張修威，袁婷婷，牛猛，張賓佳，賈才華，許燕， 趙思明

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

隨著人們生活水平的不斷提高和日常攝入高脂飲食比例的增加，肥胖人群所占的比例逐漸增大，與其相關(guān)疾病的發(fā)病率也在隨之升高[1]。肥胖被普遍認(rèn)為是心血管疾病、高血脂等病癥的主要誘發(fā)因素[2]。脂肪攝入與吸收量和脂肪酶活性是影響脂質(zhì)代謝的重要因素。前期研究表明[3]，減少脂肪吸收量與抑制脂肪酶活性是干預(yù)和預(yù)防肥胖的重要途徑。食物組分通過結(jié)合體內(nèi)膽酸鹽能夠促進(jìn)血液中膽固醇的代謝，從而起到控制血脂水平的作用；抑制脂肪酶的活性可以減少食物中甘油三酯的水解從而降低膽固醇的產(chǎn)生，達(dá)到控制血脂的目的。

阿拉伯木聚糖(arabinoxylan，AX)是一種廣泛存在于谷物中的多糖，是谷物細(xì)胞壁的重要組成部分。小麥?zhǔn)俏覈闹饕r(nóng)作物之一，每年小麥加工所產(chǎn)生的副產(chǎn)品中麥麩占了絕大部分[4]。麥麩中AX的含量可達(dá)25%左右[5]。根據(jù)AX溶解性的不同可分為水溶性AX(water-extractable arabinoxylan，WEAX)和水不溶性AX(water-unextractable arabinoxylan，WUAX)。在小麥中，WEAX占AX總量的25%～30%，具有高黏性。剩余的AX為WUAX，具有較高的持水能力[6]。AX作為一種重要的膳食纖維，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、控制血糖水平、降血脂[7]、調(diào)節(jié)代謝、抗氧化活性[8]等生理功能。

已有研究[9-12]表眀，麥麩AX具有調(diào)節(jié)血脂代謝的作用，補(bǔ)充AX可以改善餐后血脂水平和降低體內(nèi)總膽固醇水平、抵消高脂飲食引起的腸道環(huán)境紊亂、預(yù)防肥胖癥狀和減輕體質(zhì)量。目前關(guān)于AX調(diào)節(jié)血脂代謝的機(jī)制尚不明確，對不同類型的AX如WUAX和WEAX降脂活性的研究鮮見報(bào)道。本研究以小麥麥麩WUAX和WEAX為研究對象，探究2種AX的膽酸鹽結(jié)合力和胰脂肪酶抑制活性，闡釋AX結(jié)構(gòu)對其降脂作用的影響，為植物多糖調(diào)節(jié)血脂代謝機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全麥粉，購于河南省大程糧油集團(tuán)股份有限公司；牛磺膽酸鈉(sodium taurocholate hydrate，STC)、甘氨膽酸鈉鹽(sodium glycocholate hydrate，SGC)、胰脂肪酶(豬)(9001-62-1，30 000 U/g)、堿性蛋白酶(9014-01-1，200 U/mg)和高溫α-淀粉酶(9001-19-8，20 000 U/mL)均購于上海源葉生物科技有限公司；淀粉葡萄糖苷酶(9032-08-0，70 U/mg)購于阿拉丁生化科技股份有限公司；地衣聚糖酶(N/A，5 000 U/mL)購于愛爾蘭Megazyme公司。以上試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4恒溫水浴鍋，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器，BSA124S分析天平，SF-TDL-5A離心機(jī)，F(xiàn)D-1-50冷凍干燥機(jī)，722N可見-分光光度計(jì)，Thermo Multiskan Go全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.3 WEAX和WUAX的提取

1)粗AX提取。將全麥粉過篩(孔徑0.15 mm)得到麥麩，將麥麩在4 ℃下用蒸餾水浸泡1 h，隨后將濕潤的麥麩用蒸餾水洗滌多次，進(jìn)一步去除殘留的小麥粉。將洗滌后的濕麥麩置于50 ℃烘箱12 h，稱取烘干的麥麩150 g與2.25 L 0.15 mol/L NaOH溶液(包括0.5% H2O2)在80 ℃下反應(yīng)90 min后離心(4 000 r/min，30 min),將上清液調(diào)整至pH值為4.5后同樣條件再次離心。蒸發(fā)濃縮上清液至原體積的1/4左右后使用乙醇沉淀(乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為65%)，離心(4 000 r/min，30 min)后得到上清液。

