周躍聞，鄭昌婧，高香宏

（唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院婦產(chǎn)科教研室，河北 唐山 063000）

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率升高，且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，嚴(yán)重威脅女性的生命健康［1］。目前，手術(shù)切除結(jié)合放化療是宮頸癌治療的主要方法，但即使使用綜合治療方案，患者的預(yù)后仍不理想［2］。因此，尋找有效的宮頸癌治療方法有重要意義。

灰樹花又名貝葉多孔菌，是一種藥食同源植物，具有多種生物活性。研究表明，灰樹花多糖具有明顯的抗腫瘤活性，如Zhang 等［3］研究顯示，灰樹花多糖可通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡；Rocalema 等［4］研究顯示，灰樹花多糖對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲有抑制作用，但它在宮頸癌中的研究較少。前期發(fā)現(xiàn)，灰樹花多糖可通過下調(diào)生存素survivin 及上調(diào)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）基因表達(dá)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡［5］。磷脂酰肌醇3?激酶／蛋白激酶B（PI3K／AKT）信號通路是一條抗凋亡、促存活的經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及化療抵抗中有明顯作用［6?7］。另外，抑制PI3K／AKT 信號通路可明顯降低宮頸癌細(xì)胞生長［8］，但灰樹花多糖是否可阻斷PI3K／AKT 信號通路從而抑制宮頸癌細(xì)胞生長還未明確。因此，本研究旨在探討灰樹花多糖對宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移和凋亡的影響，并進(jìn)一步研究對PI3K／AKT信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 灰樹花多糖（純度50%，批號20181020）購自浙江方格藥業(yè)有限公司。小牛血清（批號 20170210）、DMEM 培養(yǎng)基（批號20181105）、胰酶均購自美國Hyclone 公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（批號20171203）、二甲基亞砜（DMSO）（批號20180320）、LY294002（批號20180110）均購自美國Sigma 公司；Transwell 小室（批號 20171120）、Matrigel 基質(zhì)膠（批 號20171201）均購自美國Coming 公司；Annexin V?FITC／PI 雙染細(xì)胞凋亡試劑盒（批號20181005）、標(biāo)記緩沖液（Binding Buffer）（批號20181205）、流式細(xì)胞儀均購自美國BD 公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號20171215）、RIPA裂解液（批號20180410）均購自江蘇碧云天生物技術(shù)有 限公司；AKT（ab8805）、p?AKT（ab8933）、增殖細(xì) 胞核抗 原（PCNA）（ab181973）、剪切型caspase?3（Cleaved caspase?3）（ab2302）、E?鈣黏蛋白（E?cadherin）抗體（ab227639）均購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（ab205718）、電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測試劑盒（20180510）均購自美國Santa Cruz 公司。酶標(biāo)儀購自美國Bio?Rad 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Caski、C33A 細(xì)胞株購自美國ATCC 公司。細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的培養(yǎng)基，每隔48 h 換液1 次，待細(xì)胞在培養(yǎng)瓶鋪滿80%～90%時進(jìn)行傳代。實驗時，取生長至對數(shù)期的第4 代Caski 細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞增殖檢測 取對數(shù)期Caski、C33A 細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，終止消化后離心收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后以1×104個／孔接種于96 孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞單層鋪滿96 孔板底后，使用灰樹花多糖（終質(zhì)量 濃度為50、100、200 μg／mL）、LY294002（10 μmol／L）或LY294002＋灰樹花多糖（10 μmol／L LY294002 和200 μg／mL 灰樹花多糖）處理細(xì)胞，并設(shè)置僅加入培養(yǎng)基者作為對照組，每組5 個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育48 h，每孔中加入10 μL MTT 溶液（5 mg／mL），4 h后終止培養(yǎng)，每孔中加入DMSO 150 μL，于搖床上低速振蕩10 min，結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀測定490 nm 波長處各孔光密度（OD），重復(fù)3 次。

1.4 細(xì)胞侵襲、遷移能力檢測 預(yù)先使用無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠（5 ∶1），平鋪在聚碳酸酯微孔濾膜上，37 ℃放置3 h 后轉(zhuǎn)至室溫風(fēng)干，將鋪好基質(zhì)膠的Transwell 小室放置于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，下室每孔中加入500 μL 無血清培養(yǎng)的Caski 細(xì)胞上清液。使用灰樹花多糖（終質(zhì)量濃度為50、100、200 μg／mL）、LY294002（10 μmol／L）或LY294002＋灰樹花多糖（10 μmol／L LY294002 和200 μg／mL 灰樹花多糖）處理細(xì)胞48 h，離心，無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104／mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell 小室上室中，于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)18 h，取出小室，棉簽輕柔擦掉小室上室細(xì)胞，4% 多聚甲醛固定，0.1% 結(jié)晶紫染色。在高倍顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個視野（上、中、下、左、右），計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，拍照，取平均值，重復(fù)3 次。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測 胰酶消化生長至對數(shù)期的Caski 細(xì)胞，終止消化后離心收集細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，以2.5×105／孔接種細(xì)胞于6 孔板，于培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育，細(xì)胞達(dá)70%～80%生長融合時，使用灰樹花多糖（終質(zhì)量濃度為50、100、200 μg／mL）、LY294002（10 μmol／L）或LY294002＋灰樹花多糖（10 μmol／L LY294002、200 μg／mL 灰樹花多糖）處理細(xì)胞，僅加入培養(yǎng)基者作為對照組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后，胰酶消化細(xì)胞，離心，棄掉上清，預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞，輕搖使細(xì)胞懸浮，離心，棄掉上清，重復(fù)洗滌2 次，加入400 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，避光環(huán)境加Annexin V?FITC染料10 μL，混勻，4 ℃孵育10 min，然后加入PI染料5 μL，混勻，4 ℃孵育10 min，上機(jī)前再加入結(jié)合緩沖液300 μL，1 h 內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，重復(fù)3 次。

