華皓坤,劉文斌,劉婷燕,毛晶,戴永軍,米海峰,黃洋洋,吳業(yè)陽,蔣廣震*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095;2.通威股份有限公司,四川 成都 610041)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis),也稱河蟹,是東亞特別是中國最受歡迎的淡水水產(chǎn)品之一,因其獨(dú)特的鮮味和良好的營養(yǎng)價(jià)值而廣受消費(fèi)者喜愛。近年來,中華絨螯蟹養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大,市場(chǎng)需求穩(wěn)步增加,到2019年,中國成蟹的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到77.87萬t[1]。然而,在飼料使用方面,卻不盡如人意,目前主要采用投喂冰魚和飼料原料(小麥、玉米、黃豆和餅粕類等)的養(yǎng)殖方式[2]。這些傳統(tǒng)飼料來源不穩(wěn)定,質(zhì)量不可控,易攜帶致病菌,惡化池塘水質(zhì),導(dǎo)致病害爆發(fā)、成蟹品質(zhì)不穩(wěn)定和養(yǎng)殖效益低等問題,嚴(yán)重制約了中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[3]。但是,很多養(yǎng)殖者認(rèn)為投喂冰魚養(yǎng)殖的河蟹味道更鮮美,并以此誤導(dǎo)消費(fèi)者,給產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來了巨大的隱患。目前,雖然關(guān)于投喂配合飼料和冰魚對(duì)河蟹生長、品質(zhì)和風(fēng)味影響的研究已有報(bào)道[4],但針對(duì)不同投喂對(duì)河蟹生長、氨基酸代謝和胺類物質(zhì)沉積的研究仍較少。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是蛋白激酶家族成員之一,mTOR通路是調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄的重要通路[5-6]。mTOR可形成mTORC1(mTOR complex 1)和mTORC2(mTOR complex 2)2種復(fù)合物,其中,磷酸化后的AKT能使mTORC2在Ser473位點(diǎn)磷酸化從而活化,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,而mTOR磷酸化下游的4E-BP則可釋放出翻譯起始因子,并與其他翻譯起始因子結(jié)合啟動(dòng)5′cap-mRNA的翻譯[7-8]。周群蘭[5]對(duì)團(tuán)頭魴研究發(fā)現(xiàn),向植物蛋白源中添加氨基酸可以上調(diào)mTOR基因的表達(dá)量,并下調(diào)4E-BP基因的表達(dá)量。

胺類物質(zhì),也稱生物胺,常被作為水產(chǎn)品安全的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo),同時(shí)也是水產(chǎn)品重要的呈味物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì),肌肉中胺類物質(zhì)的種類和數(shù)量與中華絨螯蟹風(fēng)味息息相關(guān)。胺類物質(zhì)按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為脂肪族(腐胺、尸胺、精胺和亞精胺等)、芳香族(酪胺、苯甲胺等)和雜環(huán)族(組胺、色胺等)。根據(jù)其組成成分又可分為單胺(組胺、酪胺、苯甲胺等)和多胺(尸胺、腐胺、精胺和亞精胺等)[9]。其中,單胺具有多種生理調(diào)節(jié)功能[10-12],多胺中的尸胺、精胺、亞精胺可有效阻止不飽和脂肪酸的氧化,清除自由基[9,11,13-14]。胺類物質(zhì)在水產(chǎn)品肌肉中呈現(xiàn)出腥味等多種特殊風(fēng)味,但是在不同水產(chǎn)品種類間,胺類物質(zhì)沉積規(guī)律有很大的差異。一般來說,胺類物質(zhì)廣泛存在于魚、蝦、蟹等各種水產(chǎn)品體內(nèi),但是不同種類水產(chǎn)品肌肉中胺類物質(zhì)的含量和種類不同,目前普遍接受的觀點(diǎn)是海水水產(chǎn)品的胺類物質(zhì)含量高于淡水產(chǎn)品[15-16]。這也導(dǎo)致關(guān)于水產(chǎn)品體內(nèi)胺類物質(zhì)沉積的研究集中在海水種類,而淡水種類的研究較少[17],食物中胺類物質(zhì)是否在河蟹體內(nèi)沉積尚少見報(bào)道[9]。在Tapia-Salazar等[18]對(duì)蝦的研究中,飼料中添加組胺并不影響蝦的飼料消耗、飼料轉(zhuǎn)化率和存活率,且對(duì)蝦的生長性能不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。鑒于此,本試驗(yàn)通過對(duì)比投喂配合飼料和冰魚對(duì)中華絨螯蟹生長、氨基酸代謝和胺類物質(zhì)沉積的影響,為胺類物質(zhì)在中華絨螯蟹體內(nèi)代謝規(guī)律提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為中華絨螯蟹的人工配合飼料開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為2組,分別為配合飼料組和冰魚組,配合飼料組全程投喂人工配合飼料,冰魚組全程投喂冰魚(冷凍的海水雜魚,以鯡科魚為主,購自南京市浦口區(qū)星甸鎮(zhèn)養(yǎng)殖區(qū))。每個(gè)處理組設(shè)6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)8只中華絨螯蟹,6雄2雌。試驗(yàn)前蟹平均體重27.41 g,投喂56 d。配合飼料購自江蘇興化地區(qū),主要營養(yǎng)成分和氨基酸含量見表1。