2)WUAX提取。在上清液中加入堿性蛋白酶以去除蛋白，40 ℃水浴40 min，然后煮沸滅酶，使用透析袋(孔徑0.1 nm)將上清液用去離子水透析72 h，冷凍干燥得到WUAX。

3)WEAX提取。在上清液加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4 ∶ 1，V/V)至所占比例為20%，劇烈振蕩1 h，離心收集水層，重復(fù)5～6次。然后將水層冷凍干燥得到粗多糖，將其溶于去離子水，加入高溫α-淀粉酶，95 ℃水浴反應(yīng)2 h，煮沸15 min滅活后冷卻至室溫，再加入淀粉葡萄糖苷酶，在55 ℃下反應(yīng)4 h，煮沸30 min，使酶失活后，離心(4 000 r/min，15 min)，使用透析袋(孔徑0.1 nm)將上清液用去離子水透析36 h，冷凍干燥得到一次酶解多糖。將一次酶解多糖配制成1 L質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的溶液，加入地衣聚糖酶，40 ℃水浴反應(yīng)1 h；煮沸10 min滅酶后，離心(4 000 r/min，30 min)，上清液經(jīng)過透析袋(孔徑0.1 nm)透析36 h，冷凍干燥最終得到WEAX[13]。

1.4 膽酸鹽結(jié)合力測定

1)膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考周小理等[14]的研究方法并稍做改動(dòng)，分別移取0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL的1 mmol/L STC和SGC標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL的具塞試管中，在620 nm波長處測定膽酸鹽溶液吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由圖1可知，STC的標(biāo)準(zhǔn)曲線是y=0.73949x+0.00123，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 66，SGC的標(biāo)準(zhǔn)曲線是y=0.70016x+0.03825，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 84，二者均具有良好線性關(guān)系。

圖1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of cholate

2)WUAX和WEAX膽酸鹽結(jié)合率的測定。分別稱取250、375、500、625、750 mg WEAX和WUAX置于50 mL的具塞試管中，加入5 mL的蒸餾水，放入37 ℃的搖床中，振蕩1 h充分混勻，加入10 mL的1 mmol/L的STC和SGC溶液，振蕩混勻，37 ℃下水浴1 h，離心(4 000 r/min，30 min)，收集上清液。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未吸附膽酸鹽的含量，從而得到膽酸鹽結(jié)合率。

3)反應(yīng)時(shí)間對膽酸鹽結(jié)合量的影響。反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為20、30、40、60、90和120 min，稱取500 mg的AX，按照本文“1.4 2)”的步驟測定未吸附膽酸鹽的含量，根據(jù)膽酸鹽結(jié)合率的高低，得出最佳反應(yīng)時(shí)間。

4)AX添加量對膽酸鹽結(jié)合量的影響。分別稱取250、375、500、625、750 mg的AX，依照本文“1.4 3)”得出的最佳反應(yīng)時(shí)間，再按照本文“1.4 2)”的步驟測定未吸附膽酸鹽的量，根據(jù)膽酸鹽結(jié)合量的大小，得出最適AX添加量。

5)膽酸鹽的等溫吸附曲線。根據(jù)之前試驗(yàn)結(jié)果分別得出最佳反應(yīng)時(shí)間和最適AX添加量，分別加入濃度為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mmol/L的膽酸鹽溶液，按照本文“1.4 2)”的步驟計(jì)算膽酸鹽結(jié)合量，繪制等溫吸附曲線。

對于吸附等溫線用Freundlich方程進(jìn)行擬合作圖，公式(1)如下：

(1)

式(1)中，Qe為平衡結(jié)合量，mg/g；Ce為平衡濃度；n為特征常數(shù)；Kf為平衡吸附常數(shù)。

1.5 胰脂肪酶活性抑制率測定方法

根據(jù)黃琳翔等[15]的方法，配制Tris-HCl緩沖液、胰脂肪酶溶液和4-硝基苯棕櫚酸酯(PNPP)溶液。向96孔板中加入胰脂肪酶和緩沖液或AX樣品，37 ℃下反應(yīng)30 min，添加PNPP,37 ℃下反應(yīng)5 min，采用酶標(biāo)儀每隔1 min測定1次吸光度，共測定20次。繪制“吸光度-時(shí)間”曲線，曲線的斜率即抑制胰脂肪酶的反應(yīng)速率，胰脂肪酶抑制率計(jì)算公式如下：

