楊 霄，李小玲，劉伶俐，洪 波，萬譯文

(1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，中國 長沙 410153；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(長沙)，中國 長沙 410153)

五氯酚(pentachlorophenol，簡稱PCP，分子式C6HCl5O)，是一種氯代芳香族有機(jī)污染物，具有致癌、致畸、致突變的毒副作用，曾作為除草劑、殺菌劑、防腐劑及生物殺滅劑等在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛運(yùn)用[1,2]。五氯酚化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中易殘留、難降解，可通過生物富集進(jìn)入生物鏈；五氯酚的鈉鹽易溶于水，在水體中可廣泛擴(kuò)散，從而造成環(huán)境污染和生物蓄積[3,4]。由于毒性大、難降解及污染面廣，五氯酚已經(jīng)被中國等諸多國家列為優(yōu)先污染物黑名單[5]。我國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (GB 3838)中規(guī)定五氯酚的限量值為0.009 mg·L-1。開發(fā)簡單、快速及靈敏的五氯酚檢測(cè)方法對(duì)于環(huán)境監(jiān)測(cè)和污染物治理具有重要意義。目前，五氯酚的測(cè)定方法主要為氣相色譜法(GC)[6,7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)[8,9]、高效液相色譜法(HPLC)[10,11]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[12,13]以及電化學(xué)分析法[14,15]等，其中HPLC-MS/MS靈敏度高、選擇性好，且不需要繁雜的衍生操作，具有廣泛的適用性。地表水中的五氯酚含量通常為痕量或超痕量水平，研究者多采用固相萃取小柱(規(guī)格為3 mL或6 mL)萃取富集大體積的水樣(取樣量為500 mL或1 000 mL)，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物高倍數(shù)富集和預(yù)分離[7,11，12]。

固相萃取(solid-phase extraction，SPE)，是一種用于水樣或其他液體樣品中對(duì)目標(biāo)組分具有富集和凈化作用的經(jīng)典前處理技術(shù)[16]。與液液萃取相比，SPE具有易于操作、有機(jī)試劑用量少、萃取回收率高等優(yōu)點(diǎn)。但在實(shí)際應(yīng)用中，固相萃取技術(shù)也存在一定的局限性。由于地表水中五氯酚含量較低，需要增大上樣量進(jìn)行大體積固相萃取，以實(shí)現(xiàn)五氯酚的靈敏可靠檢測(cè)。然而傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù)一般適用于小體積萃取，對(duì)于大體積水樣，已有的研究報(bào)道主要采用以下兩種方式進(jìn)行固相萃?。?1)采用大體積樣品采樣器進(jìn)行固相萃取的上樣過程，但需購置專門的設(shè)備，費(fèi)用昂貴；(2)反復(fù)多次向固相萃取小柱內(nèi)注入液體樣品，但操作強(qiáng)度大且容易因操作不當(dāng)造成樣品之間的交叉污染。因此，必須針對(duì)大體積水樣固相萃取的特點(diǎn)，制作簡單可靠的萃取裝置，以實(shí)現(xiàn)對(duì)地表水中五氯酚的高效率萃取。

本研究采用商用的固相萃取小柱、轉(zhuǎn)接頭以及空柱管為基本元件，設(shè)計(jì)制作一種簡單、環(huán)保、低成本的大體積固相萃取裝置。并以水樣中五氯酚為檢測(cè)對(duì)象，評(píng)價(jià)該裝置的萃取富集性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；氮吹儀(美國Organomation公司)；漩渦混勻儀(美國SCILOGEX公司)；固相萃取儀(美國Supelco公司)；和泰實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)。HLB固相萃取小柱(6 mL/500 mg)、轉(zhuǎn)接頭(PP材質(zhì)，1，3，6 mL通用)、60 mL空柱管(PP材質(zhì)，內(nèi)徑26 mm，長度130 mm)均購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

五氯酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100±0.13 mg·L-1，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)；甲酸(LC-MS級(jí)，美國Sigma公司)；乙酸銨(HPLC級(jí)，美國Fluck公司)；甲醇(HPLC級(jí)，德國Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 大體積固相萃取裝置的組裝

圖1 大體積固相萃取裝置示意圖Fig. 1 Schematic illustration of the large-volume SPE device

取HLB固相萃取小柱、轉(zhuǎn)接頭及空柱管各一個(gè)，將其按順序依次連接后即組裝成大體積固相萃取裝置(見圖1)。將該裝置置于固相萃取儀上即可進(jìn)行批量固相萃取過程。每次實(shí)驗(yàn)完畢，固相萃取轉(zhuǎn)接頭和空柱管用中性洗滌劑清洗干凈，再用水和甲醇洗滌，于室溫下晾干后可反復(fù)使用。

