邢菲,方曉敏,楊曉陽(yáng),付言峰,陳哲,王麗,涂楓,任守文,李碧俠,陳杰,趙為民*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái),江蘇 南京 210014)

集約化、工廠化養(yǎng)豬已成為當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展主流。隨著養(yǎng)殖密度的增加,豬容易受到飼養(yǎng)環(huán)境中致病菌的感染(如副豬嗜血桿菌、霍亂沙門(mén)氏菌),這些致病菌可通過(guò)其細(xì)胞壁釋放的LPS導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量炎癥因子,出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng),進(jìn)而嚴(yán)重影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、生產(chǎn)性能甚至造成死亡[1],嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬生產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

先天免疫系統(tǒng)是宿主防御病原體感染的第一道防線。它利用位于不同細(xì)胞亞區(qū)的模式識(shí)別受體(PRR)(例如Toll樣受體,TLR;NOD樣受體,NLR)來(lái)識(shí)別微生物產(chǎn)物(例如脂多糖,LPS)并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò),引發(fā)炎癥反應(yīng)以消除病原體[2-3],而免疫應(yīng)答基因(immune response gene,IRG)的動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)表達(dá)在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[4]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200 bp的非編碼RNA。自從鑒定出2個(gè)lncRNAH19和Xist基因以來(lái)[5-6],lncRNA被認(rèn)為在細(xì)胞各個(gè)生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用,包括X染色體失活[7-9]、印記基因表達(dá)[10]、重編程[11]、細(xì)胞凋亡[12]、自噬[13]和腫瘤發(fā)生[14]。近年來(lái),lncRNA在調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。例如,lincRNA-Cox2(lincRNA,基因間lncRNA)可調(diào)節(jié)三酰脂肽(Pam3CSK4)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和NOD樣受體家族蛋白3(NLRP3)炎性小體[15-16]。lncRNA-NEAT1在poly I∶C刺激下介導(dǎo)白細(xì)胞介素8(IL-8)的轉(zhuǎn)錄激活[17]。lncRNA-Mirt2與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)結(jié)合并限制促炎因子的表達(dá)[18]。lncRNA已成為IRG表達(dá)調(diào)控的重要調(diào)節(jié)因子,從lncRNA的層次解析IRG的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于深入理解LPS誘導(dǎo)的豬機(jī)體炎癥反應(yīng)的機(jī)制,為提供更加有效的防控措施提供靶標(biāo)。

本課題組前期研究鑒定了一批在豬巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的差異表達(dá)lncRNA[19],發(fā)現(xiàn)上調(diào)最大倍數(shù)之一的lincRNA-CXCL6位于炎癥因子CXCL6和CXCL8之間,其在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中顯著上調(diào),表明該lncRNA可能在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中具有重要作用。