(2)

式(2)中，K0為空白組的斜率,K1為樣品組的斜率。

1)WUAX和WEAX對胰脂肪酶抑制率測定。分別選取質(zhì)量濃度為5、10、20、30、40 mg/mL的WUAX和WEAX，PNPP溶液的質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，胰脂肪酶的質(zhì)量濃度為100 mg/mL按照表1的添加量和順序加入到96孔板，在37 ℃下反應(yīng)30 min，每隔1 min測定1次吸光度，共測20次，每個(gè)編號每種質(zhì)量濃度均做3次平行。

表1 各物質(zhì)添加量 Table 1 Addition amount of each substance

2)AX對胰脂肪酶的抑制可逆性分析。設(shè)置胰脂肪酶的質(zhì)量濃度分別為50、75、100、125、150 mg/mL，AX質(zhì)量濃度設(shè)定為5、30 mg/mL，按照本文“1.5 1)”的步驟測定反應(yīng)速率，繪制胰脂肪酶反應(yīng)速率-胰脂肪酶質(zhì)量濃度曲線及擬合方程。

3)AX對胰脂肪酶的抑制作用類型分析。PNPP的質(zhì)量濃度分別設(shè)置為1.25、2.50、3.75、5.00 mg/mL，AX質(zhì)量濃度設(shè)定為5、30 mg/mL。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程繪制曲線并擬合，從而得到胰脂肪酶抑制類型，公式如下：

(3)

式(3)中，v為胰脂肪酶酶反應(yīng)速率，A/min；vmax為最大反應(yīng)速率，1/min；Km表示米氏常數(shù)；[I]為AX質(zhì)量濃度，mg/mL；[S]為PNPP質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有指標(biāo)的測試平行實(shí)驗(yàn)不少于3次，使用SPSS 22.0計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，通過單因素方差分析和多重比較對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P<0.05時(shí)判定數(shù)據(jù)間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AX體外膽酸鹽結(jié)合力分析

1)WUAX與WEAX的膽酸鹽結(jié)合率。由圖2可看出，WEAX對STC和SGC的結(jié)合率低于15%。當(dāng)WEAX質(zhì)量濃度低于100 mg/mL時(shí)，結(jié)合率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，且具有顯著性差異(P<0.05)；當(dāng)WEAX質(zhì)量濃度高于100 mg/mL時(shí)，結(jié)合率變化趨于平緩，無顯著性差異(P>0.05)。WUAX對STC和SGC的結(jié)合率顯著高于WEAX，結(jié)合率隨著WUAX質(zhì)量濃度增加而增大，具有顯著性差異(P<0.05)，當(dāng)WUAX質(zhì)量濃度為150 mg/mL時(shí)，對STC和SGC的結(jié)合率分別達(dá)到52.87%和38.30%。

同一曲線中不同字母表示具有顯著性差異，P<0.05，n=3，下同。Different letters in the same curve indicate significant differences,P<0.05,n=3,the same as below.

2)WUAX對膽酸鹽的吸附動(dòng)力學(xué)分析。由圖3所示，在0～40 min內(nèi)WUAX對STC的結(jié)合率隨反應(yīng)時(shí)間延長而增加，具有顯著性差異(P<0.05)，在40 min后結(jié)合率變化趨勢無顯著性變化(P>0.05)。在0～90 min內(nèi)，WUAX對SGC的結(jié)合率隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增加，具有顯著差異(P<0.05)，在90 min后，結(jié)合率變化趨于平緩。在40 min時(shí)，WUAX對STC的結(jié)合率為49.50%。在 90 min時(shí)，WUAX對SGC的結(jié)合率為32.33%。

圖3 WUAX對膽酸鹽的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Adsorption kinetics of WUAX to cholate