1.3 樣品前處理

水樣用微孔濾膜 (0.45 μm)過濾后，取100 mL樣品，用甲酸調(diào)節(jié)pH至3左右。用5 mL甲醇和5 mL水活化HLB固相萃取小柱，然后將水樣分兩次轉(zhuǎn)移至大體積固相萃取裝置中，在抽真空的情況下過柱(保持流速3 mL·min-1)。待水樣全部過完后，將空柱管和轉(zhuǎn)接頭除去，向HLB小柱中加入5 mL水淋洗并抽干，用5 mL甲醇洗脫小柱，收集全部洗脫液，于45 ℃下氮吹至干。用1.00 mL 甲醇渦旋溶解殘留物，過0.22 μm 微孔濾膜后，供HPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)需要，臨用時(shí)準(zhǔn)確吸取一定量的五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg·L-1)，用甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度為1.0，2.5，5.0，10.0，25.0和100.0 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測(cè)定。采用外標(biāo)法定量，以被測(cè)組分的質(zhì)量濃度x(μg·L-1)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件 Waters Atlantis C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3.0 μm)；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流速為0.3 mL·min-1；流動(dòng)相A為水溶液(含2 mmol·L-1乙酸銨和0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸)；流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0 min, 40%B； 1.0～2.0 min, 40%～100%B； 2.0～6.0 min, 100%B； 6.0～8.0 min, 100%～40%B； 8.0～10.0 min, 40%B。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 (ESI)，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)；噴霧電壓為～3 kV；離子傳輸管溫度為300 ℃；霧化器溫度為300 ℃；鞘氣壓力設(shè)為40，輔助氣壓力設(shè)為10，碰撞氣壓力199.983 mPa。定量離子對(duì)為m/z264.7/264.7; 定性離子對(duì)m/z262.7/262.7，m/z266.7/266.7，m/z268.7/268.7;碰撞能量:～5 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖2 五氯酚的質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrum of PCP

五氯酚是一種氯代酚，其分子結(jié)構(gòu)為苯環(huán)上含有1個(gè)羥基和5個(gè)氯原子，容易失去質(zhì)子帶負(fù)電荷，在負(fù)離子模式 ([M—H]-) 下具有高檢測(cè)靈敏度。在ESI-模式下將五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 (μg·L-1)以流動(dòng)注射方式注入質(zhì)譜中，在一級(jí)質(zhì)譜掃描條件下獲得目標(biāo)物化合物的分子離子([M—H]-)，優(yōu)化噴霧電壓、離子傳輸管溫度、鞘氣壓力、輔助氣壓力等參數(shù)。然后采用二級(jí)質(zhì)譜掃描方式獲取母離子對(duì)應(yīng)的各特征子離子，發(fā)現(xiàn)五氯酚 [M—H]-對(duì)應(yīng)的特征子離子響應(yīng)很低，這可能是由于 [M—H]-在質(zhì)譜中很難被打碎。由于五氯酚結(jié)構(gòu)中含有5個(gè)氯原子，而氯元素存在35Cl與37Cl同位素，因此五氯酚的分子離子([M—H]-)共有氯的4個(gè)同位素母離子對(duì)。選取相對(duì)強(qiáng)度最大的母離子對(duì)264.7/264.7作為定量離子對(duì)，次強(qiáng)的母離子對(duì)(262.7/262.7，266.7/266.7，268.7/268.7)作為定性離子對(duì)，確定如1.5.2節(jié)所述的質(zhì)譜條件。五氯酚的質(zhì)譜圖如圖2所示。

2.2 色譜條件

圖3 不同流動(dòng)相條件下五氯酚的SRM色譜圖 Fig. 3 SRM chromatograms of PCP

五氯酚的 pKa為4.93，當(dāng)溶液的pH<4.93時(shí)，五氯酚的電離受到抑制，主要以分子形式存在。當(dāng)流動(dòng)相中添加甲酸時(shí)，溶液的pH值顯著降低，不僅能抑制五氯酚的電離，而且還可以減小目標(biāo)物與色譜柱殘留硅羥基的相互作用，從而改善色譜峰的峰形[3]。在流動(dòng)相中加入乙酸銨可以提高五氯酚的離子化效率，進(jìn)而增強(qiáng)靈敏度。本實(shí)驗(yàn)比較了不同色譜條件下五氯酚的SRM色譜圖(如圖3所示)，結(jié)果表明，流動(dòng)相采用0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液(含2 mmol·L-1乙酸銨)和甲醇時(shí)，五氯酚表現(xiàn)出最佳的靈敏度和色譜峰型。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

