徐境含，徐珒昭，孔祥麗，張?zhí)礻?，馮熙瑞，武明月，滕國新，許曉曦,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500）

三氯蔗糖是一種人工合成的含氯甜味劑，有低能量、高甜度、性質(zhì)穩(wěn)定的特點，在飲料、糕點、糖果等食品中被廣泛應(yīng)用[1]。隨著消費者對健康飲食的意識逐漸增強，人工甜味劑應(yīng)用的安全性倍受廣大消費者及使用者的關(guān)注。目前已有研究證實，甜味劑的攝入可引起體質(zhì)量和腰圍的增加及肥胖、高血壓、代謝綜合征、2型糖尿病和心血管疾病的發(fā)病率升高，甜味劑攝入量與發(fā)胖、高血壓、代謝綜合征、糖尿病和心腦血管疾病之間存在重要的相關(guān)性。三氯蔗糖作為目前應(yīng)用最為廣泛的蔗糖替代品，其對人體健康是否存在負(fù)面影響成為備受消費者關(guān)注并亟待解決的科學(xué)問題。

近年來，越來越多的研究結(jié)果證實，膳食成分對腸道微生態(tài)具有極其重要的影響，腸道微生態(tài)的改變可影響腸道菌群與宿主細(xì)胞之間的相互作用，引發(fā)炎癥，從而導(dǎo)致慢性炎癥性疾病的發(fā)生[2]。腸道是機體重要的免疫器官，腸道屏障和腸道內(nèi)環(huán)境及其代謝物的相互作用形成腸道穩(wěn)態(tài)[3]，腸道微生物結(jié)構(gòu)變化會引起代謝物的改變，當(dāng)腸道屏障功能受損、腸道通透性增強時，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的有害物質(zhì)及促炎因子透過腸黏膜進入其他組織，導(dǎo)致機體持續(xù)的炎癥和腸道組織損傷[4]，并引發(fā)自身免疫性疾病、代謝性疾病、癌癥、心血管疾病和神經(jīng)疾病等疾病[5]。隨著環(huán)境和食物中的抗生素和農(nóng)藥等在人體的暴露劑量逐漸增加，研究人員在人體腸道菌群中發(fā)現(xiàn)了耐藥性基因[6]，這些因素能夠引發(fā)機體腸穩(wěn)態(tài)失衡，一旦有對腸道穩(wěn)態(tài)起負(fù)面作用的外界因素介入，即會促使腸道微生態(tài)惡化和免疫系統(tǒng)受損，進而引起各類疾病的出現(xiàn)。食品添加劑通過對腸道菌群以及腸屏障的作用進而干預(yù)機體免疫，甚至引發(fā)各類疾病等問題。已有的研究表明，人工甜味劑可改變腸道微生物群的組成，影響宿主健康[7-11]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)三氯蔗糖干預(yù)后腸道微生物中的耐藥基因增加，從而導(dǎo)致更惡劣的腸道環(huán)境[12]。Bian Xiaoming等[10]連續(xù)6 個月向雄性BALB/c小鼠飲用水中添加三氯蔗糖，并通過16S rRNA、代謝組學(xué)等分析三氯蔗糖對小鼠腸道微生物的影響，結(jié)果表明，三氯蔗糖使小鼠腸道微生物的代謝譜發(fā)生改變，并誘發(fā)肝臟炎癥。因此，相關(guān)研究尚無法確定三氯蔗糖絕對安全并適合長期食用。

本實驗通過探究三氯蔗糖攝入導(dǎo)致腸道微生態(tài)變化對小鼠腸道菌群多樣性及物種組成的影響，并結(jié)合多項指標(biāo)綜合推斷由腸道微生物結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致機體免疫屏障受損而引發(fā)慢性疾病的可能。為三氯蔗糖對人體健康不良作用機制提供研究參考，同時為人工甜味劑的實際應(yīng)用提供指導(dǎo)及理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

4 周齡清潔級雄性BALB/c小鼠（體質(zhì)量（16±2）g左右）購自北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可號：SCXK（京）2016-0006。動物飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