3)WUAX添加量對膽酸鹽結(jié)合量的影響。分別選取40 min和90 min為WUAX對STC和SGC的結(jié)合時(shí)間，進(jìn)行膽酸鹽結(jié)合量測定。由圖4可知，當(dāng)WUAX添加量低于375 mg時(shí)，對膽酸鹽的結(jié)合量隨其添加量的增加而增加，當(dāng)WUAX添加量高于375 mg時(shí)，膽酸鹽的結(jié)合量呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)WUAX添加量為375 mg時(shí)，對STC和SGC的結(jié)合量最大，分別為6.12、3.45 mg/g。

圖4 WUAX添加量對膽酸鹽結(jié)合量的影響Fig.4 Effect of WUAX supplemental level on cholate binding amount

4)WUAX對膽酸鹽的等溫吸附曲線及擬合方程分析。選取WUAX添加量為375 mg進(jìn)行膽酸鹽等溫吸附曲線測定。由圖5可知，隨著膽酸鹽濃度的升高，WUAX對膽酸鹽的結(jié)合量逐漸增加，結(jié)合速率呈先增加后減緩的趨勢。WUAX對STC的結(jié)合量高于SGC。

圖5 WUAX對膽酸鹽等溫吸附曲線Fig.5 Isothermal adsorption curve of WUAX for cholate

如圖6所示，WUAX結(jié)合STC的擬合方程為lnQe=0.51lnCe+1.7567，結(jié)合SGC的擬合方程為lnQe=1.31lnCe+0.9883。

圖6 WUAX對膽酸鹽的等溫吸附擬合曲線Fig.6 Isothermal adsorption fitting curve of WUAX for cholate

2.2 AX體外抑制胰脂肪酶活性評價(jià)

1)WEAX和WUAX對胰脂肪酶活性的抑制。由圖7可知，當(dāng)WUAX質(zhì)量濃度大于5 mg/mL時(shí)，對胰脂肪酶的抑制率變化趨于平緩，無顯著性差異(P>0.05)，當(dāng) WUAX質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，抑制率為18.30%。WEAX對胰脂肪酶的抑制率隨著質(zhì)量濃度增加而增加，具有顯著性差異(P<0.05)，當(dāng)WEAX質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，對胰脂肪酶抑制率為35.66%。WEAX對胰脂肪酶的抑制能力高于WUAX。

圖7 WUAX和WEAX對胰脂肪酶的抑制率Fig.7 Pancreatic lipase inhibition rates of WUAX and WEAX

如圖8所示，當(dāng)WEAX質(zhì)量濃度低于30 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，其對胰脂肪酶的抑制率也隨之增加。當(dāng)WEAX的質(zhì)量濃度高于30 mg/mL時(shí)，其對胰脂肪酶的抑制率變化趨于平緩。當(dāng)WEAX質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，對胰脂肪酶的抑制率達(dá)35.93%。

圖8 WEAX質(zhì)量濃度對胰脂肪酶的抑制率Fig.8 Inhibition rate of pancreatic lipaseby WEAX concentration

2)WEAX對胰脂肪酶抑制可逆性分析。由圖9可知，WEAX質(zhì)量濃度在5 mg/mL和30 mg/mL時(shí)，擬合曲線交于原點(diǎn)，故WEAX對胰脂肪酶的抑制是可逆性抑制，隨著WEAX質(zhì)量濃度的增加，其斜率降低，并且反應(yīng)速率曲線都通過坐標(biāo)原點(diǎn)。

圖9 WEAX對胰脂肪酶抑制的可逆性Fig.9 Reversibility of pancreaticlipase induced by WEAX

3)WEAX對胰脂肪酶的抑制類型分析。由圖10可知，隨著WEAX的質(zhì)量濃度從5 mg/mL增加至30 mg/mL，擬合曲線的斜率增大，即1/v增大，vmax減小，在橫坐標(biāo)的截距也隨之增大，即Km增大。擬合后2條擬合曲線交于第二象限，說明WEAX對胰脂肪酶的抑制類型是混合型抑制。

圖10 WEAX對胰脂肪酶的Lineweaver- Burk方程擬合曲線Fig.10 Lineweaver-Burk equation fitting curveof pancreatic lipase by WEAX

