鄧小玲,孫影,尤向峰,吳育發(fā),王夢云,胡積東,王有為,阮祥春,4*

(1.安徽農業(yè)大學動物科技學院,安徽 合肥 230036;2.廣德市農業(yè)農村局,安徽 廣德 242200;3.青陽縣畜牧獸醫(yī)局,安徽 青陽 242800;4.獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230036)

大腸桿菌廣泛存在于環(huán)境中,一旦附著在畜禽養(yǎng)殖的水線設備、料槽、地面等表面,形成生物被膜后難以被殺滅和清除,嚴重威脅畜禽的健康。禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)引起的最常見細菌性疾病之一。APEC公認的毒力特征包括黏附素、菌毛、毒素、鐵清除系統(tǒng)、侵襲素和質粒等[1]。APEC能夠引起禽局部或全身性感染,表現(xiàn)為各種體征,包括急性致命性敗血癥、亞急性心包炎、氣囊炎、周圍肝炎、蜂窩織炎和輸卵管炎等,可導致巨大經濟損失,且規(guī)模養(yǎng)殖雞場的死亡率較散養(yǎng)戶可能更高[2-3]。

生物被膜是一種或多種細菌為適應環(huán)境,抵抗外界不良影響而形成的一種微菌落聚合物[4]。細菌可以在生物或非生物表面以單個細胞或者細胞簇附著,形成單層或多層生物被膜[5]。大多數(shù)細菌能產生生物被膜,如:大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci)等[6]。生物被膜是由不同成分組成的胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)。EPS是生物被膜形成的三維支架,發(fā)揮黏附和將游離狀態(tài)的物質凝聚于生物被膜內的作用。EPS的主要成分包括多糖、蛋白質、核酸、脂質、菌毛、鞭毛、腐殖質等。這些成分在生物被膜結構中起到十分重要的作用,包括附著、聚集、信息交流、抵抗宿主特異性與非特異性免疫、耐藥性等[7]。

本試驗基于禽致病性大腸桿菌生物被膜形成能力及相關特性分析,包括大腸桿菌形成生物被膜的成膜能力、膜成熟時間、膜成分,與生物被膜形成相關基因以及對10種抗菌藥物耐藥性分析,為臨床禽致病性大腸桿菌病防治及抗菌藥的合理使用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株本研究中涉及的70株禽致病性大腸桿菌,均為2019—2020年從安徽省內送檢的瀕死或剛死亡雞肝臟中無菌分離獲得。其中從送檢至安徽農業(yè)大學畜禽疾病診斷中心的病例中分離到59株,由潘玲、王勇和李郁老師饋贈。另外,11株從安徽廣德市和青陽縣轄區(qū)內養(yǎng)殖場送至安徽農業(yè)大學動物科技學院獸醫(yī)藥理毒理實驗室病雞的肝臟中無菌分離獲得。經鑒定為大腸桿菌,保存用于本試驗。

1.1.2 抗菌藥物氨芐西林(AMP)、頭孢曲松鈉(CRO)、阿奇霉素(AZM)均購于北京索萊寶科技有限公司;阿莫西林(AMX)購自聯(lián)邦制藥國際控股有限公司;多西環(huán)素(DOX)購自揚州聯(lián)博藥業(yè)有限公司;氟苯尼考(FFC)購自江蘇恒盛藥業(yè)有限公司;恩諾沙星(ENR)購自浙江國邦藥業(yè)有限公司;新霉素(NEO)購自上海麥克林生化科技有限公司;替加環(huán)素(TGC)與多黏菌素B(POL)均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑LB營養(yǎng)肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、MH(B)培養(yǎng)基均由北京奧博星生物技術有限責任公司生產;冰醋酸、結晶紫、甲醇均為國產化學純級試劑。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜陽性菌株的篩選參考范玉堂[8]報道的剛果紅平板法,挑取培養(yǎng)在麥康凱培養(yǎng)基上的單菌落,接種于剛果紅平板上,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,于室溫培養(yǎng)3～7 d,每天觀察并記錄結果。判定菌落及周圍瓊脂變?yōu)楹谏珵槟苄纬缮锉荒ぞ?而菌落及周圍顏色沒有變化的為不能形成生物被膜的菌株。

