姚孟佳,劉冬芹,王穎,陸兆新,呂鳳霞,趙海珍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

蠟樣芽胞桿菌是芽胞桿菌屬的一種G+、兼性厭氧、能形成芽胞的條件性致病菌[1],在環(huán)境中無(wú)處不在,可以從土壤、沉積物、水以及谷物、牛奶、香料、水果和蔬菜等不同類型的食物中分離出來(lái)[2]。蠟樣芽胞桿菌可產(chǎn)生多種毒素,其中不耐熱腸毒素和致吐毒素(Cereulide)最易引起食物中毒,主要包括嘔吐型和腹瀉型。雖然不耐熱腸毒素可以通過(guò)加熱使其失去毒性,但Cereulide卻很難通過(guò)熱處理滅活[3]。國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)對(duì)中國(guó)食源性疾病暴發(fā)的監(jiān)測(cè)資料顯示,由蠟樣芽胞桿菌引起的疾病占所有微生物食源病例的8.6%[4];2018年隨機(jī)采集的福建省126份外賣(mài)配送餐中,蠟樣芽胞桿菌總檢出率達(dá)20.6%,存在一定的衛(wèi)生安全隱患[5]。因此,對(duì)蠟樣芽胞桿菌的防控還需引起高度的重視。

甘油糖脂(glyceroglycolipid)是由親水性的糖基和親脂性的酰基甘油通過(guò)α-或β-糖苷鍵連接起來(lái)的一類重要的糖復(fù)合物,是植物、細(xì)菌,尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌雙層膜結(jié)構(gòu)中的常見(jiàn)組成成分。單半乳糖基二酰甘油(MGDG)、雙半乳糖基二酰甘油(DGDG)和磺基喹諾酮糖基二酰甘油(SQDG)是光合作用所必需的光合膜中3種主要的甘油糖脂[6-7]。甘油糖脂是一種非離子型表面活性劑,它的兩親性結(jié)構(gòu)使其具有多種生物活性。Degraeve-Guilbault等[8]研究表明SQDG能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),是一種有效的DNA聚合酶抑制劑;蔣志國(guó)等[9]從南瓜中分離得到多種半乳糖基甘油糖脂,并發(fā)現(xiàn)其抗炎能力顯著;Pongmuangmul等[10]從鱷嘴花葉片中提取了MGDG和DGDG,在臨床試驗(yàn)中成功用于治療皮膚炎癥、蚊蟲(chóng)叮咬及水痘狀皰疹等病變,并且能抑制單純皰疹病毒(HSV)的活性;Nakata等[11]從微桿菌中提取到MGDG,發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗氧化活性,能夠減少加熱和外部的H2O2引起的細(xì)胞死亡;Ahamed等[12]從顫藻中分離出MGDG,發(fā)現(xiàn)其抑菌效果優(yōu)于抗生素頭孢吡肟。因此,甘油糖脂可作為食品防腐劑用于食品防腐保鮮中,也可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗腫瘤等藥物,還可利用它的兩親性將其用于化妝品、洗滌等行業(yè),在醫(yī)藥、食品防腐、日化等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

本課題組前期研究了部分半乳糖基甘油糖脂的抗腫瘤、抑菌等生物活性[13-14],以及半乳糖基月桂酸甘油單酯的抑菌機(jī)制[15-16]。本試驗(yàn)通過(guò)研究一系列含有不同脂肪酸鏈數(shù)量及長(zhǎng)度(C8∶0— C18∶3)的半乳糖基甘油糖脂對(duì)不同蠟樣芽胞桿菌菌株的抑菌活性,初步探討其結(jié)構(gòu)與抑菌活性之間的關(guān)系,旨在為深入研究半乳糖基甘油糖脂的構(gòu)效關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5株蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus):CMCC 63301、ATCC 33019、ATCC 14579、ATCC 4342、ATCC 10987,購(gòu)買(mǎi)于上海北諾生物科技有限公司,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保存。半乳糖基甘油(純度>95%)、半乳糖基甘油糖脂(純度>90%)均由本實(shí)驗(yàn)室自制。LB培養(yǎng)基:酵母膏5.0 g,氯化鈉10.0 g,胰蛋白胨10.0 g,去離子水1 L,pH7.0,121 ℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SX-700高壓蒸汽滅菌器購(gòu)自日本TOMY公司;Orion 3 STAR pH計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;SW-CJ-IBU超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司;HYL-A全溫?fù)u瓶柜購(gòu)自太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;UV-2450紫外分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司;VarioskanTM多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 半乳糖基甘油糖脂的制備1)半乳糖基甘油的制備:采用Wei等[17]的方法制備半乳糖基甘油。2)半乳糖基甘油糖脂的制備:采用齊丹萍等[18]的方法并稍作修改。以半乳糖基甘油和9種游離脂肪酸(辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸)為底物,以固定化脂肪酶Novozyme 435為催化劑,通過(guò)酶促反應(yīng)合成不同結(jié)構(gòu)的半乳糖基甘油糖脂,再通過(guò)硅膠柱層析,分離純化得到18種半乳糖基甘油糖脂;利用薄層色譜(TLC)、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振波譜(NMR)等方法對(duì)半乳糖基甘油糖脂進(jìn)行分析鑒定。用甲醇將半乳糖基甘油糖脂溶解,并用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾除菌,制備不同濃度的半乳糖基甘油糖脂樣品溶液以備后續(xù)抑菌試驗(yàn)使用。