本研究探討了豬lincRNA-CXCL6的表達(dá)模式以及l(fā)incRNA-CXCL6在LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制,為防御由細(xì)菌性疾病引起的炎癥損傷提供新的基因研究素材。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DH5a感受態(tài)菌株購(gòu)于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;蘇紫豬成年組織樣品來(lái)源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地;豬原代肺泡巨噬細(xì)胞和質(zhì)粒載體pcDNA3.1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所動(dòng)物品種改良和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;RAW264.7細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒均購(gòu)于百泰克;DNA聚合酶、RACE試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4連接酶、pMD19-T載體、qPCR試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司;ERK1/2與p-ERK1/2抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)于CST公司;細(xì)胞質(zhì)和核RNA分離試劑盒購(gòu)自Norgen Biotek公司;DNA純化回收試劑盒購(gòu)于Zymo Research公司;無(wú)內(nèi)霉毒素質(zhì)粒試劑盒購(gòu)于Omega公司;BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、蛋白marker、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(BeyoECL Plus)、PAGE預(yù)制膠均購(gòu)于碧云天公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于武漢博士德公司;聚偏氟乙烯(PVDF)購(gòu)自Millipore;青(鏈)霉素、胎牛血清、遺傳霉素(G418)和Lipofectamine?3000購(gòu)于Thermo Fisher公司。基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成;引物合成與測(cè)序驗(yàn)證由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。主要儀器有蛋白凝膠電泳儀(Bio-Rad)、紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000,Thermo Fisher)、化學(xué)發(fā)光成像儀(LAS-4000,GE)、qPCR儀(ABI 7500,Thermo Fisher)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 3′與5′cDNA末端快速擴(kuò)增lincRNA-CXCL6的3′和5′末端擴(kuò)增參照SMARTer RACE Kit(Thermo Fisher)說(shuō)明書(shū)。其3′末端的特異引物3′GSP:5′-TCAGGATGGCAGAGGAGCTCACAGCA-3′。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共30個(gè)循環(huán)。lincRNA-CXCL6的5′末端擴(kuò)增如下:cDNA第1鏈先進(jìn)行dC-tailing,回收純化后,利用引物5P(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-GCGGGGGGGGGG-3′)和5′末端的特異引物5′GSP(5′-TCACCCCTGTGGCCTGGATT-CAGTCT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,65 ℃(每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃)45 s,72 ℃ 50 s,20個(gè)循環(huán);95 ℃ 1 min,56 ℃ 45 s,72 ℃ 50 s,20個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選RAW264.7細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),每2 d傳代1次。由GenScript公司合成全長(zhǎng)的lincRNA-CXCL6,再將其亞克隆到BamHⅠ和EcoRⅠ之間的pcDNA3.1中。將pcDNA3.1和pcDNA3.1-lincRNA-CXCL6表達(dá)載體線性化,并使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后,將細(xì)胞1∶3傳代后,加入含500 μg·mL-1G418的全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。每3 d換1次液,培養(yǎng)14 d左右獲得穩(wěn)定細(xì)胞。用PCR分析篩選表達(dá)lincRNA-CXCL6和pcDNA3.1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄與qPCR反轉(zhuǎn)錄參照PrimeScriptTMRT Master Mix說(shuō)明書(shū),取500 ng總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,生成cDNA。將cDNA用滅菌水稀釋3倍,-20 ℃保存。qPCR參照SYBRPremixExTaqTMⅡ說(shuō)明書(shū)。體系如下:10 μL SYBRPremixExTaqⅡ,上、下游引物各0.5 μL,0.4 μL ROX,2 μL cDNA,補(bǔ)水至20 μL。qPCR程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù),以次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷?；D(zhuǎn)移酶(HPRT)基因作為內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)的引物序列信息Table 1 Primer sequence information in this study

1.3.4 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核RNA的提取參照Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit(Norgen Biotek)說(shuō)明,簡(jiǎn)要步驟如下:用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗6孔板細(xì)胞,然后每孔加入200 μL裂解液,置于冰上 5 min,收集細(xì)胞,12 000 r·min-1離心10 min。上清液(包含細(xì)胞質(zhì)RNA)和沉淀(包含細(xì)胞核RNA)分別加入200和400 μL buffer SK,分別混勻,再分別加入200 μL無(wú)水乙醇,混勻,轉(zhuǎn)入收集管,8 000 r·min-1離心1 min。2管分別加入漂洗液A洗滌后,用洗脫液洗脫,分別得到細(xì)胞質(zhì)RNA和細(xì)胞核RNA。

1.3.5 文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提取試驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的總RNA,利用Agilent 2 100評(píng)估其完整性,選取RNA完整性指數(shù)(RIN)大于 9的樣品用于測(cè)序。利用polyT寡核苷酸的磁珠從總RNA提取polyA+RNA,使用Illumina的NEB Next UltraTMRNA試劑盒構(gòu)建RNA-seq庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序后,通過(guò)除去銜接序列ployN和低質(zhì)量reads,獲取clean reads,用于下游分析。小鼠參考基因組(GRCm38)和Ensemble(Ensemble 97)分別用于reads的比對(duì)和基因注釋。

1.3.6 差異基因的鑒定利用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)比對(duì)讀取的片段(fragments per kilobase per million,FPKM)法來(lái)計(jì)算基因的表達(dá)水平。使用DESeq R軟件包對(duì)2組基因表達(dá)進(jìn)行差異分析。錯(cuò)誤發(fā)生率<0.05(false discovery rate,FDR)和log2[倍數(shù)變化]≥1設(shè)置為差異表達(dá)基因的條件。