1.2.2 生物被膜形成能力測定取無菌96孔板,將篩選出能形成生物被膜的禽致病性大腸桿菌制備成菌液(A600=0.01),每孔加入200 μL。陰性對照孔加入LB營養(yǎng)肉湯,每組重復6孔。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,移除孔內液體,用0.01 mol·L-1PBS緩沖液(pH7.4)洗3次后,向每孔中加入200 μL甲醇,固定15 min,再用PBS緩沖液洗3次。待自然干燥后,每孔加入200 μL結晶紫,染色5 min,用 PBS緩沖液洗滌。自然干燥后,每孔加入200 μL 33%冰醋酸溶液,靜置30 min后,用酶標儀測定吸光值(A570)。結果以A570c值(A570c為陰性對照孔的平均值加上其3倍標準差)為參考,判定不成膜株(A570≤A570c)、弱成膜能力株(A570c4×A570c)[9]。

1.2.3 生物被膜成熟時間的測定取無菌96孔板,每孔加入制備好的菌液(A600=0.01)200 μL,空白對照為LB營養(yǎng)肉湯,每組重復6孔。37 ℃靜置培養(yǎng),每天更換LB營養(yǎng)肉湯。分別在接種后0.5(12 h)、1、2、3、4、5、6和7 d用滅菌生理鹽水洗去浮游菌,按1.2.2節(jié)方法進行結晶紫染色并測量A570值。根據A570值來繪制生物被膜生長曲線[10]。

1.2.4 卷曲菌毛和胞外纖維素的檢測將生物被膜陽性菌株在麥康凱瓊脂平板上劃線培養(yǎng),挑取單菌落接種于裝有5 mL LB肉湯的試管中,對照組為等體積的LB肉湯。28 ℃靜置培養(yǎng)72 h后,觀察氣液交界面以及玻璃試管內狀態(tài)。若氣液交界面形成致密的生物被膜,表明該菌株有卷曲菌毛并能夠產生胞外纖維素;形成脆弱的生物被膜表明該菌株僅有卷曲菌毛;試管底部形成沉淀表明該菌株只能產生胞外纖維素;菌液均勻渾濁表明該菌株不具有卷曲菌毛并不能產生胞外纖維素[8]。

1.2.5 生物被膜胞外多糖的測定采用濃硫酸-苯酚法測定生物被膜胞外多糖的含量[11-13]。將提前配制好的1 mg·mL-1葡萄糖標準儲備液,按比例稀釋成不同濃度的葡萄糖標準工作液。取20 μL葡萄糖標準工作液至96孔板,每個濃度重復6孔。每孔加入30 μL 6%的苯酚水溶液后,立即加入150 μL濃硫酸,室溫靜置1 h后測定吸光值(A490),繪制葡萄糖濃度-吸光(A490)值的標準曲線。取200 μL生物被膜陽性菌株的懸液(A600=0.01)加入到96孔板中,每株菌重復6孔。37 ℃靜置培養(yǎng)36 h后,用滅菌PBS緩沖液緩慢洗去浮游菌,采用濃硫酸-苯酚法測定吸光值(A570),根據制備的葡萄糖標準曲線,計算出菌株生物被膜中胞外多糖的含量。

1.2.6 生物被膜相關基因的檢測使用Primer Premier 5.0軟件設計引物,引物序列見表1。PCR體系(25 μL)包括:12.5 μL 2×SparkTaqPCR Master Mix,9.5 μL dd H2O,上、下游引物各1 μL,1 μL菌懸液模板。PCR條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,退火溫度(Tm)退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min(退火溫度見表1)。