1.2 試驗(yàn)用蟹來源及養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)蟹來源于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)教學(xué)科研基地,運(yùn)輸?shù)金B(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室后,馴化養(yǎng)殖14 d,投喂商品飼料。試驗(yàn)在循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中開展,在每個(gè)桶中放置5個(gè)波紋塑料管(直徑25 mm,長12 cm)。試驗(yàn)期間,桶內(nèi)保持24 h充氧,每天更換30%～50%的水,保持水溫(24±5)℃。每天投喂2次(07:00、17:00),日投喂量約為蟹總生物量的2%～3%。每天觀察并記錄螃蟹的采食、脫殼及死亡情況。

表1 冰魚和配合飼料主要營養(yǎng)成分及氨基酸含量Table 1 Main biochemical composition and contents of amino acid in different feeds %

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖8周后,結(jié)束養(yǎng)殖試驗(yàn),采集樣本。具體方法:試驗(yàn)結(jié)束時(shí),每個(gè)桶收集大小和健康狀況相似的 6只螃蟹,冰上麻醉10 min(低溫可降低螃蟹的活力),然后殺死螃蟹,在冰床上解剖,剝離肌肉,用 4 ℃預(yù)冷的生理鹽水(0.89 g·L-1NaCl)徹底清洗,立即在液氮中冷凍,并在-80 ℃下保存供后續(xù)分析。

1.4 氨基酸和胺類物質(zhì)含量測(cè)定

表2 不同飼料中胺類物質(zhì)的含量(以鮮樣計(jì))

氨基酸測(cè)定采用酸水解法[19],利用氨基酸分析儀(日立L-8900)測(cè)定。

胺類物質(zhì)采用高效液相色譜法。具體如下:稱取2.0 g蟹肌肉或飼料樣品于50 mL離心管中,加入10 mL 0.4 mol·L-1高氯酸溶液,均質(zhì),于3 000 r·min-1離心10 min,取上層清液移入 25 mL 棕色容量瓶中,再重復(fù)提取1次,合并上清液于容量瓶中,用0.4 mol·L-1高氯酸溶液定容至25 mL。衍生處理:1)標(biāo)準(zhǔn)品:取1.0 mL 8種胺混合標(biāo)準(zhǔn)品適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液,加入300 μL飽和碳酸氫鈉溶液和 2 mL 丙酮配制的10 g·L-1丹酰氯溶液,在40 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)45 min后,加100 μL體積分?jǐn)?shù)為25%的濃氨水,靜置30 min,用乙腈定容到5 mL,振蕩混勻,取1 mL過0.20 μm濾膜的有機(jī)相針式濾器后待測(cè);2)樣品:取1.0 mL提取液,依次加入100 μL 2 mol·L-1氫氧化鈉溶液、300 μL飽和碳酸氫鈉溶液和2 mL 10 g·L-1丹酰氯溶液,同標(biāo)準(zhǔn)品衍生后待測(cè)。液相色譜檢測(cè)條件:流動(dòng)相A為乙腈、B為超純水、C為 0.1 mol·L-1乙酸銨。梯度淋洗:0～7 min,45% C→50% C;7～25 min,50% C→10% C;25～35 min,10% C→45% C;35～45 min,45% C。柱溫40 ℃,流速1.0 m·min-1,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長254 nm。