1.3.2 菌懸液的制備將實(shí)驗(yàn)室保存的5株蠟樣芽胞桿菌(CMCC 63301、ATCC 33019、ATCC 14579、ATCC 4342、ATCC 10987)分別接種到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h后,吸取1 mL菌液到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,在相同條件下再培養(yǎng)12 h,得到初始菌液。采用血球計(jì)數(shù)法和分光光度法相結(jié)合的方法,將初始菌液稀釋成106～107CFU·mL-1的菌懸液。

1.3.3 抑菌活性的測(cè)定采用Atsamnia等[19]的方法并稍作修改。以5株蠟樣芽胞桿菌為指示菌,采用打孔法測(cè)定18種半乳糖基甘油糖脂的抑菌圈直徑。將稀釋好的菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基表面,用直徑為6 mm的無(wú)菌打孔器打孔,向各孔內(nèi)分別加入5 mg·mL-1半乳糖基甘油糖脂溶液50 μL,以甲醇溶液為對(duì)照,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,用卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。試驗(yàn)平行3次,取其平均值。

1.3.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定以5株蠟樣芽胞桿菌為指示菌,采用傅瑞春等[20]的方法測(cè)定18種半乳糖基甘油糖脂的MIC和MBC。

1.3.5 抑菌率的測(cè)定用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算平板上的菌落數(shù),并按照以下公式計(jì)算半乳糖基甘油糖脂對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑菌率:

抑菌率=(陽(yáng)性對(duì)照菌落數(shù)-MIC濃度的菌落數(shù))/陽(yáng)性對(duì)照菌落數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與整理,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 半乳糖基甘油糖脂的分子結(jié)構(gòu)

通過(guò)硅膠柱層析法分離純化得到18種半乳糖基甘油糖脂,經(jīng)質(zhì)譜及核磁共振波譜分析鑒定,具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1和表1。

圖1 半乳糖基甘油糖脂分子結(jié)構(gòu)的基本骨架Fig.1 Basic skeleton of galactosylglyceride structure

表1 18種半乳糖基甘油糖脂分子中R1、R2的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式Table 1 Structural formula of R1 and R2 in 18 galactosylglycerides

2.2 半乳糖基甘油糖脂對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑菌活性

由表2可見(jiàn):半乳糖基肉豆蔻酸甘油單酯(7號(hào))的抑菌圈直徑最大,對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果最好,直徑均達(dá)16～20 mm,屬于高度敏感;其次是肉豆蔻酰化半乳糖基肉豆蔻酸甘油單酯(8號(hào))和半乳糖基月桂酸甘油糖脂(5、6號(hào)),它們對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果也較好,直徑均在中度敏感的11～15 mm;接著是半乳糖基癸酸甘油糖脂(3、4號(hào))、半乳糖基辛酸甘油糖脂(1、2號(hào))以及含不飽和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂(13～18號(hào)),它們對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的抑菌效果稍有差別,在6～10 mm或11～15 mm范圍內(nèi);抑菌效果較差的是含有長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的半乳糖基棕櫚酸甘油糖脂(9、10號(hào))和半乳糖基硬脂酸甘油糖脂(11、12號(hào)),它們對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌只是低度敏感或幾乎沒(méi)有抑菌效果。