三氯蔗糖（IS0770） 北京索萊寶科技有限公司；小鼠血清白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、小鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、小鼠腸道組織分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A，SIgA） 南京建成生物工程研究所。

磷酸鹽緩沖液 美國HyClone公司；無水乙醇天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）天津市天大化學(xué)試劑廠；二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹交 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蘇木素-伊紅染液上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；BSA224S型分析天平 德國Sartorius公司；HBS-1096A酶標(biāo)儀 南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；RLE30086V型超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技有限公司；JJ-12J型脫水機、JB-P5型包埋機、JB-L5型凍臺 武漢俊杰電子有限公司；RM2016型病理切片機 德國徠卡儀器有限公司；KD-P型組織攤片機 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；BS203型正置光學(xué)顯微鏡 重慶廣電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及取樣

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后分組進行實驗，40 只小鼠隨機分為空白對照（Control）組、低劑量三氯蔗糖（L-S）組、中劑量三氯蔗糖（M-S）組、高劑量三氯蔗糖（H-S）組，每組各10 只。Control和L-S、M-S、H-S組小鼠每天分別灌胃0.1 mL純凈水和0.1 mL作用劑量分別為15、25、50 mg/kgmb的三氯蔗糖溶液，低劑量根據(jù)食品添加劑可接受的三氯蔗糖每日攝入量選取，中劑量依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[13]飲料中三氯蔗糖的最大添加限量選取，高劑量為中劑量的2 倍。每天灌胃時間固定，持續(xù)42 d。所有小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下12 h明暗周期飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)取食及飲水。實驗室條件保持在（22±2）℃的恒定溫度。

實驗第43天，將各組小鼠無水乙醚麻醉后眼球取血，分離得血清[14]。取血后頸椎脫臼處死并在無菌操作臺內(nèi)進行解剖，測定小鼠脾臟、胸腺質(zhì)量。小鼠腹腔剖開取出完整腸道，取2 g盲腸內(nèi)容物保存于1 mL凍存管中，液氮速凍后立即保存于-80 ℃冰箱備用；取1 cm回腸放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%中性福爾馬林溶液中固定，待后續(xù)切片觀察。

1.3.2 16 S rDNA高通量測序

將1.3.1節(jié)中保存于-80 ℃冰箱的小鼠糞便樣品取出，每組隨機選取3個樣品進行16S rDNA高通量測序。使用Fast DNA SPIN提取試劑盒提取細(xì)菌基因組總DNA，使用正向引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGAGGCAGCA-3′）和反向引物806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對細(xì)菌的16S rDNA基因V3～V4可變區(qū)進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增。運用Illlumina MiSeq平臺和MiSeq試劑盒V3的雙末端2×300 bp測序。使用QIIME v1.8.0軟件進行序列分析，高質(zhì)量序列以97%的序列同一性聚類為可操作的分類單位，即操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[15]。

將該OTU中的序列比對到Silva數(shù)據(jù)庫并使用QIIME v1.8.0軟件注釋到相應(yīng)的微生物種類，將測序數(shù)據(jù)與代表序列進行比對，得到每個OTU在該樣品中的豐度；按豐度從大到小進行排列，使用R v3.1.1軟件作圖得到豐度等級曲線；根據(jù)Chao1指數(shù)、Observed Species指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)算法進行α多樣性分析，同時基于Unweight UniFrac計算方法進行β多樣性分析；利用QIIME軟件[16]對OTU進行物種組成分析；最后通過LEfSe軟件[17]，根據(jù)組間差異顯著的物種進行各組物種豐度差異分析，并將檢測到的某分類存在組間差異的微生物群落或物種繪制成豐度直方圖。

1.3.3 小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的測定

小鼠自適應(yīng)性飼喂結(jié)束后，開始每周固定時間稱量并記錄其體質(zhì)量。按1.3.1節(jié)取樣方法獲取脾、胸腺的質(zhì)量，計算脾臟指數(shù)（脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量）和胸腺指數(shù)（胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量），單位均為mg/g。