1.3.7 GO與KEGG分析使用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)[20]對(duì)差異基因進(jìn)行GO(gene ontotogy)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)pathway分析,研究這些差異基因參與的生物學(xué)功能。篩選條件選擇Count=2,FDR<0.05,富集倍數(shù)(fold enrichment)≥1.5。

1.3.8 Western blot分析使用RIPA裂解液于冰上裂解細(xì)胞30 min,然后4 ℃、12 000 r·min-1離心 10 min,取上清液,用BCA方法測(cè)定蛋白濃度。將30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移至PVDF。用牛血清白蛋白(BSA)封閉后,將膜與一抗在4 ℃孵育過(guò)夜。其中:ERK1/2抗體(p44/42 MAPK兔單抗,CST),1∶1 000;p-ERK1/2 抗體(phospho-p44/42 MAPK,Thr202/Tyr204,CST),1∶2 000;GAPDH抗體(兔單抗,CST),1∶1 000。一抗孵育結(jié)束后,用TBST洗3次,二抗[羊抗兔IgG(H+L),HRP conjugate,1∶2 000,Proteintech]室溫孵育2 h,然后加ECL試劑進(jìn)行發(fā)光顯影,使用ImageQuant LAS 4000系統(tǒng)成像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 lincRNA-CXCL6的基因結(jié)構(gòu)

該lncRNA位于豬第8號(hào)染色體上,定位于CXCL8和CXCL6基因之間(圖1-A),因而被命名為lincRNA-CXCL6。使用cDNA末端的5′和3′快速擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)lincRNA-CXCL6的5′端長(zhǎng)度為473 bp,3′端長(zhǎng)度為865 bp(圖1-B),總長(zhǎng)度為985個(gè)核苷酸(nt),其中包含2個(gè)外顯子和29個(gè)poly A(圖1-C)。使用開(kāi)放閱讀框查找(ORFfinder)發(fā)現(xiàn),lincRNA-CXCL6并不具有蛋白編碼基因超過(guò)300 nt的典型閱讀框(圖1-D)。

2.2 lincRNA-CXCL6的表達(dá)模式

LPS和Pam2CSK4刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞后明顯上調(diào)了lincRNA-CXCL6的表達(dá)(圖2-A)。此外,隨著LPS刺激時(shí)間的增加,lincRNA-CXCL6的表達(dá)量也急劇升高,16 h的表達(dá)量顯著高于0和6 h(圖2-B)。利用qPCR檢測(cè)lincRNA-CXCL6在成年豬組織的表達(dá)水平,結(jié)果(圖2-C)顯示,lincRNA-CXCL6僅在肺和腸中有微弱表達(dá),而在其他組織檢測(cè)不到表達(dá)。利用qPCR檢測(cè)了lincRNA-CXCL6在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核RNA中的表達(dá)分布,結(jié)果(圖2-D)顯示,lincRNA-CXCL6在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá),并且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,作為質(zhì)控定位于細(xì)胞質(zhì)的核糖體蛋白L30(RPL30)主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,而定位于細(xì)胞核的核旁斑組裝轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)主要表達(dá)于細(xì)胞核中。