1.5 生長性能指標(biāo)及其計(jì)算方法

中華絨螯蟹增重率(WG)、特定生長率(SGR)、餌料系數(shù)(FCR)的計(jì)算公式如下:

WG=(Wt-W0)/W0×100%;SGR=(lnWt-lnW0)/T×100%;FCR=F/(Wt-W0),

式中:W0為中華絨螯蟹初始體重(g);Wt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)中華絨螯蟹的體重(g);T為養(yǎng)殖時(shí)間(d);F為攝食量(g)。

1.6 氨基酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

RNA提取:取組織樣0.1 g左右,加入盛有1 mL的Trizol液的EP管,4 ℃下充分勻漿,放置5 min后,加200 μL氯仿,劇烈振蕩15 s左右,然后低溫下12 000g離心10 min;取上清液300～500 μL,加入等體積的異丙酮,充分混勻后室溫放置10 min,再次離心10 min。小心移去上清液,加入500 μL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇,混勻后,12 000g離心5 min。重復(fù)此操作2次。棄上清液,取沉淀室溫下干燥10 min左右,加DEPC水40～100 μL溶解RNA,然后測(cè)定其濃度和質(zhì)量后,稀釋成相同濃度,進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。

RNA的反轉(zhuǎn)錄:按照大連寶生物公司試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)采用二步法:第1步42 ℃反應(yīng)40 min;第2步90 ℃反應(yīng)2 min,最后4 ℃保存。10倍稀釋后,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)。

RT-qPCR:1)引物設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的中華絨螯蟹相關(guān)基因序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參基因S27和肌肉TOR、AKT、4E-BP等的引物,并由上海Invitrogen公司合成,其序列參見表3;2)qPCR:根據(jù)TaKaRa SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行操作,結(jié)果用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析。

表3 本試驗(yàn)中RT-qPCR所用引物的序列Table 3 Nucleotide sequences of the primers used in RT-qPCR

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

2 結(jié)果與分析

2.1 冰魚和配合飼料投喂對(duì)中華絨螯蟹生長的影響

表4 配合飼料和冰魚投喂在中華絨螯蟹生長性能上的比較

由表4可知:配合飼料組和冰魚組中華絨螯蟹的初均重、末均重、增重率、特定生長率均沒有顯著差異(P>0.05),其中配合飼料組中華絨螯蟹的增重率和特定生長率均略高于冰魚組。配合飼料組的餌料系數(shù)顯著低于冰魚組(P<0.05)。

2.2 冰魚和配合飼料投喂對(duì)中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響

由表5可知:投喂配合飼料組和冰魚組中華絨螯蟹肌肉各種氨基酸、總必需氨基酸、總氨基酸均沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3 冰魚和配合飼料投喂對(duì)中華絨螯蟹肌肉胺類物質(zhì)含量的影響

由表6可知:配合飼料組中華絨螯蟹的酪胺含量和腐胺含量顯著高于冰魚組(P<0.05),而尸胺含量和亞精胺含量顯著低于冰魚組(P<0.05)。2組精胺、組胺的差異不顯著(P>0.05),但配合飼料組2者均略低于冰魚組。冰魚組中未檢測(cè)到酪胺和腐胺。2組均未檢測(cè)到色胺和苯乙胺。對(duì)比配合飼料與冰魚中胺類物質(zhì)含量,發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹肌肉中胺類物質(zhì)沉積種類和沉積量與攝入的胺類物質(zhì)種類和量密切相關(guān)。

表5 冰魚和配合飼料投喂在中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成上的比較(以鮮樣計(jì))Table 5 Comparison of amino acid composition of Chinese mitten crabbetween trash fish and compound feed(fresh weight basic) mg·100 g-1

表6 冰魚和配合飼料投喂在中華絨螯蟹肌肉胺類物質(zhì)上的比較(以鮮樣計(jì))Table 6 Comparison of the amines of Chinese mitten crab between trash fishand compound feed(fresh weight basic) mg·100 g-1

2.4 冰魚和配合飼料投喂對(duì)中華絨螯蟹AKT、4E-BP、mTOR基因表達(dá)量的影響

圖1 冰魚和配合飼料投喂在氨基酸代謝 相關(guān)基因表達(dá)量上的比較Fig.1 Comparison of expression level of amino acid metabolism related genes between trash fish and compound feed*P<0.05.