1.3.4 小鼠血清炎癥因子白細(xì)胞介素-1β含量的測定

采用酶聯(lián)免疫法中的雙抗體夾心法測定小鼠IL-1β含量，所有樣品均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 小鼠腸黏膜分泌型免疫球蛋白水平的測定

取每組小鼠1 cm回腸樣品，輕輕擠去食糜，用4 ℃去離子水沖洗?？v向剪開腸壁，濾紙吸水后用載玻片輕輕刮取小腸黏膜，稱取1 g左右的黏膜，按質(zhì)量體積比1∶9加入pH 7.2、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，使用勻漿器將黏膜冰浴勻漿，將勻漿4 ℃、3 000×g離心10 min后取上清液。試劑盒雙抗體夾心法測定小鼠SIgA水平[18]。

1.3.6 小鼠小腸病理切片觀察

將1.3.1節(jié)中保存于福爾馬林溶液的回腸進行脫蠟二甲苯處理10 min，100%、90%、80%、70%乙醇溶液復(fù)水5 min，蒸餾水清洗后，蘇木素染色2 min、伊紅染色3 min、脫水封片，然后進行顯微鏡鏡檢，采集圖像進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行處理，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 20軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin Pro 8.5.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三氯蔗糖對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 物種多樣性分析結(jié)果

OTU豐度等級曲線分析如圖1所示，豐度等級曲線是展現(xiàn)樣品中物種多樣性的一種形式，可以同時解釋樣品多樣性的兩個方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。

圖1 測序樣品的物種豐度等級曲線Fig.1 Rank-Abundance curves of sequenced samples

由圖1可知，測序樣品的物種豐度排序主要分布在100～500之間，該范圍各曲線變化趨勢已趨于平緩，接近平臺期，繼續(xù)增加取樣量只會產(chǎn)生極少量新的OTU，說明其高通量測序深度能夠滿足本研究的分析要求。本實驗的12 份樣品曲線走勢顯示在橫軸上的排序范圍和平滑程度均有較大差異，亦說明小鼠樣品間表現(xiàn)出不同的豐度和均勻度。

α多樣性主要反映樣品內(nèi)多樣性。本實驗通過Chao1指數(shù)、Observed Species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)評估各組之間的α多樣性，Chao1指數(shù)主要反映菌群豐度，Observed Species指數(shù)表示樣品中含有的物種數(shù)目，Shannon指數(shù)用來估算樣品中微生物的多樣性，Simpson指數(shù)表示優(yōu)勢物種在群落中的所占比例的大小。

由表1可知，除M-S組與Control組Simpson指數(shù)差異不顯著，三氯蔗糖的干預(yù)導(dǎo)致H-S組、M-S組、L-S組相較于Control組4 種指數(shù)均顯著降低。隨著三氯蔗糖干預(yù)劑量的增加，Chao1指數(shù)呈明顯下降趨勢，Observed Species數(shù)目顯著降低（P＜0.05），Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)先增大后減小。結(jié)果表明隨著三氯蔗糖的劑量增加，菌群豐度下降，物種總數(shù)減少。三氯蔗糖的干預(yù)使腸道菌群多樣性顯著降低，優(yōu)勢菌群所占比例有所下降。腸道微生物多樣性的變化直接或間接與疾病相關(guān)，相關(guān)研究表明，結(jié)腸炎患者組與健康對照組相比，糞便微生物群的多樣性顯著降低[19-20]。