2.3 lincRNA-CXCL6在LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用

為了研究lincRNA-CXCL6在調(diào)控LPS介導(dǎo)的炎癥中的作用,本試驗(yàn)構(gòu)建了穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1(陰性對(duì)照組)和pcDNA3.1-lincRNA-CXCL6(試驗(yàn)組)的RAW264.7細(xì)胞系。PCR結(jié)果(圖3-A)顯示,在DNA水平上陰性對(duì)照和試驗(yàn)組分別整合了pcDNA3.1和pcDNA3.1-lincRNA-CXCL6的序列。RT-qPCR結(jié)果(圖3-B)顯示,相對(duì)于陰性對(duì)照組,試驗(yàn)組能穩(wěn)定表達(dá)lincRNA-CXCL6。利用LPS刺激陰性對(duì)照組和試驗(yàn)組0、2和6 h后,檢測(cè)炎癥因子IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)。結(jié)果(圖4)表明,lincRNA-CXCL6的表達(dá)在2和6 h抑制了IL-1β和IL-6mRNA的轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步探索lincRNA-CXCL6調(diào)控LPS介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制,對(duì)LPS刺激陰性對(duì)照和試驗(yàn)組6 h后的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)分析。RNA-Seq的reads數(shù)據(jù)(表2)顯示:與陰性對(duì)照組相比,試驗(yàn)組中有104個(gè)基因上調(diào),165個(gè)基因下調(diào)(log2[倍數(shù)變化]≥1,FDR<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),免疫應(yīng)答基因(immune response gene,IRG)在104個(gè)上調(diào)基因中很少見(jiàn),而明顯存在于165個(gè)下調(diào)基因中,比如炎癥基因IL-1β、IL-12β、IL-6和趨化因子CCL5、CXCL16、CCL17。通過(guò) RT-qPCR 驗(yàn)證了RNA-Seq中3個(gè)上調(diào)的基因(HAP1、HEBP2和FLRT2)和3個(gè)下調(diào)的基因(IL-12β、CCL17和CCL22)(圖5)。

圖4 lincRNA-CXCL6對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-1β(A)和IL-6(B)mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of lincRNA-CXCL6 in regulating the mRNA expression of IL-1β(A) and IL-6(B)induced by LPS

表2 RNA-Seq reads參數(shù)Table 2 Parameter of RNA sequencing reads

圖5 差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證Fig.5 Validation of differential expressed genes by RT-qPCRA. 差異基因的qPCR驗(yàn)證;B. 測(cè)序數(shù)據(jù)與qPCR結(jié)果的比對(duì)。A. qPCR verification of differential expressed genes;B. Comparison of sequencing data with qPCR results.

對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn),104個(gè)上調(diào)的基因在生物過(guò)程(BP)中沒(méi)有明顯富集(FDR<0.05,富集倍數(shù)≥1.5)。165個(gè)下調(diào)的基因富集到8個(gè)生物學(xué)過(guò)程(BP),包括炎癥反應(yīng)(17個(gè))、ERK1和ERK2的級(jí)聯(lián)反應(yīng)(11個(gè))、T細(xì)胞增殖的正調(diào)控(8個(gè))、細(xì)胞對(duì)干擾素γ的響應(yīng)(8個(gè))、細(xì)胞對(duì)脂多糖的應(yīng)答(11個(gè))、免疫應(yīng)答(12個(gè))、中性粒細(xì)胞趨化性(7個(gè))和在沒(méi)有配體的情況下的外在凋亡信號(hào)通路(6個(gè))(圖6)。

圖6 下調(diào)差異基因的基因本體(GO)分析Fig.6 Gene ontology(GO)analysis of downregulated differentially expressed genes

2.4 lincRNA-CXCL6調(diào)控LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制

圖8 ERK1/2信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β和CCL17表達(dá)的影響Fig.8 The effect of ERK1/2 pathways in regulation of LPS-induced IL-1β and CCL17 expression level A. LPS刺激對(duì)ERK1/2的磷酸化影響;B. ERK1/2抑制劑(U0126)對(duì)ERK1/2的磷酸化影響;C. ERK1/2磷酸化抑制劑(U0126)對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-1β的表達(dá)影響;D. ERK1/2磷酸化抑制劑(U0126)對(duì)LPS誘導(dǎo)的CCL17的表達(dá)影響。A. Effect of LPS stimulation on phosphorylation of ERK1/2;B. Effect of ERK1/2 inhibitor(U0126)on phosphorylation of ERK1/2;C. Effect of ERK1/2 phosphorylation inhibition(U0126)on the expression of IL-1β induced by LPS;D. Effect of ERK1/2 phosphorylation inhibition(U0126)on the expression of CCL17 induced by LPS.