3 討 論

本研究以小麥麥麩WUAX和WEAX為對象，研究了2種具有不同結(jié)構(gòu)特性的AX對膽酸鹽的結(jié)合力和胰脂肪酶抑制活性。結(jié)合膽酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WUAX結(jié)合膽酸鹽的能力強(qiáng)于WEAX。Lin等[16]研究發(fā)現(xiàn)膽酸鹽結(jié)合力會(huì)隨著其中不溶性纖維含量的增多而升高，這可能是WUAX對STC和SGC的結(jié)合力高于WEAX的原因。WUAX對STC結(jié)合率和結(jié)合量大于SGC，與段振等[17]研究結(jié)果相同。相較于SGC側(cè)鏈上的甘氨酸羧基，STC側(cè)鏈基團(tuán)的磺酸基的極性更強(qiáng)，更容易暴露結(jié)合位點(diǎn)，在不聚集的狀態(tài)下更易被多糖結(jié)合[18-19]。WUAX對膽酸鹽的結(jié)合量隨其添加量的增加而增加，當(dāng)添加量為375 mg時(shí)，膽酸鹽結(jié)合量最大。劉榮等[20]研究表明水溶性黑木耳多糖對膽酸鹽的結(jié)合量會(huì)隨著多糖添加量的增加而達(dá)到峰值，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。此時(shí)溶液中的WUAX達(dá)到飽和，當(dāng)添加量繼續(xù)增大時(shí)會(huì)因?yàn)閃UAX的黏度增大而使得其結(jié)合量下降[21]。WUAX對STC的結(jié)合量高于SGC，這與紀(jì)秀鳳等[22]對于紅樹莓籽花青素結(jié)合膽酸鹽的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。WUAX的等溫吸附曲線擬合方程的相關(guān)系數(shù)R2分別是0.971 2和0.972 4，說明擬合方程具有線性關(guān)系，符合Freundlich方程。在Freundlich方程中，1/n代表濃度或添加量對結(jié)合量影響的強(qiáng)弱，1/n越小，結(jié)合性能越好。當(dāng)0.1<1/n≤0.5時(shí)，代表容易結(jié)合；當(dāng)0.5<1/n≤1時(shí)，表明不易結(jié)合；當(dāng)1/n>1時(shí)，表明結(jié)合困難。WUAX對STC和SGC擬合方程的1/n分別為0.51和1.31，說明相對于SGC，WUAX較易與STC結(jié)合[23]。

胰脂肪酶抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：WEAX對胰脂肪酶的抑制能力高于WUAX，這可能因?yàn)閃EAX所形成的高黏性溶液能更有效降低胰脂肪酶的活性[6]。WEAX對胰脂肪酶的抑制率隨著質(zhì)量濃度增加先升高后趨于平緩，黃琳翔等[15]和周巧杰等[24]試驗(yàn)結(jié)果中胰脂肪酶抑制率變化與本研究一致，原因可能是WEAX與胰脂肪酶的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)使得抑制率趨于平緩。根據(jù)酶和抑制劑的結(jié)合特性，可分為可逆性抑制和不可逆性抑制，酶反應(yīng)速率曲線經(jīng)過原點(diǎn)的為可逆性抑制，不經(jīng)過原點(diǎn)的是不可逆性抑制[25]。WEAX對胰脂肪酶是可逆性抑制，與酶結(jié)合是通過非共價(jià)鍵的形式，從而影響酶的活性[26]。酶的反應(yīng)速率曲線變化趨勢及交點(diǎn)與于洋君等[27]和張靜等[28]研究可逆性抑制結(jié)果一致。Lineweaver-Burk方程擬合曲線結(jié)果表明WEAX對胰脂肪酶的抑制類型是混合型抑制。Liu 等[26]研究了紅米多酚對胰脂肪酶活性的抑制，結(jié)果表明抑制類型為混合型抑制，與本研究得出的抑制類型相符合?；旌闲鸵种萍碬EAX作為酶抑制劑，既可以與游離的酶反應(yīng)，又可以與酶和底物的復(fù)合物反應(yīng)，從而抑制胰脂肪酶的活性[29]。

綜上所述，WUAX對膽酸鹽的結(jié)合力顯著高于WEAX，而WEAX對胰脂肪酶抑制活性高于WUAX。這些體外降脂作用的差異與2種AX的結(jié)構(gòu)特性不同有關(guān)?；诖?筆者所在課題組后續(xù)將進(jìn)一步對AX結(jié)構(gòu)與降脂作用的關(guān)系進(jìn)行研究，為AX降脂機(jī)制的探究提供參考。