表1 小鼠腸道菌群α多樣性Table 1 Alpha diversity of intestinal flora in mice

β多樣性主要關(guān)注微生物群落構(gòu)成的不同，評估不同樣品間的微生物群落組成差異，以用來比較一對樣品在物種多樣性方面存在的差異。本實驗基于進化的距離（UniFrac），采取非權(quán)重（Unweight）方式，根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹計量在不同劑量的三氯蔗糖環(huán)境下樣品之間的微生物群落差異。如圖2所示，縱坐標(biāo)為系統(tǒng)進化樹樹枝的距離，節(jié)點的枝長占整個樹枝長和的比例，即UniFrac值；每個分支葉節(jié)點1、2、3分別代表每組中的3 個樣品。由圖2可知，Control組與L-S組距離較近，與H-S組、M-S組距離較遠(yuǎn)，說明Control組與L-S組之間腸道菌群物種組成的相似程度更高。L-S組與H-S組的距離大于L-S組與M-S組之間的距離，說明小鼠攝入高劑量三氯蔗糖對腸道菌群的β多樣性影響較大，物種組成與其他組不相似。

圖2 測序樣品系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of sequenced samples

2.1.2 物種組成分析結(jié)果

Venn圖可用于統(tǒng)計多組或多個樣品中所共有和獨有的菌落或物種的數(shù)目，反映樣品中菌群或物種的數(shù)量和組成，及其相似性及重疊情況。由圖3可知，各組樣品中共有的OTU是116 個，Control組中的OTU數(shù)量最多，達到963 個，H-S組OTU數(shù)量最少，有425 個。Control組特有475 個OTU；H-S組特有199 個OTU；M-S組特有232 個OTU；L-S組特有242 個OTU；隨著三氯蔗糖劑量增加，小鼠特有的OTU數(shù)量減少，說明三氯蔗糖的攝入明顯改變了小鼠腸道微生物種類，小鼠腸道菌群多樣性顯著降低，與2.1.1節(jié)結(jié)果一致。

圖3 各組小鼠腸道菌群OUT數(shù)量的Venn圖Fig.3 Venn diagram showing shared and unique OUTs of intestinal flora in different groups of mice

基于OTU的統(tǒng)計結(jié)果，以柱形圖的形式展示各組在門水平的物種組成情況，結(jié)果如圖4所示?？瞻讓φ战M豐度比例由高到低依次為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、Patescibacteria、放線菌門（Actinobacteria）、Epsilonbacteraeota、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、軟壁菌門（Tenericutes）、藍藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）。與空白對照組相比，實驗組變形菌門、放線菌門、疣微菌門、Epsilonbacteraeota、酸桿菌門豐度升高，其中H-S組的擬桿菌門豐度顯著升高（P＜0.05）。在炎癥性腸病患者的腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)變形菌門、Epsilonbacteraeota、酸桿菌門的豐度明顯升高[21]，并且2型糖尿病患者腸道中擬桿菌門、變形菌門豐度也升高[22]。

圖4 各組小鼠腸道菌群門水平的物種相對豐度柱狀圖Fig.4 Relative abundance of intestinal bacterial species at the phylum level in each group

根據(jù)OTU的統(tǒng)計結(jié)果，對4 組小鼠腸道微生物進行OTU水平的物種進行注釋，屬水平微生物構(gòu)成如圖5所示。與空白對照組相比，實驗組中羅斯氏菌屬（Roseburia）、Mucispirillum、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、另枝菌屬（Alistipes）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）相對豐度降低，而不動桿菌屬（Acinetobacter）、Lachnoclostridium、埃希氏-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）相對豐度升高。曾有研究檢測出2型糖尿病患者糞便中脫硫弧菌屬明顯增加[23]，未發(fā)展成AIDS的HIV感染者腸道中羅氏菌屬、另枝菌屬、瘤胃球菌屬的菌群豐度降低[24]。

圖5 各組小鼠腸道菌群屬水平的物種相對豐度柱狀圖Fig.5 Relative abundance of intestinal bacterial species at the genus level in each group

如圖6所示，與空白組對比，H-S組11 個菌屬相對豐度顯著增加（P＜0.05），34 個菌屬相對豐度顯著下降（P＜0.05），M-S組6 個菌屬相對豐度顯著增加（P＜0.05），31 個菌屬相對豐度顯著下降（P＜0.05），L-S組8 個菌屬相對豐度顯著增加（P＜0.05），25 個菌屬相對豐度顯著下降（P＜0.05）。表明小鼠攝入三氯蔗糖可顯著降低腸道微生物物種的相對豐度，使腸道菌群多樣性下調(diào)，此結(jié)論與上述多樣性分析結(jié)果相符合。