表1 生物被膜相關基因的引物Table 1 Primerpairs of biofilm-related genes

1.2.7 致病性大腸桿菌的耐藥性檢測根據美國臨床和實驗室標準協(xié)會方法委員會(CLSI)標準[14],通過肉湯微量稀釋法檢測禽致病性大腸桿菌對10種抗菌藥的最小抑菌濃度。取無菌U型96孔培養(yǎng)板,前10列孔作為試驗組,第11列孔為陽性對照,第12列孔為陰性對照。將待測藥物配制成256 μg·mL-1,加入第1個孔,用MH(B)培養(yǎng)基(pH值 7.2～7.4)進行連續(xù)倍比稀釋。試驗組及陽性對照每孔均加入100 μL禽致病性大腸桿菌菌液(A600=0.1),陰性對照加入等體積的MH(B)培養(yǎng)基,每組3個重復。37 ℃靜置培養(yǎng)18～24 h后,觀察并記錄結果。根據CLSI標準判定每株菌對10種抗菌藥的耐藥性情況。

2 結果與分析

2.1 生物被膜陽性菌株檢出情況

通過剛果紅平板篩選,不能形成生物被膜菌株的菌落及周圍未有黑色的顏色變化(圖1-A),而生物被膜陽性菌株在剛果紅平板上表現(xiàn)為菌落及周圍瓊脂變?yōu)楹谏?圖1-B)。根據試驗的結果,鑒別出有31株臨床分離禽致病性大腸桿菌能形成生物被膜[15]。

圖1 生物被膜陽性菌株篩選Fig.1 Screening of biofilm-positive strainsA. 生物被膜陰性菌株 The biofilm-negative strains;B. 生物被膜陽性菌株The biofilm-positive strains.

圖2 生物被膜陽性菌株成膜能力測定Fig.2 Determination of the biofilm forming ability of positive strains*P<0.05; **P<0.01. The same as follows.

2.2 生物被膜形成能力測定

對禽致病性大腸桿菌形成的生物被膜用結晶紫染色,測定其A570值。依據陳傳榮等[9]報道的判定方法,鑒定出10株強成膜菌株(32.26%)、7株中等成膜菌株(22.58%)、14株弱成膜菌株(45.16%)。并且強成膜菌株與中等、弱成膜菌株的A570值差異極顯著(P<0.01),而中等與弱成膜菌株的A570值差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

2.3 生物被膜成熟時間的測定

生物被膜陽性菌株在3～7 d形成成熟的生物被膜。其中膜成熟時間在第3天的有5株(16.13%),第4天與第5天的各1株(3.23%),第6天的有3株(9.68%),第7天的有21株(67.74%)。強、中、弱成膜菌株平均膜成熟時間分別為(5.5±1.69)d、(5.43±1.84)d和(6.86±0.52)d。強與中等成膜菌株平均膜成熟時間差異不顯著(P>0.05),但顯著短于弱成膜菌株(P<0.05)?？傮w趨勢為成膜能力較強的菌株膜成熟時間短(圖3)。根據膜成熟時的吸光值,判斷菌株產生膜基質量。結果(圖4)表明,強成膜菌株產生膜基質量平均為(2.55±1.60),與中等成膜菌株差異顯著(P<0.05),與弱成膜菌株差異極顯著(P<0.01)。中等與弱成膜菌株差異不顯著(P>0.05)。

2.4 卷曲菌毛和胞外纖維素的檢測

觀察發(fā)現(xiàn):有卷曲菌毛并產生胞外纖維素的有15株菌,占48.39%;僅有卷曲菌毛的有9株菌,占29.03%;只產生纖維素的有3株菌,占9.68%;兩者均無的有4株菌,占12.90%(圖5)。有卷曲菌毛和胞外纖維素的強成膜菌株所占比例最高(60.00%),而弱成膜菌株所占比例最低(35.71%)。中等成膜菌株形成的生物被膜中不產生胞外纖維素,產生胞外纖維素的強成膜菌株數(shù)多于弱成膜菌株數(shù)。中等、弱成膜菌株中存在菌毛和纖維素均不產生的菌株,且弱成膜菌株數(shù)多于中等成膜菌株數(shù)。在含有菌毛且產生胞外纖維素的菌株中,強成膜能力的菌株數(shù)最多,所占的比例也最高(圖6)。