水樣中有毒有害物質(zhì)的含量很低，固相萃取可以對(duì)水樣中目標(biāo)物進(jìn)行有效富集，從而提高檢測(cè)靈敏度。固相萃取的條件影響目標(biāo)物的萃取回收率，實(shí)驗(yàn)過程必須對(duì)固相萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)主要考察了pH值、固相萃取柱的選擇、洗脫劑的選擇和洗脫劑的用量對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響。

2.3.1 水樣的pH值 五氯酚的pKa為4.93，在酸性溶液中電離受到抑制，主要以分子形態(tài)存在，在中性和堿性溶液中可電離成離子形態(tài)。水樣酸堿度的變化會(huì)直接影響五氯酚的分子解離和帶電荷狀況，進(jìn)而影響后續(xù)的HLB柱固相萃取效果。在100 mL空白水樣中添加0.2 mL五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·L-1)后，渦旋混勻，得到0.20 μg·L-1的加標(biāo)水樣。分別用甲酸或氨水將加標(biāo)水樣的pH調(diào)節(jié)至1，2，3，4，5，6，7，8和9。按1.3節(jié)方法處理后上機(jī)測(cè)試分析，比較水樣pH值對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響(見表1)。從表1可以看出，過低或過高的pH值均可造成目標(biāo)物的回收率降低，當(dāng)pH=3時(shí)，五氯酚的回收率最高，故本實(shí)驗(yàn)確定pH=3為水樣預(yù)處理?xiàng)l件。

表1 水樣pH對(duì)五氯酚回收率的影響(n=3)

2.3.2 固相萃取柱的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用C18(500 mg，6 mL)，ENVI-Chrom(250 mg，6 mL)及HLB(200 mg，6 mL)3種固相萃取柱對(duì)五氯酚的萃取效率進(jìn)行比較研究。結(jié)果如表2所示，采用HLB柱的回收率為95.6%，顯著高于采用C18柱和ENVI-Chrom柱的回收率，這說明HLB柱對(duì)五氯酚的富集效果優(yōu)于C18柱和ENVI-Chrom柱，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇HLB固相萃取柱。

表2 不同的固相萃取柱對(duì)五氯酚回收率的影響 (n=3)

為了進(jìn)一步探求不同品牌的HLB固相萃取柱對(duì)五氯酚萃取效率的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比3個(gè)主流品牌的HLB固相萃取柱(Waters Oasis, 200 mg, 6 mL; Simon Aldrich, 150 mg, 6 mL; CNW Poly-Sery, 200 mg, 6 mL;)對(duì)0.20 μg·L-1的加標(biāo)水樣中目標(biāo)物萃取回收率的影響(如表3所示)。結(jié)果表明，不同生產(chǎn)廠商的C18固相萃取柱對(duì)水樣中五氯酚的萃取率沒有顯著差異。

表3 不同品牌的HLB固相萃取柱對(duì)五氯酚回收率的影響 (n=3)

2.3.3 洗脫劑的選擇 選擇合適的洗脫劑將目標(biāo)物從吸附劑上洗脫下來是整個(gè)萃取過程的關(guān)鍵[17]。本實(shí)驗(yàn)考察了4種洗脫劑(甲醇、乙腈、二氯甲烷、丙酮)對(duì)五氯酚的洗脫效果(表4)。結(jié)果表明，甲醇的洗脫效果比乙腈、二氯甲烷和丙酮更好，目標(biāo)物回收率更高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為洗脫劑。

表4 不同的洗脫劑對(duì)五氯酚回收率的影響 (n=3)

圖4 洗脫劑用量對(duì)五氯酚回收率的影響 (n=3)Fig. 4 Effect of amount of eluents on recovery of PCP (n=3)

2.3.4 洗脫劑的用量 洗脫劑用量少不能將目標(biāo)物從固相萃取柱上洗脫下來，用量多則造成洗脫劑浪費(fèi)，因此，洗脫劑的用量選擇很重要。采用甲醇為洗脫劑，考察洗脫劑用量(2，3，4，5，6，7 mL)對(duì)萃取效率的影響(圖4)。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫劑的用量在2～5 mL范圍內(nèi)增加時(shí)，五氯酚的回收率顯著提高；當(dāng)洗脫劑用量為5 mL時(shí)，回收率達(dá)到最大；當(dāng)洗脫劑超過5 mL時(shí)，隨著洗脫劑用量增大回收率變化差異不大。為了縮短氮吹時(shí)間，提高工作效率，確?；厥章史€(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)選擇5 mL甲醇作為洗脫劑。