圖6 各組小鼠腸道菌群基于屬水平的樣品組間差異分析Fig.6 Analysis of differences in intestinal bacteria at the genus level between all groups based on the genus level of the intestinal flora of the mice from each group

2.1.3 物種門、屬水平特征性差異分析結(jié)果

本實驗線采用線性判別分析來估算各組物種豐度的差異效果如圖7所示，并列出根據(jù)線性判別分析結(jié)果檢測到的各組間具有差異的特征微生物群落或物種的豐度直方圖（圖8～10）。

圖7清晰地展示出各組微生物群落在界、門、綱、目、科、屬之間存在明顯差異的物種，三氯蔗糖的干預(yù)導(dǎo)致物種間豐度差異顯著的門分別為擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、Patescibacteria（P＜0.05）。由圖7得到圖8～10特征性菌群的相對豐度直方圖，三氯蔗糖的攝入導(dǎo)致小鼠腸道中變形菌門、放線菌門相對豐度顯著升高（P＜0.05），梭菌科、理研菌科相對豐度顯著降低（P＜0.05），H-S組和M-S組在擬桿菌屬的相對豐度顯著升高（P＜0.05）。

圖7 各組小鼠腸道菌群進化分支圖Fig.7 Evolutionary branching of intestinal flora in all groups of mice

圖8 小鼠腸道菌群組間門水平相對豐度直方圖（放線菌門、變形菌門）Fig.8 Histogram relative abundance of intestinal (Actinomycetes and Proteobacteria) in all groups of mice

圖9 小鼠腸道菌群組間科水平相對豐度直方圖（梭菌科、理研菌科）Fig.9 Histogram of relative abundance of intestinal bacteria in all groups of mice (Clostridium and Ritiaceae)

圖10 小鼠腸道菌群組間屬水平相對豐度直方圖（擬桿菌屬）Fig.10 Histogram relative abundance of intestinal bacteria in all groups of mice (Bacteroides)

2.2 三氯蔗糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

脾腺指數(shù)和胸腺指數(shù)在一定程度上可以反映機體免疫情況[25]。由表2可知，灌胃6 周后，與Control組相比，M-S組、L-S組脾臟指數(shù)相近，差異不顯著（P＞0.05）；與Control組相比H-S組脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。與Control組相比，H-S組、L-S組胸腺指數(shù)差異不明顯，M-S組胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。胸腺是重要的中樞免疫器官，脾臟作為外周免疫器官，當(dāng)脾腺、胸腺指數(shù)下降時，表明三氯蔗糖的攝入導(dǎo)致小鼠免疫力降低[26]，抵抗外來微生物感染和入侵的能力減退。

表2 三氯蔗糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響（n＝6）Table 2 Effect of sucralose on immune organ indexes in mice (n = 6)

2.3 三氯蔗糖對小鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α的影響

IL-1β與TNF-α是激活性巨噬細(xì)胞分泌的促炎癥細(xì)胞因子，可通過誘導(dǎo)其他促炎因子的級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)炎癥[27]。

灌胃6 周三氯蔗糖后，IL-1β、TNF-α水平變化如表3所示。與Control組相比，H-S組IL-1β水平顯著升高（P＜0.05），M-S組與L-S組TNF-α水平也顯著升高（P＜0.05）。相關(guān)研究表明，高脂飲食能夠誘導(dǎo)低度系統(tǒng)性炎癥和代謝性疾病，并在人類身上得到證實，表現(xiàn)為Toll樣受體4、核因子-κB表達量升高以及TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生量增加[28-29]。因此，三氯蔗糖的攝入會導(dǎo)致體內(nèi)促炎因子分泌增多，炎癥水平上升，腸道微生物中炎癥介質(zhì)破壞上皮黏膜的完整性，陰止腸外細(xì)胞之間的連接，抑制抗微生物肽的分泌[30]。

