潘珍珍，徐詩堯，張健，王倩，項紅霞，李羚

（無錫市兒童醫(yī)院1.呼吸科，2.檢驗科，江蘇 無錫214023）

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是兒童常見的一種慢性氣道變應性疾病。有研究表明表觀遺傳修飾在環(huán)境和遺傳因素之間起重要作用，其中與哮喘發(fā)病機制密切相關的是組蛋白乙?；揎梉1]。這個可逆性過程分別由組蛋白乙?；D移酶（histone acetyltransferase, HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases,HDAC）介導[1]。

MUC5AC是一種主要的黏蛋白基因，在正常氣道中有表達，且在哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者氣道中的表達升高。雖然氣道黏蛋白分泌是氣道防御的重要組成部分，但過多分泌也是氣道阻塞的重要原因之一。曲古抑菌素A（Trichostatin A, TSA）作為HDAC 的抑制劑，在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)對哮喘小鼠具有治療作用，與既往研究結果類似[2-4]。具體機制與其可使T 細胞高度乙?；?，Th1/Th2 比值降低有關。亦有實驗證實不同濃度的TSA 可影響MUC5AC 的表達[5]，本課題組前期實驗亦證實人MUC5AC基因的核心啟動子區(qū)域位于-935 bp至+48 bp處，且P 300 可以下調MUC5AC基因的表達[6]，說明HAT 活性與MUC5AC基因的轉錄調控密切相關。本文通過動物實驗，進一步證實組蛋白乙酰化修飾在哮喘小鼠MUC5AC 表達中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 復制哮喘小鼠模型

雄性、SPF 級、6～8周齡BALB/c 小鼠40只，平均體重為（20±2）g，無卵蛋白飲食。首日致敏予腹腔內注射10%卵蛋白和10%氫氧化鋁混合液1 ml，第7 天重復1 次以加強致敏；2 周后將小鼠置于自制透明霧化吸入箱（20 cm×30 cm×40 cm），予1%OVA霧化吸入（霧化顆粒直徑3～5 μm），1次/d，30 min/次，連續(xù)2 周。

1.2 TSA干預

末次激發(fā)后將哮喘小鼠隨機分為3 組，哮喘組（13 只）、TSA治療組（13只）和對照組（14只），哮喘組及對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml（1.0 mg/kg），TSA治療組小鼠尾靜脈注射TSA 0.2 ml（1.0 mg/kg）。

1.3 眼眶后靜脈叢采血

TSA 干預小鼠48 h 后經腹腔注射100 g/L 烏拉坦0.5 ml 麻醉，眼眶后靜脈叢采血后EDTA 抗凝管保存，全血上機檢測血常規(guī)[包括白細胞計數(shù)（WBC）、中性粒細胞計數(shù)（NE）、血小板計數(shù)（PLT）及嗜酸性粒細胞計數(shù)（EOS）]，血清用作酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測MUC5AC 水平（試劑盒購自英國Abcam 公司）。

1.4 肺組織標本采集及肺泡灌洗液收集

固定小鼠，暴露胸腔，切除左肺迅速放入-80℃冰箱用作HAT 活性分析，再用一鈍頭注射器插入氣管，輕柔注入生理鹽水0.3 ml 后回抽，共3 次，回收液即肺泡灌洗液（BALF）。再注入40 g/L 多聚甲醛0.3 ml 使右肺充盈，結扎氣管后切除右肺浸入4%多聚甲醛中固定，用于脫水、石蠟包埋固定和切片，進行肺組織蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組織化學染色檢測。

1.5 肺組織HE染色

中性甲醛固定組織脫水后予二甲苯透明，用石蠟包埋切片，脫蠟至水，行肺組織HE染色，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理學變化。