檢測(cè)了試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組在LPS刺激前、后ERK1/2信號(hào)通路的激活差異。結(jié)果(圖7)顯示:與陰性對(duì)照相比,lincRNA-CXCL6過(guò)表達(dá)減少了LPS刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化(p-ERK1/2)水平。而總ERK1/2蛋白水平在2組中沒(méi)有差異(GAPDH為內(nèi)參蛋白)。進(jìn)一步檢驗(yàn)ERK1/2通路是否調(diào)控LPS誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果表明:LPS刺激細(xì)胞15和30 min后,ERK1/2蛋白迅速磷酸化(圖8-A),而ERK1/2抑制劑(U0126)則抑制了LPS誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化(圖8-B)。我們檢測(cè)了在抑制ERK1/2信號(hào)通路前、后炎癥相關(guān)因子IL-1β和CCL17的表達(dá)量變化。結(jié)果表明,LPS刺激后IL-1β和CCL17顯著上調(diào),當(dāng)ERK1/2信號(hào)通路被抑制后,IL-1β和CCL17顯著下調(diào)(圖8-C、D)。

3 討論

本文闡述了豬lincRNA-CXCL6在調(diào)節(jié)LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用。在靜止?fàn)顟B(tài)下,豬巨噬細(xì)胞中的lincRNA-CXCL6水平相對(duì)較低。在LPS刺激下,lincRNA-CXCL6表達(dá)在6 h時(shí)顯著增加,并在16 h達(dá)到峰值,這表明lincRNA-CXCL6的表達(dá)存在時(shí)間依賴(lài)性,而且是LPS誘導(dǎo)的lncRNA。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,LPS和Pam2CSK4刺激都可以誘導(dǎo)lincRNA-CXCL6的表達(dá)。研究表明,先天性免疫相關(guān)的lncRNA可被多種病原體相關(guān)分子模式(PAMP)誘導(dǎo)[15]。此外,功能性的lncRNA傾向于在特定組織中表達(dá)[21-22]。對(duì)于lincRNA-CXCL6,其表達(dá)僅在豬的肺和腸組織中檢測(cè)到,也顯示出lincRNA-CXCL6的組織表達(dá)特異性。這些結(jié)果表明,lincRNA-CXCL6可能參與了先天免疫反應(yīng)的調(diào)控。

LPS是先天性免疫中研究最深入的病原相關(guān)分子。它與Toll 樣受體4(TLR4)結(jié)合并通過(guò)釋放大量促炎性因子來(lái)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[2,23-24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,lincRNA-CXCL6的過(guò)表達(dá)可以抑制LPS刺激誘導(dǎo)的IL-1β和IL-6表達(dá),說(shuō)明lincRNA-CXCL6在調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎癥中發(fā)揮作用。在由LPS刺激的試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中,lincRNA-CXCL6下調(diào)了許多炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。對(duì)這些下調(diào)差異基因GO分析發(fā)現(xiàn),它們顯著富集于炎癥反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的應(yīng)答和免疫反應(yīng)。這些結(jié)果表明lncRNA-CXCL6可通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄來(lái)負(fù)調(diào)控LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)lincRNA-CXCL6過(guò)表達(dá)下調(diào)的基因中的炎癥相關(guān)基因顯著富集于ERK1和ERK2信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),因此我們探索lncRNA-CXCL6是否通過(guò)ERK1/2途徑調(diào)節(jié)LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)是絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途徑之一,參與多種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控[25]。在先天性免疫中,ERK1/2的磷酸化可以激活ERK1和ERK2信號(hào)級(jí)聯(lián),并在LPS誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)和病毒感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用[26-29]。lincRNA-CXCL6可以抑制LPS刺激后的ERK1/2磷酸化,其過(guò)表達(dá)抑制了LPS誘導(dǎo)的IL-1β和CCL17表達(dá)。此外,抑制ERK1/2磷酸化也降低了炎癥相關(guān)因子IL-1β和CCL17的表達(dá),表明lincRNA-CXCL6可通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路抑制LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。綜上所述,lincRNA-CXCL6可被LPS快速誘導(dǎo)表達(dá),可通過(guò)抑制ERK1/2磷酸化來(lái)減緩LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá),表明其可通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路抑制LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。