表3 三氯蔗糖對小鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α含量的影響（n ＝6）Table 3 Effect of sucralose on serum inflammatory factors IL-1β and TNF-α in mice (n = 6)

2.4 三氯蔗糖對小鼠腸黏膜分泌型免疫球蛋白的影響

位于黏膜相關(guān)淋巴組織的SIgA是防御腸道病原微生物的第一道防線，是腸黏膜免疫重要組成部分。當(dāng)腸道黏膜屏障受到攻擊時，腸道黏膜中的SIgA含量急劇下降。

由圖11可知，灌胃小鼠6 周后，與Control組相比，H-S組、M-S組和L-S組SIgA質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），3 組小鼠的腸道黏膜均受到不同程度影響。與L-S組相比，M-S組SIgA質(zhì)量濃度顯著減少（P＜0.05）。SIgA的保護作用包括中和腸腔中的細(xì)菌毒素、中和轉(zhuǎn)胞吞過程中的輪狀病毒以及抑制脂多糖向腸上皮移位以及炎癥的發(fā)生[31-32]。實驗組SIgA質(zhì)量濃度減少，表明攝入三氯蔗糖可引起腸道細(xì)菌毒素和病原體的大量產(chǎn)生，并且SIgA不能及時供給，從而影響微生物群落。

圖11 三氯蔗糖對小鼠腸黏膜SIgA的影響（n＝6）Fig.11 Effect of sucralose on intestinal mucosal SIgA in mice (n = 6)

2.5 三氯蔗糖對小鼠腸道組織形態(tài)的影響

用HE染色法對小鼠小腸組織進行研究，評估一般組織學(xué)特征。HE染色結(jié)果可以鑒定組織細(xì)胞壞死、水腫、變性和炎性細(xì)胞浸潤等異常病理學(xué)改變。小鼠腸道組織形態(tài)HE染色結(jié)果如圖12所示，灌胃6 周時，Control組和L-S組小腸組織結(jié)構(gòu)完整，絨毛上皮、黏膜下層腺體均完整并可見杯狀細(xì)胞；組織未見水腫、壞死、炎性細(xì)胞浸潤等病理變化。H-S組的組織黏膜下層局部可見纖維結(jié)締組織大量增生，間隙增大，伴有炎性細(xì)胞彌散性浸潤（黑色箭頭所示）；黏膜下層、增生的血管可見管腔擴張（黃色箭頭所示）。M-S組的組織內(nèi)可見部分腸絨毛壞死脫落（藍色箭頭所示）；黏膜層下部小腸腺體層可見部分腺體壞死，纖維組織增生（綠色箭頭所示）。

圖12 三氯蔗糖對小鼠小腸組織形態(tài)的影響Fig.12 Effect of sucralose on small intestinal morphology in mice

研究中一般通過圖像測量小腸絨毛長度、隱窩深度來評價腸道發(fā)育[33-34]。小鼠腸道絨毛越短表征消化吸收面積越小，且腸絨毛長度與腸道上皮細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。腸隱窩程度加深，表明細(xì)胞成熟率下降，分泌功能減弱。由圖13可知，灌胃6 周后，與Control組相比，H-S組小腸絨毛長度顯著變短（P＜0.05）；與Control組相比，H-S組、M-S組小腸隱窩深度顯著增加（P＜0.05），L-S組小腸隱窩深度與Control組差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，三氯蔗糖攝入對腸道機械屏障具有損傷作用，能夠改變腸道絨毛形態(tài)，降低腸道隱窩中上皮細(xì)胞的增殖力，削弱對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收力。

圖13 三氯蔗糖對小鼠小腸絨毛長度和小腸隱窩深度的影響Fig.13 Effect of sucralose on villi length and crypt depth of small intestine in mice

