位點的缺失。

本研究中，包含AZFa區(qū)主要位點（sY84、sY86）或包含AZFb區(qū)主要位點（sY127、sY134）微缺失的患者無一例有精子，這完全符合2013年歐洲指南的解讀。AZFa區(qū)長度僅有1 100 kb，完全缺失AZFa區(qū)會缺失大約792 kb，這僅有的極小的片段缺失會導致絕對的無精子。AZFa區(qū)包含單拷貝基因USP9Y（前身為DFFRY）和DDX3Y（前身為DBY），這是僅有的2個基因。編碼RNA解旋酶DDX3Y的基因位于Y染色體的AZFa區(qū)域，僅在雄性生殖細胞中表達，包含DDX3Y基因的缺失會導致無精癥，并導致人類唯支持細胞綜合征（sertoli cell only syndrome，SCOS）。SCOS的特征是缺少完整的生殖細胞，但保留了體細胞的支持細胞，屬于絕對的無精子癥［3］。因此，此二類患者行藥物生精治療和顯微取精手術前需要得到患者的充分知情同意，以決定是否仍堅持該治療及手術。AZFa部分缺失的病例極為罕見，我國曾有1例關于a部分缺失（缺失位點sY86）有精子存在的個例報道［4］，精子濃度為68×106/mL，前向運動精子百分率為40%，有待于進一步的求證和復核。

AZFb區(qū)的完全位點缺失會導致生精阻滯在初級精母細胞階段，從而無法產生精子。本研究中，包含sY127、sY134位點缺失的37例患者中，無一例存在精子。有2例患者為部分b+cd缺失，只有極少量精子存在，因為其b區(qū)只有1個位點sY143缺失，主要位點sY127、sY134（歐洲指南指定檢測位點）均存在，精子數(shù)量分別為4（隱匿性無精子，經(jīng)離心后可見）及0.13×106。

在AZF的分區(qū)中，只有AZFa區(qū)是獨立的，AZFb區(qū)與AZFc區(qū)有約1.5 Mb的重疊，因而關于這些重疊區(qū)域應該劃分為b區(qū)還是c區(qū)常存在爭議解讀［5］。部分缺失會偶有存在精子的病例報道，完全缺失則不會。AZFb的完全缺失會去除6.2 Mb區(qū)域（包括32個基因和轉錄單位的拷貝），并且是回文P5/近端P1之間同源重組的結果。AZFc缺失區(qū)可去除3.5 Mb區(qū)域（包括12個基因和轉錄單位，每個基因和轉錄單位的拷貝數(shù)可變，共32個拷貝），分別來自回文P3和P1中擴增子b2和b4的同源重組，并去除21個基因拷貝和轉錄單位［6］。

AZF微缺失區(qū)間是由大的同源重復序列塊之間的染色體內重組事件引起的。在同一Y區(qū)域，在可育男性中可觀察到較大的基因組異質性，只有完整的AZFa和AZFb缺失與特定的睪丸病理相關。AZFc的部分缺失甚至對男性生育力沒有影響。這表明AZFb和AZFc中多拷貝基因的遺傳冗余以及Yq11重復結構中出現(xiàn)的首個微缺失與大缺失之間的因果關系，其中大回文可能促進多個基因轉換和AZF重排［7］。有研究［8］將Y染色體上的AZFc區(qū)基因族分組，命名為無精子癥缺失基因（deleted in azoospermia，DAZ），包括DAZ1、DAZ2、DAZ3和DAZ4等4個家族成員，很多正常生育的男性和不育的男性患者中均可存在gr/gr-DAZ1/DAZ2、DAZ3/DAZ4缺失，所以DAZ只是可能導致男性不育的危險因子之一，而不能作為一個直接的致病遺傳因素，該分類在臨床工作中并不常用。

本研究中，AZFd區(qū) 的sY145、sY152位點缺失患者占總檢測例數(shù)的0.24%，在微缺失類別中占5.45%，比例很低，且89%有精子，精子數(shù)量介于0～60×106之間，存在男性不育的可能。但是否進行AZFd缺失檢測存在爭議，如不進行該位點檢測，缺失將被強制傳播給雄性后代，在下一代中，部分缺失有可能擴展為完全的缺失從而影響生育，持有異議者認為標記物數(shù)量過多的新方法和試劑盒不會提高測試的靈敏度，甚至會使結果的解釋復雜化，因而不建議使用［1］。

近期有學者發(fā)現(xiàn)AZF基因（主要是AZFa和AZFb基因座中的基因）在多種組織中廣泛表達，并預測這些基因將在基因調控和蛋白質合成等過程中發(fā)揮作用。部分研究結果表明，AZF基因可能具有超出生育力調節(jié)的功能：（1）使用具有Y染色體微缺失的男性精子輔助繁殖時，會產生劣質的胚胎；（2）AZF基因缺失的男性中觀察到較高的神經(jīng)精神病學障礙；（3）AZF基因的拷貝數(shù)變異和在幾種癌癥中發(fā)現(xiàn)了AZF基因表達的改變［8］，有待于進一步發(fā)現(xiàn)和驗證。

總之，AZFc缺失是最常見的Y染色體微缺失，約2/3的AZFc缺失患者自然狀態(tài)下就有精子存在，經(jīng)過治療后有可能找到更多精子。各個檢測機構在AZF檢測時需要包括歐洲指南指定位點，其余位點可以適度增加（比如AZFd缺失的位點sY145、sY152），但不應過度解讀，需要結合精子數(shù)量的實際情況分析。建議適當擴大檢測指征，而并非只對嚴重少弱精患者進行AZF微缺失檢測。值得注意的是，某些非常規(guī)檢測位點缺失將被強制傳播給雄性后代，在下一代中，部分缺失有可能擴展為完全的缺失而影響生育。