表2 半乳糖基甘油糖脂對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of galactosylglycerides against five strains of Bacillus cereus

2.3 半乳糖基甘油糖脂對(duì)蠟樣芽胞桿菌的最小抑菌濃度

由表3可見(jiàn):7號(hào)對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的MIC值均為0.039 mg·mL-1,抑菌效果最好;5號(hào)對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的MIC值均為0.078 mg·mL-1;6號(hào)和8號(hào)的MIC值為0.078 mg·mL-1或0.156 mg·mL-1;1～4號(hào)以及13～18號(hào)對(duì)5個(gè)菌株的MIC值為0.313～5.000 mg·mL-1;9～12號(hào)抑菌效果較差。半乳糖基甘油糖脂的MIC結(jié)果與抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。

表3 半乳糖基甘油糖脂對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的最小抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentrations(MIC)of galactosylglycerides against five strains of B. cereus mg·mL-1

2.4 半乳糖基甘油糖脂對(duì)蠟樣芽胞桿菌的最小殺菌濃度

由表4可見(jiàn):7號(hào)對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的MBC值均為0.039 mg·mL-1,與MIC值相同,說(shuō)明其對(duì)蠟樣芽胞桿菌的殺菌效果相當(dāng)好;5號(hào)和6號(hào)的MBC值大于其MIC值,殺菌效果不如8號(hào);1～4號(hào)以及13～18號(hào)對(duì)5個(gè)菌株的MBC值為0.625～5.000 mg·mL-1;9～12號(hào)對(duì)5個(gè)菌株的MBC值為5.000～20.000 mg·mL-1或大于20.000 mg·mL-1,抑菌活性較低。

表4 半乳糖基甘油糖脂對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的最小殺菌濃度Table 4 Minimum bactericidal concentration(MBC)of galactosylglycerides against five strains of B. cereus mg·mL-1

2.5 半乳糖基甘油糖脂對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑制作用

由表5可見(jiàn):7號(hào)的抑菌率最高,然后是8號(hào),兩者對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的抑菌率均在99%以上;之后是5和6號(hào),對(duì)5株菌的抑菌率均在97%以上;1～4號(hào)以及13～18號(hào)對(duì)5株菌的抑菌率也都在96%以上;雖然9～12號(hào)的抑菌效果較差,但其抑菌率也均在95%以上。9～12號(hào)對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌抑菌率的差異比較大,例如9號(hào)對(duì)菌株ACTT 4342完全沒(méi)有抑制作用,但對(duì)其他4株菌的抑菌率均在95%以上;10號(hào)對(duì)CMCC 63301和ATCC 33019這2株菌表現(xiàn)出較高的抑菌率,對(duì)其他3株菌卻沒(méi)有抑制作用。同一物質(zhì)對(duì)不同蠟樣芽胞桿菌菌株表現(xiàn)出的抑菌率差異如此之大,其中原因需要進(jìn)一步的試驗(yàn)去探究。

表5 半乳糖基甘油糖脂對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的抑菌率Table 5 Inhibition rate of galactosylglycerides against five strains of B. cereus %

2.6 半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性與其結(jié)構(gòu)因素間的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果表明,半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性與其所含脂肪酸鏈的不飽和度呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.564,P<0.01),與其所含脂肪酸鏈的長(zhǎng)度不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系(P>0.05),而是存在截?cái)?cut-off)效應(yīng)。隨著脂肪酸鏈長(zhǎng)從C8增加到C14,半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性增加,而脂肪酸鏈長(zhǎng)進(jìn)一步增加至C16和C18,則會(huì)減弱其抑菌活性。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,半乳糖基肉豆蔻酸甘油單酯在18種半乳糖基甘油糖脂中的抑菌活性最強(qiáng),其對(duì)5株蠟樣芽胞桿菌的MIC和MBC值均為0.039 mg·mL-1,抑菌率均在99%以上;其余結(jié)構(gòu)的半乳糖基甘油糖脂也分別具有一定的抑菌活性。Ahamed等[12]研究發(fā)現(xiàn)MGDG能抑制大腸桿菌等產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌生長(zhǎng),且MIC值為0.1 mg·mL-1;Diao等[16]研究發(fā)現(xiàn)半乳糖基月桂酸甘油單酯對(duì)蠟樣芽胞桿菌的MIC值為0.156 mg·mL-1。雖然目前關(guān)于半乳糖基甘油糖脂應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道較少,但已有的研究結(jié)果均表明其有良好的抑菌活性。因此,半乳糖基甘油糖脂可作為一種具有發(fā)展?jié)摿Φ纳锟咕鷦?/p>