2.4 大體積固相萃取裝置萃取性能的研究

為了評(píng)價(jià)大體積固相萃取裝置的萃取性能，本實(shí)驗(yàn)分別采用1.3節(jié)自制的大體積固相萃取裝置和HLB小柱進(jìn)行五氯酚的固相萃取過程。具體評(píng)價(jià)方法為：取空白水樣，添加0.5 μg·L-1的五氯酚后，分成兩組，每組10個(gè)樣品。第一組樣品采用1.3節(jié)的方法進(jìn)行前處理，第二組樣品將大體積固相萃取裝置換成HLB小柱后按照相同的方法進(jìn)行前處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：第一組樣品五氯酚的平均回收率為96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.16%，第二組樣品五氯酚的平均回收率為94.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.79%。結(jié)果表明，兩組樣品測(cè)定結(jié)果的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差差異不大，表明采用大體積固相萃取裝置和HLB小柱進(jìn)行固相萃取時(shí)萃取性能均滿足檢測(cè)方法的要求。然而，與本實(shí)驗(yàn)開發(fā)的檢測(cè)方法相比，采用HLB小柱進(jìn)行固相萃取時(shí)，檢測(cè)過程勞動(dòng)強(qiáng)度更大，更繁瑣耗時(shí)(單個(gè)樣品約需上樣20次)，不利于大批量樣品的快速檢測(cè)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)自制的大體積固相萃取裝置，具有萃取性能佳、操作簡單、勞動(dòng)強(qiáng)度低的特點(diǎn)，適用于大體積水樣的固相萃取。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性范圍和靈敏度 按照1.4節(jié)的方法配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白水樣中添加低濃度的五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3節(jié)的方法處理后上機(jī)測(cè)定，以信噪比(S/N)為3和10分別確定五氯酚的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。五氯酚的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表5。由表5可知，五氯酚在1～100 μg·L-1的濃度內(nèi)線性關(guān)系良好，方法的檢出限和定量限低，表明本方法適用于水體中五氯酚的定量分析。

表5 五氯酚的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

圖5 池塘水樣添加樣品(0.5 μg·L-1)的SRM色譜圖Fig. 5 SRM chromatograms of the pond water sample spiked with PCP(0.5 μg·L-1)

2.5.2 方法的回收率和精密度 選取不含五氯酚的4種類型的地表水水樣作為空白樣品，分別添加0.02，0.5，5.0，10.0 μg·L-1的五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。空白水樣添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6，池塘水樣添加樣品(0.5 μg·L-1)的SRM色譜圖見圖5。從表6可以看出，五氯酚的回收率在76.5%～101.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%，表明該方法的回收率高，精密度好，適用于地表水中五氯酚的檢測(cè)。

表6 空白水樣添加回收率和方法精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)

2.6 與其他方法的比較

將本實(shí)驗(yàn)建立的大體積固相萃取結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)五氯酚的方法與已經(jīng)報(bào)道的檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比(見表7)可以發(fā)現(xiàn)，本方法具有線性范圍寬、檢出限低和回收率高等優(yōu)點(diǎn)。更為重要的是，本方法固相萃取過程中水樣取樣量更少，單次上樣量大，勞動(dòng)強(qiáng)度更低。這表明，本實(shí)驗(yàn)建立的方法具有較好的應(yīng)用前景，可以作為一種簡便、快速、高效的檢測(cè)水體中五氯酚含量的新方法。

表7 與其他檢測(cè)水樣中五氯酚的方法對(duì)比

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證方法的可靠性和實(shí)用性，采用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的前處理方法和儀器條件對(duì)湖南省某市的10個(gè)池溏、5個(gè)湖泊和5個(gè)水庫的水樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，池溏水樣中五氯酚的質(zhì)量濃度在0～1.05 μg·L-1，湖泊水樣中五氯酚為0～0.27 μg·L-1，水庫水樣中五氯酚的質(zhì)量濃度在0～0.11 μg·L-1，均未超過我國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量值0.009 mg·L-1。本方法靈敏度高，操作簡單高效，適合批量測(cè)定水樣中五氯酚的質(zhì)量濃度，可以為分析和監(jiān)測(cè)地表水中五氯酚的分布狀況和污染特征提供技術(shù)支持。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以自制的大體積固相萃取裝置對(duì)水樣中五氯酚進(jìn)行固相萃取，優(yōu)化了水樣的pH值、固相萃取柱的選擇、洗脫劑的選擇和用量等固相萃取條件，建立了一種大體積固相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水樣中五氯酚的方法。該方法具有靈敏度高、簡單、經(jīng)濟(jì)和高效的特點(diǎn)，適用于地表水中五氯酚的檢測(cè)，為開發(fā)大體積水樣固相萃取的新方法提供了思路。