圖3 生物被膜陽性菌株膜成熟時間Fig.3 The maturation time of biofilm positive strains

圖4 不同成膜能力菌株膜成熟產生的基質量Fig.4 The amount of matrix produced by the biofilm maturation of the strains with different film-forming abilities

圖5 卷曲菌毛和胞外纖維素的檢測Fig.5 Detection of curli and extracellular cellulose A. 有卷曲菌毛并產生胞外纖維素;B. 僅產生卷曲菌毛;C. 僅有胞外纖維素;D. 無卷曲菌毛且不能產生胞外纖維素;E. 對照組。A. Carrying curli and producing extracellular cellulose;B. Carrying curli only;C. Producing extracellular cellulose only;D. Neither carrying curli nor producing extracellular cellulose;E. Control group.

圖6 不同成膜能力菌株卷曲菌毛和胞外纖維素的檢出率Fig.6 Detection rate of curli and extracellular cellulose of strains with different biofilm forming abilities Cur+/Cur-:有/無產生卷曲菌毛能力菌株;Cel+/Cel-:有/無產生胞外纖維素能力菌株。Cur+/Cur- indicates the strain with the ability to produce or no curli;Cel+/Cel- indicates the strain with the ability to produce or no extracellular cellulose.

圖7 不同成膜能力菌株生物被膜胞外 多糖的含量Fig.7 Content of extracellular polysaccharide in biofilm of strains with different biofilm forming ability

2.5 生物被膜胞外多糖含量的測定

從圖7可以看出:根據制定葡萄糖標準曲線的線性方程Y=0.002 4x(R2=0.999),測定強、中等和弱成膜菌株形成生物被膜中平均胞外多糖含量,分別為(70.56±25.90)μg·mL-1、(45.45±12.54)μg·mL-1和(46.09±9.19)μg·mL-1。強成膜菌株的胞外多糖含量與中等和弱成膜菌株相比,差異極顯著(P<0.01),中等成膜菌株與弱成膜菌株的胞外多糖含量無顯著差異(P>0.05)。

2.6 生物被膜相關基因的檢測

在生物被膜陽性菌株中,生物被膜相關基因檢出率由高到低依次為:群體感應、菌毛、鞭毛、蛋白、多糖相關基因。群體感應系統(tǒng)相關基因qseB、qseC、pfs、luxS的檢出率均為100%,不同成膜能力菌株的檢出率差異不顯著;除csgB的平均檢出率為96.77%外,其他與菌毛相關基因csgA、csgC、csgD、csgE、fimH的檢出率均為100%,其中強和中等成膜菌株的檢出率均高于弱成膜菌株,但差異不顯著;與鞭毛相關基因motA、flhC、fliC的平均檢出率為84.95%,強成膜菌株檢出率高于弱成膜菌株和中等成膜菌株,差異不顯著;與蛋白相關基因ompA、papC的檢出率較高,而flu的檢測率較低,強成膜菌株檢出率高于弱成膜菌株和中等成膜菌株,差異不顯著;與多糖相關的基因除pgaD、mcbR外,pgaA、pgaB、pgaC的檢出率最低,弱成膜菌株的檢出率高于中等成膜菌株和強成膜菌株,差異不顯著(表2)。

表2 生物被膜形成相關基因的平均檢出率Table 2 Average detection rate of genes related to biofilm formation %