由圖1可知:2組飼料對(duì)中華絨螯蟹氨基酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量有明顯的影響。配合飼料組的AKT、4E-BP基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于冰魚組(P<0.05);而冰魚組的mTOR基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于配合飼料組(P<0.05)。

3 討論

3.1 投喂配合飼料和冰魚對(duì)中華絨螯蟹生長的影響

配合飼料具有來源穩(wěn)定、質(zhì)量可控、投喂方便等優(yōu)點(diǎn)[2],其替代天然餌料飼養(yǎng)中華絨螯蟹已成產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)[20-21]。而且配合飼料替代冰魚對(duì)中華絨螯蟹生長發(fā)育沒有顯著影響[17]。從本試驗(yàn)結(jié)果來看,投喂配合飼料和冰魚對(duì)中華絨螯蟹的初均重、末均重、增重率、特定生長率的影響均無顯著差異,這一結(jié)果與楊志剛等[17]的研究結(jié)果相似,這表明配合飼料能替代冰魚并滿足中華絨螯蟹生長發(fā)育的需求。闕有清等[22]的研究也顯示,全程投喂配合飼料替代冰魚對(duì)中華絨螯蟹成蟹存活和生長發(fā)育等各項(xiàng)指標(biāo)無顯著影響。但本試驗(yàn)中,冰魚組的餌料系數(shù)顯著高于配合飼料組,是配合飼料組的2.34倍,這暗示,投喂配合飼料相比于冰魚,可以提高飼料利用率,大幅度降低餌料系數(shù),而不會(huì)影響生長性能。楊志剛等[17]對(duì)冰魚和配合飼料成本的核算也證明了這一點(diǎn)。近年來,隨著研究者對(duì)中華絨螯蟹營養(yǎng)需求、生理特點(diǎn)的深入研究,其營養(yǎng)需求數(shù)據(jù)已經(jīng)較為全面,基本的配合飼料配方已經(jīng)能夠滿足中華絨螯蟹生長需要[2]。但關(guān)于中華絨螯蟹對(duì)各種飼料原料消化率的研究仍未見報(bào)道。目前生產(chǎn)中配合飼料的使用率仍然較低,大多數(shù)養(yǎng)殖者仍然采用配合飼料和冰魚間隔投喂的模式,這提示我們,需要在配合飼料標(biāo)準(zhǔn)制定、飼料原料消化率數(shù)據(jù)收集等方面開展進(jìn)一步工作,加快配合飼料在中華絨螯蟹生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。

3.2 投喂配合飼料和冰魚對(duì)中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響

水產(chǎn)動(dòng)物的體組成與餌料的營養(yǎng)成分相關(guān)[23-24]。其中,氨基酸組成一定程度上反映了水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的利用程度[25]。馬林等[26]在對(duì)珍珠龍膽石斑魚的研究中發(fā)現(xiàn),在配合飼料與冰鮮餌料的蛋白含量無顯著差異的情況下,攝食配合飼料的魚體肌肉中的各項(xiàng)氨基酸均顯著高于冰鮮餌料。本試驗(yàn)結(jié)果表明,配合飼料組的各必需氨基酸含量均略高于冰魚組,且總氨基酸含量也略高于冰魚組,與石婧等[4]的研究結(jié)果相似。而投喂的2種飼料中,配合飼料中大部分氨基酸含量均略低于冰魚組,但養(yǎng)殖的中華絨螯蟹中各氨基酸含量略高于或與冰魚組相當(dāng),這可能是由于配合飼料中的氨基酸的組成更符合中華絨螯蟹的需要,與冰魚相比較為平衡,從而增加了中華絨螯蟹對(duì)氨基酸的利用率和沉積率,可以更經(jīng)濟(jì)地維持中華絨螯蟹肌肉營養(yǎng)品質(zhì)。