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的失調(diào)與消化系統(tǒng)疾病、代謝性疾病有一定的聯(lián)系[35-38]。研究人員發(fā)現(xiàn)，肥胖志愿者腸道內(nèi)放線菌門比例升高，其75%的腸道微生物基因來源于放線菌[39]，并且肥胖患者腸道內(nèi)的理研菌科、梭菌科相對豐度降低，這種降低與腸道菌群的ClpB樣基因表達呈正相關(guān)，而腸道菌群的ClpB樣基因表達與身體質(zhì)量指數(shù)、腰圍、總脂肪量呈負(fù)相關(guān)[40]。高脂飲食在增加了腸道通透性的同時，也顯著增加變形菌門和疣微菌門豐度[41]。也有研究表示，IBS患者腸道內(nèi)變形菌門豐度顯著升高[42]。本研究結(jié)果表明，三氯蔗糖的攝入使腸道中變形菌門、放線菌門的豐度顯著升高，高劑量的三氯蔗糖使擬桿菌門顯著升高；理研菌科、梭菌科、擬桿菌屬的相對豐度顯著降低。這意味著攝入三氯蔗糖可導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，腸道微生物豐富度與均勻度下降；其中，肥胖、糖尿病、腸道炎癥等代謝綜合征的特征菌群均有所增加或降低。

腸道微生態(tài)包括腸道微生物及其生存環(huán)境，受宿主基因、生活環(huán)境和飲食習(xí)慣等多方面因素影響。對腸道來說，這種環(huán)境是由宿主的基因和包括飲食在內(nèi)的外部環(huán)境因素共同決定的[43]。當(dāng)腸道微生態(tài)受到影響，會破壞腸道正常的生命活動，并且黏膜免疫系統(tǒng)異常激活會誘發(fā)腸道炎癥，導(dǎo)致組織損傷和上皮屏障功能失調(diào)，損害全身免疫穩(wěn)態(tài)。其次，經(jīng)過三氯蔗糖干預(yù)的腸道微生物組中耐藥基因增加，耐藥基因增加相應(yīng)耐藥細(xì)菌也將繁殖，最終可能導(dǎo)致更惡劣的腸道環(huán)境[44]。Abou-Donia等[9]的研究表明，大鼠經(jīng)12 周灌胃不同劑量含三氯蔗糖的代糖物質(zhì)（最高劑量為1 000 mg/（kgmb·d））后導(dǎo)致腸道中有益細(xì)菌數(shù)量明顯減少，此外，在12 周的恢復(fù)期內(nèi)，這種有益菌數(shù)量減少的現(xiàn)象一直持續(xù)。本研究發(fā)現(xiàn)，三氯蔗糖攝入后，腸道微生物豐度降低和結(jié)構(gòu)改變可導(dǎo)致小鼠免疫力下降，促炎因子IL-1β、TNF-α水平升高，腸通透性增加，腸道免疫屏障受損且SIgA水平降低，無法有效抵制腸道細(xì)菌毒素和病原體，致使腸道穩(wěn)態(tài)失衡。

與此同時，甜味刺激會通過改變腸道微生物群的組成，導(dǎo)致腸道病原體定植，從而影響能量獲取，并破壞微生物組向宿主和控制血糖的信號傳導(dǎo)[45]，進而增加糖尿病發(fā)病風(fēng)險。有研究表明，在小鼠模型中反復(fù)暴露人工甜味劑會通過改變腸道微生物組成而導(dǎo)致小鼠葡萄糖不耐受[46]。這也為后續(xù)研究三氯蔗糖是否導(dǎo)致糖尿病提供思路。

綜上所述，三氯蔗糖的大量攝入會存在一定的危害，改變腸道環(huán)境和腸道菌群的豐度和結(jié)構(gòu)，使腸道內(nèi)有害菌和有益菌的比例失衡，同時證明三氯蔗糖大量干預(yù)將會引發(fā)腸道組織發(fā)生病變、免疫屏障受損、炎癥水平升高，也可能引發(fā)機體血糖控制異常。綜上，本研究為三氯蔗糖對人體健康不良作用機制提供研究思路，同時為人工甜味劑的實際應(yīng)用提供指導(dǎo)及理論支持。