2.7 生物被膜陽性菌株耐藥性結果

31株生物被膜陽性菌株平均耐(4.68±1.63)種藥,耐藥3種以上的菌株占90.32%。對氨芐西林、阿莫西林、多西環(huán)素、氟苯尼考、頭孢曲松、恩諾沙星、阿奇霉素、新霉素、多黏菌素B、替加環(huán)素的耐藥率分別為83.87%、80.65%、67.74%、67.74%、67.74%、41.94%、29.03%、25.81%、6.45%、0.00%。其中,氨芐西林的耐藥率最高,而對替加環(huán)素和多黏菌素B耐藥率很低。不同成膜能力的菌株只有對氟苯尼考和頭孢曲松的耐藥率差異顯著,其他8種抗菌藥物的耐藥率差異不顯著;強、中等成膜菌株對10種抗菌藥的平均耐藥率比弱成膜菌株高,例如強成膜菌株對多黏菌素的耐藥率達到了 20.00%(2/10),遠高于中等成膜菌株(0/7)和弱成膜菌株(0/14)(表3)。

表3 不同成膜能力菌株對10種抗菌藥的耐藥率Table 3 Drug resistance rate of strains with different biofilm forming abilities to ten kinds antimicrobial drugs %

3 討論

由于不同的細菌及同類菌株之間存在一定的差異,導致生物被膜形成的不同,如:能否形成生物被膜、成膜能力、膜成熟時間、膜的組成以及與膜形成相關基因的差異等。生物被膜的檢測方法較多,有試管法、銀染法、阿利新蘭剛果紅聯(lián)合染色法、結晶紫半定量染色法、電鏡法等[16-17]。一般為了提高試驗結果的準確性,通常會進行多種方法鑒定。李晗等[18]采用細菌細胞活性測定試劑盒/激光共聚焦顯微鏡檢測方法得到清晰的生物被膜圖片。這種方法可以作為臨床實踐中細菌生物被膜鑒定,具有穩(wěn)定、高質量等優(yōu)點。但是也存在準備時間長、成本高、操作復雜等缺點。結晶紫半定量染色法具有簡便快捷的特點,能較準確反映細菌生物被膜成膜情況,廣泛應用于實驗室細菌生物被膜的檢測[17]。本試驗采用結晶紫半定量染色法鑒定禽致病性大腸桿菌是否形成生物被膜及成膜能力。在70株禽致病性大腸桿菌中,生物被膜陽性菌株檢出率為44.29%,與張偉等[19]的研究結果(36.9%)相似,但與陳傳榮等[9]的研究結果(96.1%)差異較大。這可能與菌株的差異、參考的方法、生物被膜培養(yǎng)時間等原因有關。

生物被膜形成的過程是一個動態(tài)的過程,分為起始黏附期、集聚增殖期、成熟期以及脫落散播期4個階段[20]。在強、中等成膜能力的菌株中,它們膜成熟的時間相對較短。弱成膜能力的菌株膜成熟時間主要在5～7 d(6.86±0.52 d),比強、中等成膜菌株膜成熟時間要長,且差異顯著。這表明成膜能力強的菌株,其膜成熟時間相對較短。臨床很多感染性疾病與細菌生物被膜有關,其中約80%的慢性感染性疾病與細菌生物被膜有關[21],且其成膜能力與其毒力呈正相關[10]。細菌對宿主細胞的黏附和侵襲在細菌定殖過程中至關重要,并且生物被膜的形成與黏附有關,其在入侵和定居期間可產生毒力[22]。APEC的致病性不僅由血清群決定,還受毒力基因和生物被膜形成能力等其他因素影響。大多數(shù)臨床分離的APEC具有強或中等的生物被膜形成能力,由此推斷產生生物被膜是引起其高致病性的一個原因,或是產生生物被膜后引起耐藥性增強而導致感染難以治愈[23]。