3.3 投喂配合飼料和冰魚對(duì)中華絨螯蟹肌肉胺類物質(zhì)含量的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,配合飼料組的酪胺和腐胺含量顯著高于冰魚組,而尸胺和亞精胺含量顯著低于冰魚組。Tapia-Salazar等[18]研究發(fā)現(xiàn),飼料中組胺含量的不同可以影響蝦體中其他胺類物質(zhì)的濃度,如亞精胺含量會(huì)隨著組胺含量在飼料中的增加而增加,且尸胺、腐胺、精胺等均在蝦體中檢測(cè)出。Seidel等[27]認(rèn)為,組織中多胺的濃度與其代謝能力有關(guān)。在本試驗(yàn)中,尸胺與腐胺只有略微的沉積,這與張金彪[9]的研究結(jié)果相似,可能是因?yàn)橹腥A絨螯蟹對(duì)尸胺、腐胺的代謝能力強(qiáng),胺氧化酶將尸胺、腐胺氧化成醛類,再進(jìn)一步氧化成羧酸,從而完成胺類物質(zhì)的代謝[12]。配合飼料組中的酪胺含量顯著高于冰魚組,可能是由于投喂的配合飼料中含有一定的酪胺,而冰魚中沒有,由于酪胺的前體物質(zhì)酪氨酸不是中華絨螯蟹的必需氨基酸,可能導(dǎo)致中華絨螯蟹對(duì)它的代謝能力不強(qiáng)。冰魚組中的亞精胺含量顯著高于配合飼料組,可能是由于腐胺、精胺轉(zhuǎn)化為亞精胺[28]。Yang等[29]從組胺對(duì)虹鱒和藍(lán)蝦的不同影響中認(rèn)為,水生動(dòng)物對(duì)組胺的反應(yīng)可能具有種特異性。Tapia-Salazar等[18]認(rèn)為,在飼料中添加1 200～2 400 mg·kg-1的組胺,可提高蝦的增重率,而本試驗(yàn)中,配合飼料含有一定組胺含量,投喂后中華絨螯蟹的配合飼料組餌料系數(shù)低于用不含有組胺的冰魚投喂的冰魚組,但增重率無顯著差異,說明中華絨螯蟹的攝食量減少,這可能是由于組胺對(duì)中華絨螯蟹生長的促進(jìn)作用引起的。

對(duì)于胺類物質(zhì)的沉積情況來說,中華絨螯蟹肌肉中沉積的胺類物質(zhì)的種類和沉積量,與攝入飼料中含有的胺類物質(zhì)的種類和量有很強(qiáng)的相關(guān)性。這一結(jié)果暗示,胺類物質(zhì)可在中華絨螯蟹肌肉中沉積。有研究顯示,一些種類的水生生物不能沉積飼料中的胺類物質(zhì),如Opstvedt等[30]對(duì)大西洋鮭上的研究表明,飼料中的胺類物質(zhì)不能沉積到大西洋鮭的肌肉中。也有一些水生生物肌肉中胺類物質(zhì)的種類和數(shù)量與攝食食物相關(guān),如藍(lán)蝦[18]、擬穴青蟹[31]。我們推測(cè),以中華絨螯蟹為代表的甲殼類,可能對(duì)胺類物質(zhì)的代謝能力差,更容易沉積。這一點(diǎn)提示我們可通過控制飼料中胺類物質(zhì)的種類和比例,調(diào)控中華絨螯蟹風(fēng)味。

3.4 投喂配合飼料和冰魚對(duì)中華絨螯蟹AKT、4E-BP、mTOR基因表達(dá)的影響

一般認(rèn)為,mTOR-AKT-4EBP信號(hào)通路在蛋白代謝中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)中,配合飼料組的AKT和4E-BP基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于冰魚組,而mTOR基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于冰魚組,這可能是由于配合飼料中的氨基酸比例更加平衡,與冰魚相比更加符合中華絨螯蟹的需要,mTOR基因表達(dá)量的上調(diào)使4E-BP和AKT基因表達(dá)量下降,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。這一結(jié)果提示,攝食氨基酸更加合理的配合飼料可能通過激活TOR通路,增強(qiáng)蛋白代謝,降低了餌料系數(shù)。