1.6 AKT、p?AKT、PCNA、Cleaved caspase?3、E?cadherin 蛋白表達(dá)檢測 收集灰樹花多糖（終質(zhì)量濃度為50、100、200 μg／mL）、LY294002（10 μmol／L）或LY294002 ＋灰樹花多糖（10 μmol／L LY294002和200 μg／mL 灰樹花多糖）處理48 h 的Caski 細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞2 次。加入適量放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解液，在冰上反應(yīng)30 min，離心，收集上清，BCA 法測定蛋白濃度，在適量蛋白中加入5×loading buffer，100 ℃水浴鍋中10 min，即得最終的蛋白樣品。按照30 μg／孔上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯（PVDF）膜及膜封閉，將封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入稀釋后的AKT、p?AKT、PCNA、Cleaved caspase?3和E?cadherin 抗體（1 ∶500），封口，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1 ∶2 000），室溫1 h，TBST 洗膜，膜上滴加ECL 顯色液，曝光顯影，Quantity One 軟件分析條帶灰度值，重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采SNK?q 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 灰樹花多糖對宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響 不同質(zhì)量濃度灰樹花多糖對宮頸癌Caski、C33 A 細(xì)胞增殖均有抑制作用（P＜0.05），并呈現(xiàn)濃度依賴性，選擇抑制作用更明顯的Caski細(xì)胞為研究對象。Transwell 小室檢測結(jié)果顯示，不同濃度的灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞侵襲和遷移能力均有抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），并呈現(xiàn)濃度依賴性。見表1、圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞侵襲、遷移的影響（×200）Fig.1 Effects of Grifola frondosa polysaccharide with different concentrations on the invasion and migration of Caski cells（×200）

表1 不同質(zhì)量濃度灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響（， n＝3）Tab.1 Effects of Grifola frondosa polysaccharides with different concentrations on the proliferation，invasion，migration and apoptosis of Caski cells（， n＝3）

表1 不同質(zhì)量濃度灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響（， n＝3）Tab.1 Effects of Grifola frondosa polysaccharides with different concentrations on the proliferation，invasion，migration and apoptosis of Caski cells（， n＝3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞凋亡的影響 隨著灰樹花多糖質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞凋亡率升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并呈現(xiàn)出濃度依賴性，見表1、圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of Grifola frondosa polysaccharide with different concentrations on the apoptosis of Caski cells

2.3 灰樹花多糖對AKT、p?AKT、PCNA、Cleaved caspase?3、E?cadherin 表達(dá)的影響 與對照組比較，灰樹花多糖組p?AKT、PCNA 表達(dá)降低，Cleaved caspase?3、E?cadherin 表達(dá)升 高（P＜0.05，P＜0.01），并呈濃度依賴性，見圖3、表2。

表2 各組AKT、p?AKT、PCNA、Cleaved caspase?3 和E?cadherin 蛋白相對表達(dá)（， n＝3）Tab.2 Relative expressions of AKT，p?AKT，PCNA，Cleaved caspase?3 and E?cadherin proteins in various groups（，n＝3）

表2 各組AKT、p?AKT、PCNA、Cleaved caspase?3 和E?cadherin 蛋白相對表達(dá)（， n＝3）Tab.2 Relative expressions of AKT，p?AKT，PCNA，Cleaved caspase?3 and E?cadherin proteins in various groups（，n＝3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖3 灰樹花多糖對AKT、p?AKT、PCNA、Cleaved caspase?3、E?cadherin 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Grifola frondosa polysaccharide on the expressions of AKT，p?AKT，PCNA，Cleaved caspase?3 and E?cadherin

2.4 LY294002 增強(qiáng)灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的抑制作用 LY294002 可抑制Caski 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與灰樹花多糖聯(lián)合處理后上述作用增強(qiáng)，與LY294002 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖4、表3。

圖4 LY294002 單獨或聯(lián)合灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞侵襲、遷移的影響（×200）Fig.4 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the invasion and migration of Caski cells（×200）

2.5 LY294002 增強(qiáng)灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 LY294002 可促進(jìn)Caski 細(xì)胞凋亡，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與灰樹花多糖聯(lián)合處理后上述作用增強(qiáng)，與LY294002 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖5、表3。