1.6 BALF計數(shù)

按常規(guī)瑞特染色進行，通過顯微鏡觀察至少200 個細胞，確定不同細胞數(shù)目。

1.7 免疫組織化學法檢測肺組織內MUC5AC蛋白表達

采用過氧化物酶標記的鏈酶卵白素（SP）染色，即切片經常規(guī)脫蠟、梯度水化后，用3%過氧化氫孵育10 min 滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復抗原10 min，正常山羊血清封閉，滴加1∶100 的小鼠抗MUC5AC 單克隆抗體4℃過夜，滴加速用型生物素化二抗工作液，DAB 顯色，蘇木精對比染色、脫水、透明、中性樹膠封固。用常規(guī)抗體稀釋液0.01 MPBS 代替小鼠抗MUC5AC 單克隆抗體作為陰性對照；在高倍視野下，細胞質呈棕黃色著染為陽性細胞。蛋白表達強度用高清晰度彩色圖像分析系統(tǒng)測定5 個視野的光密度（OD）值，取其平均值表示。

1.8 HAT和HDAC活性測定

取出小鼠左肺，采用Ficoll-Hypaque 密度分離法分離單個核細胞，后提取核蛋白，酶聯(lián)免疫熒光法檢測HAT 及HDAC 活性，試劑盒購自美國Bio Vision 公司。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用方差分析或H檢驗；進一步兩兩比較用LSD-t檢驗或χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 驗證模型是否復制成功

哮喘模型的復制參考既往已發(fā)表的研究[7]，通過癥狀和肺組織病理驗證哮喘小鼠模型復制成功。

2.1.1 癥狀小鼠在致敏期間無任何陽性表現(xiàn)，首次激發(fā)期間小鼠即出現(xiàn)焦躁不安、呼吸急促等陽性反應，但并不明顯，之后每次激發(fā)期間小鼠均表現(xiàn)出焦躁不安。

2.1.2 肺組織病理檢查結果哮喘組小鼠肺組織HE染色可見氣道周圍水腫，炎癥細胞浸潤（見圖1）。

圖1 肺組織病理改變 （HE染色×400）

2.2 3組外周血常規(guī)比較

3 組小鼠的外周血嗜酸性粒細胞計數(shù)（EOS）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較后可見哮喘組小鼠外周血EOS 較TSA 治療組、對照組升高（P＜0.05），TSA 治療組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而3 組小鼠外周血白細胞計數(shù)（WBC）、中性粒細胞計數(shù)（NE）及血小板計數(shù)（PLT）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組外周血常規(guī)比較 [×109，M(P25，P75)]

2.3 3 組BALF 及EOS 計數(shù)的比較

3 組小鼠BALF 及EOS 計數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，哮喘組BALF 和EOS 計數(shù)較TSA 治療組及對照組升高（P＜0.05），而TSA 治療組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組BALF及EOS計數(shù)比較 （×105，±s）

表2 3組BALF及EOS計數(shù)比較 （×105，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與哮喘組比較，P ＜0.05。

組別哮喘組TSA治療組對照組F 值P 值n 13 13 14 BALF 3.03±0.29①1.58±1.03②1.02±0.39 9.602 0.008 EOS 1.23±0.78①0.85±0.16②0.64±0.82 8.192 0.012

2.4 3組小鼠HAT及HDAC活性比較

3 組小鼠的HAT 和HDAC 活性比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，TSA 治療組、對照組小鼠HAT、HDAC 活性較哮喘組降低（P＜0.05），而TSA 治療組與對照組HAT、HDAC 活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。新定義的變量HDAC/HAT 為兩者間的比值，3 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，TSA治療組、對照組HDAC/HAT比值較哮喘組升高（P＜0.05）。見表3。

表3 3組小鼠HAT和HDAC活性比較 （±s）

表3 3組小鼠HAT和HDAC活性比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與哮喘組比較，P ＜0.05。

組別哮喘組TSA治療組對照組F 值P 值n 13 13 14 HAT活性/[RFU/（h·μg）]0.49±0.25①0.28±0.18②0.30±0.24 7.037 0.036 HDAC活性/[RFU/（h·μg）]0.91±0.09①0.78±0.03②0.72±0.17 6.923 0.027 HDAC/HAT 1.86±0.87①2.79±0.45②2.40±1.08 6.909 0.024

2.5 3組小鼠血清MUC5AC表達水平比較

3 組小鼠血清MUC5AC 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.037，P=0.008）。進一步兩兩比較，TSA治療組MUC5AC表達水平（0.38±0.072）、對照組小鼠MUC5AC 表達水平（0.29±0.130）均較哮喘組（0.74±0.015）低，而TSA 治療組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.6 肺組織病理改變及免疫組織化學