細菌生物被膜形成與鞭毛、菌毛、群體感應系統(tǒng)等基因密切相關[24]。鞭毛是細菌的運動器官,與運動性、趨化性、定殖、黏附密切相關[25]。菌毛在生物被膜形成過程中,起到黏附素的作用,參與生物被膜不可逆黏附階段[26]。群體感應是依賴于細胞密度實現(xiàn)細菌之間通訊的信號機制,此種通訊系統(tǒng)在生物被膜形成的調控中起著關鍵作用[27]。胞外多糖是細菌生物被膜最重要的成分[27],主要包括β-1,6-N-乙?；?D-葡糖胺聚合物(PGA)、可樂酸和纖維素[28],是生物被膜成熟必不可少的成分之一。本試驗中,成膜能力強的菌株形成生物被膜的基質量多,而生物被膜基質內多糖的含量高?？扇苄缘鞍资顷P鍵蛋白,可以調節(jié)細胞滲透、增強細胞的保水作用,對于細菌生物被膜具有保護作用[29]。生物被膜形成密切相關的基因表達檢測發(fā)現(xiàn),除了少數(shù)基因檢出率較低外,絕大多數(shù)的基因檢出率很高。因此,與鞭毛、菌毛、群體感應等生物被膜形成相關基因均可作為藥物研究的潛在靶點,來篩選能夠抑制生物被膜形成的藥物。

生物被膜的形成降低了細菌對抗菌藥的敏感性,比游離狀態(tài)的耐受性甚至提高了1 000倍,給疾病防治帶來困難[30-31]。生物被膜引起細菌耐藥的機制包括:抗菌藥物滲透障礙;基因結構的改變;阻擋機體免疫系統(tǒng)的吞噬、殺傷作用;生物被膜內層細菌營養(yǎng)代謝異常而引發(fā)生長抑制,出現(xiàn)對某些抗菌藥的不敏感[4,32]。形成生物被膜致病菌造成臨床很多感染性疾病治療效果差、反復感染等現(xiàn)象[33-35]。耐藥性檢測表明,臨床分離禽致病性大腸桿菌對10抗菌藥產生了不同程度的耐藥性。我們對不形成生物被膜的菌株也進行了耐藥性檢測,發(fā)現(xiàn)都是浮游狀態(tài)下,對10種抗菌藥平均耐藥性程度基本一致。然而,在能形成生物被膜的菌株中,生物被膜陽性菌株的耐藥程度與生物被膜的形成能力呈現(xiàn)一定的正相關。對送檢養(yǎng)殖企業(yè)臨床用藥進行調查,發(fā)現(xiàn)在雞發(fā)生疾病后,主要使用阿莫西林、多西環(huán)素、氟苯尼考等抗菌藥進行治療。經常或者不合理使用這些藥物,容易產生耐藥性,這與本研究中耐藥性檢測結果相一致。另外,耐藥性檢測發(fā)現(xiàn),約1/3的菌株對阿奇霉素產生了耐藥性,這與臨床中不合理用藥有密切關系。除此之外,生物被膜形成菌株對臨床常用抗菌藥物的耐藥性較強,但對于多黏菌素與替加環(huán)素的耐藥性較低。20%的強成膜菌株對多黏菌素產生了耐藥性,而中等與弱成膜菌株均對多黏菌素敏感?？傮w而言,生物被膜形成能力強的菌株其耐藥性高于生物被膜形成能力弱的菌株。因此,養(yǎng)殖企業(yè)在預防和治療疾病的過程中需要遵循“對癥用藥、少用藥、合理用藥”的原則,減少細菌耐藥性的發(fā)生;另外生物被膜對臨床禽致病性大腸桿菌病防治具有重要意義,對生物被膜的研究有很大的臨床應用價值。

生物被膜在細菌對耐藥、逃避宿主免疫防御及反復感染等方面發(fā)揮重要作用[31]。臨床上當抗菌藥的治療效果較差時,除了考慮耐藥性因素,還應考慮病原菌生物被膜因素。結合物理、噬菌體、金屬離子等方法[36],破壞或者清除細菌生物被膜后,再使用抗菌藥殺滅游離病原菌,從而提高臨床治療效果。中藥具有的抗菌消炎、低價、無毒、無殘留和不易產生耐藥性等優(yōu)點,很多研究結果也證明了其顯著的抗菌效果、抗細菌生物被膜作用及其他優(yōu)點[37-38]。這為臨床禽致病性大腸桿菌病防治及抗菌藥的合理使用提供借鑒。

致謝:潘玲、李郁和王勇3位老師慷慨贈予臨床分離的禽致病性大腸桿菌菌株,謹致謝意。