圖5 LY294002 單獨或聯(lián)合灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the apoptosis of Caski cells

表3 LY294002 單獨或聯(lián)合灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the proliferation，invasion，migration and apoptosis of Caski cells（， n＝3）

表3 LY294002 單獨或聯(lián)合灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the proliferation，invasion，migration and apoptosis of Caski cells（， n＝3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與LY294002 組比較，＃＃P＜0.01。

2.6 LY294002 單獨或聯(lián)合灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞AKT、p?AKT、PCNA、cleaved Caspase?3、E?cadherin 表達(dá)的影響 與對照組比較，LY294002組p?AKT、PCNA 表達(dá)降低（P＜0.01），Cleaved caspase?3、E?cadherin 表達(dá)升 高（P＜0.01）；與LY294002 組比較，LY294002 ＋灰樹花多糖組p?AKT、PCNA 表達(dá)降 低（P＜0.01），Cleaved caspase?3、E?cadherin 表達(dá)升高（P＜0.01），見圖6、表4。

表4 各組AKT、p?AKT、PCNA、Cleaved caspase?3 和E?cadherin 蛋白相對表達(dá)（， n＝3）Tab.4 Relative expressions of AKT，p?AKT，PCNA，Cleaved caspase?3 and E?cadherin proteins in various groups（，n＝3）

表4 各組AKT、p?AKT、PCNA、Cleaved caspase?3 和E?cadherin 蛋白相對表達(dá)（， n＝3）Tab.4 Relative expressions of AKT，p?AKT，PCNA，Cleaved caspase?3 and E?cadherin proteins in various groups（，n＝3）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與LY294002 組比較，＃＃P＜0.01。

圖6 LY294002 單獨或聯(lián)合灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞AKT、p?AKT、PCNA、Cleaved caspase?3、E?cadherin 表達(dá)的影響Fig.6 Effects of LY294002 alone or in combination with Grifola frondosa polysaccharide on the expressions of AKT，p?AKT，PCNA，Cleaved caspase?3 and E?cadherin in Caski cells

3 討論

近些年來，從植物中分離純化有效的活性成分是腫瘤治療的新趨勢。越來越多的研究證實，一些天然的植物或產(chǎn)物的提取物對腫瘤有抑制作用，且方便獲取，對人體毒性小，可作為腫瘤治療的替代或治療外的補(bǔ)充劑［9?10］?；覙浠ㄊ且环N食藥兩用菌，可長期食用，由灰樹花提取出的多糖無任何毒副作用，無論是口服還是注射均表現(xiàn)出相似的抗腫瘤活性［11］?；覙浠ǘ嗵强梢种坡殉舶┘?xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］；灰樹花多糖可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，與維生素C 連用對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用更明顯［13］?；覙浠ǘ嗵强赡芡ㄟ^激活氧化應(yīng)激信號從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡［14］。本研究檢測不同濃度灰樹花多糖對宮頸癌Caski 細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示，隨著灰樹花多糖質(zhì)量濃度增加，Caski 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均明顯降低，凋亡率升高，提示灰樹花多糖對宮頸癌細(xì)胞生長有明顯抑制作用。

PI3K／AKT 信號通路是一條重要的信號途徑，在人類的絕大多數(shù)腫瘤中異常激活，AKT 是一種原癌基因，是PI3K 激活后的下游效應(yīng)分子，也是該通路的核心，其發(fā)生磷酸化的程度可反映該信號途徑激活程度［15?16］。抑制PI3K／AKT 信號通路可明顯降低多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［17?18］。LY294002 是PI3K／AKT 信號通路抑制劑，可特異性抑制AKT 的磷酸化，抑制宮頸癌細(xì)胞生長［19］。本研究結(jié)果顯示，LY294002 可明顯抑制Caski 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)p?AKT 表達(dá)，且可增加灰樹花多糖對Caski 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡及p?AKT 表達(dá)的影響。提示灰樹花多糖可能通過阻斷PI3K／AKT信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞生長。

細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡，caspase?3、PARP等多種蛋白負(fù)責(zé)調(diào)控凋亡的關(guān)鍵過程，caspase?3是caspase 家族關(guān)鍵酶，處于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游，其活化可使凋亡不可逆［20］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，EMT 與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制EMT 可降低腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［21］。E?cadherin 是衡量是否發(fā)生EMT 的標(biāo)志。有研究表明，活化后的AKT 可通過調(diào)節(jié)下游PCNA、caspase?3、E?cadherin 表達(dá)而影響細(xì)胞生長［22?23］。本研究結(jié)果顯示，LY294002 和灰樹花多糖均可下調(diào)PCNA 表達(dá)，上調(diào)caspas?e3 和E?cadherin 表達(dá)，且兩者聯(lián)合使用對PCNA、caspase?3 和E?cadherin 表達(dá)影響更明顯。

綜上所述，灰樹花多糖可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與阻斷PI3K／AKT 信號通路有關(guān)。提示灰樹花多糖可能是宮頸癌治療的有效途徑，但還需更多研究證實。