本研究中,含有中鏈脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂的抑菌效果好;半乳糖基甘油單酯的抑菌活性與?；肴樘腔视蛦熙サ囊志钚灾g存在差別;在含有長(zhǎng)鏈脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂中,含有不飽和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性高于含有飽和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂。Colombo等[21]發(fā)現(xiàn)脂肪酸鏈的長(zhǎng)度影響半乳糖基甘油單酯的活性。本試驗(yàn)中半乳糖基甘油糖脂的脂肪酸鏈長(zhǎng)度影響其抑菌活性的結(jié)果與之相一致。Ferrer等[22]發(fā)現(xiàn)麥芽糖月桂酸單酯對(duì)芽胞桿菌有良好的抑菌活性,而麥芽糖月桂酸二酯則無(wú)明顯的抑菌效果。本試驗(yàn)中半乳糖基甘油單酯的抑菌活性大多高于酰化半乳糖基甘油單酯的結(jié)果與之相一致,說(shuō)明半乳糖基甘油糖脂中脂肪酸鏈的數(shù)量不同,會(huì)使其抑菌活性產(chǎn)生差異。Colombo等[23]研究發(fā)現(xiàn),含有不飽和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂的抗腫瘤活性強(qiáng)于含有飽和脂肪酸的半乳糖基甘油糖脂的活性。本試驗(yàn)中含有不飽和脂肪酸(C18∶1— C18∶3)的半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性高于含有飽和脂肪酸(C18∶0)的半乳糖基甘油糖脂的結(jié)果與之相同,表明脂肪酸鏈長(zhǎng)度相同但飽和度不同,同樣會(huì)影響半乳糖基甘油糖脂的活性。Ahamed等[12]研究發(fā)現(xiàn),半乳糖基棕櫚酸甘油二酯對(duì)大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)的MIC值和MBC值均為0.1 mg·mL-1。而本試驗(yàn)合成的?；肴樘腔貦八岣视蛦熙?duì)蠟樣芽胞桿菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)的MBC值遠(yuǎn)大于0.1 mg·mL-1,表明即使脂肪酸鏈組成和數(shù)目相同,但脂肪酸鏈的分布位置不同也會(huì)導(dǎo)致半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性甚至抑菌譜發(fā)生很大的改變。S?rensen等[24]發(fā)現(xiàn)不同鏈長(zhǎng)阿魏酸烷基酯的抗氧化活性與烷基鏈長(zhǎng)之間存在截?cái)嘈?yīng)。本研究也發(fā)現(xiàn)半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性與其所含脂肪酸鏈的長(zhǎng)度之間存在截?cái)嘈?yīng),說(shuō)明脂肪酸鏈長(zhǎng)對(duì)半乳糖基甘油糖脂抑菌活性的影響比較復(fù)雜。

不同結(jié)構(gòu)的半乳糖基甘油糖脂的抑菌活性不同,可能與其自身的疏水作用、立體結(jié)構(gòu)等有關(guān)。張希等[25]利用定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)方法研究了甘油單酯對(duì)蠟樣芽胞桿菌的抑菌活性與其結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)效關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),直線型脂肪酸鏈的C12或C13區(qū)域周?chē)嬖诖篌w積結(jié)構(gòu),而碳鏈大于C14區(qū)域周?chē)淮嬖诖篌w積結(jié)構(gòu)時(shí),可以增強(qiáng)甘油單酯的抑菌活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明,半乳糖基甘油糖脂所含脂肪酸鏈的長(zhǎng)度、數(shù)量以及不飽和度的不同都會(huì)影響其抑菌活性,原因可能是不同結(jié)構(gòu)的半乳糖基甘油糖脂具有不同的親、疏水性和空間結(jié)構(gòu)等分子特性。下一步將利用QSAR方法對(duì)半乳糖基甘油糖脂的結(jié)構(gòu)與其抑菌活性的定量構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行詳細(xì)研究。