2.6.1 肺組織HE 染色及氣道AB-PAS 染色肺組織HE 染色可見哮喘組小鼠氣道周圍水腫，炎癥細胞增多，而TSA 治療后明顯改善，但哮喘組的纖毛損傷不明顯。氣道AB-PAS 染色亦可見哮喘小鼠氣道上皮炎癥細胞浸潤，TSA 治療后炎癥細胞浸潤減少（見圖2、3）。

圖2 3組小鼠肺組織病理改變 （HE染色×400）

圖3 3組小鼠氣道組織病理改變 （AB-PAS染色×400）

2.6.2 肺組織免疫組織化學免疫組織化學結果示，哮喘組MUC5AC 蛋白陽性表達升高，而TSA 治療組MUC5AC 蛋白陽性表達較哮喘組減 少（見 圖4）。 定量分析可見3 組小鼠MUC5AC 抗體免疫組織化學OD 值差異有統(tǒng)計學意義（F=11.506，P=0.003）。進一步兩兩比較，哮喘組小鼠MUC5AC 抗體免疫組化OD 值（0.675±0.128）較對照組（0.099±0.134）升高（P＜0.05），TSA 治療組MUC5AC 抗體免疫組織化學OD 值（0.184±0.093）較哮喘組降低（P＜0.05），TSA 治療組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4 3組小鼠肺組織MUC5AC蛋白陽性表達 （免疫組織化學染色）

3 討論

哮喘是兒童常見的一種氣道變應原性慢性炎癥性疾病，其影響到全球＞10%的兒童，其發(fā)病機制目前尚不完全明確，其機制的研究有助于發(fā)現(xiàn)更好、更優(yōu)的治療手段。表觀遺傳學一直是比較熱門話題，在環(huán)境和遺傳因素之間起到重要作用，其中與哮喘發(fā)病機制密切相關的是組蛋白乙酰化修飾[1]。所謂組蛋白乙?；揎?，即修飾多發(fā)生在H3/H4N-末端賴氨酸殘基上致局部DNA 與組蛋白八聚體緊密纏繞被解開染色質構象發(fā)生改變，調控基因的轉錄組蛋白乙?；ǔ４龠M基因的轉錄，與炎癥基因誘導和細胞增殖有關。這個可逆性過程分別由HAT 和HDAC 介導[8]。

本課題前期實驗證實在哮喘患兒體內存在HAT 活性的升高及HDAC 活性降低，且在哮喘小鼠體內有同樣的改變[9]，已知許多輔激活因子都具有HAT 活性，如環(huán)磷酸腺苷反應元件結合因子（cAMP response element binding protein-binding protein, CBP）、p300/CBP 相關因子（p300/CBPassociated factor, PCAF）、腺病毒E1A 相關蛋白等。其本身并不能結合DNA，但通過與序列特異的激活因子相互作用，被吸引到啟動子部位，介導轉錄的激活[10-11]。當組蛋白的N 末端賴氨酸殘基在上述刺激因子和前炎癥轉錄因子如核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）及活化蛋白-1（activated protein-1, AP-1）等的作用下發(fā)生乙?；c組蛋白緊密纏繞的DNA 局部被解開，利于與RNA 聚合酶Ⅱ結合，激活轉錄，從而編碼炎癥蛋白，促進哮喘發(fā)生。

MUC5AC是一種主要的黏蛋白基因，在正常氣道也有表達，但在哮喘和COPD 患者的氣道是增加的[12]。雖然氣道黏蛋白分泌是氣道防御的重要組成部分，但過多分泌也是氣道阻塞的重要原因之一，在致死性哮喘患者中，幾乎總是與氣道黏液過多分泌引起的阻塞有關[13]。另外，黏液高分泌是哮喘患者的一個共同癥狀，特別是哮喘加重期。已證明黏液產生與患者的FEV1 下降有關[14]。這證明黏液高分泌是哮喘加重的標志之一。目前人MUC5AC基因啟動子的背景比較清晰，許多轉錄因子可與之結合并促進其轉錄，其中AP-1、SP-1、NF-κB等轉錄因子均可與CBP/p300 發(fā)生相互作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可以通過招募HDAC2，減少MUC5AC 的表達[16]，另有實驗證實不同濃度的TSA可影響MUC5AC 的表達[8]，說明MUC5AC基因的轉錄調控可能與乙?；饔孟嚓P，但其中的分子學調控機制及動物試驗的驗證除本課題組的研究外尚未發(fā)現(xiàn)此類研究。

本課題組前期分子學實驗已證實人MUC5AC基因的核心啟動子區(qū)域位于-935 bp 至+48 bp 處，且P300 可以下調MUC5AC基因的表達[6]，說明HAT 活性與MUC5AC基因的轉錄調控密切相關。接下來，本研究通過動物試驗進一步證實組蛋白乙?；揎椩谙∈驧UC5AC 表達中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠外周血嗜酸性粒細胞計數(shù)較TSA 治療組、對照組均升高，TSA 治療組與對照組差異無統(tǒng)計學意義，哮喘組小鼠BALF 及EOS 計數(shù)均較TSA 治療組及對照升高，進一步提示TSA 對于哮喘的治療作用，而TSA 主要通過下調嗜酸性粒粒細胞性炎癥來起到治療哮喘的作用，其可能與HAT 具有招募嗜酸性粒細胞作用有關。另肺組織HE 染色可見哮喘組小鼠氣道周圍水腫，炎癥細胞增多，而TSA 治療后明顯改善，以上結果均證實TSA 對于哮喘的治療作用。TSA 作為HDAC 的抑制劑，在抑制HDAC 活性的同時卻可刺激抗炎因子的合成和表達，包括細胞因子如TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-10、IL-12 和IFN-γ 等[17-18]，且HDAC 抑制劑的效果可能根據(jù)細胞類型而不同。在小鼠哮喘模型中，致敏期間T 細胞擴增和活化發(fā)生在胸部淋巴結中，在過敏原激發(fā)后，肺中的T 細胞群顯著增加，其中大部分擴增是由于CD4+細胞產生Th2 細胞因子，如IL-4、IL-5 和IL-13，導致肺嗜酸性粒細胞增多、黏液分泌過多以及氣高反應[19]。因此，控制Th2 細胞因子的產生將改善氣道炎癥、降低高反應性[20]。據(jù)報道，TSA 可減少CD4+T 細胞增殖，對IL-2 分泌和CD154 表達具有抑制作用[21]，因此可以有效地抑制體內T 細胞的活性。另有實驗證實TSA 減少BALF 中CD4+T 細胞數(shù)量，以及BALF 中代表性Th2細胞因子（包括IL-4 和IL-5）的表達。這些發(fā)現(xiàn)均表明TSA 對哮喘炎癥反應具有治療作用[2]。TSA 是公認的HDAC 抑制劑之一，但在本實驗中發(fā)現(xiàn)，TSA 治療組小鼠HAT 活性明顯降低，說明TSA 不僅抑制HDAC 活性，亦可下調HAT 活性，與既往研究相符[22]，但TSA 治療組和對照組的HDAC/HAT 比值較哮喘組明顯降低，這樣的改變使TSA 治療后雖HAT、HDAC 活性均被抑制，但是HDAC 活性仍能發(fā)揮主要作用，從而對哮喘起到治療作用，但具體機制需要進一步實驗證實。ELISA 結果顯示TSA治療可降低哮喘小鼠血清MUC5AC 濃度；免疫組織化學結果示，TSA 治療組較哮喘組能明顯減少MUC5AC 蛋白含量，TSA 治療組與對照組無差異，說明組蛋白乙?；揎梾⑴cMUC5AC 蛋白的表達，結合前期分子學實驗，考慮與HAT 活性有關，TSA在抑制HDAC 活性的同時，也抑制HAT 活性，從而使得MUC5AC 表達下降，證實組蛋白乙?；揎?，尤其是HAT 活性在哮喘小鼠MUC5AC 表達中起重要的作用，而TSA 對哮喘小鼠氣道炎癥及黏液分泌方面起著治療作用。

綜上所述，組蛋白乙酰化修飾在哮喘發(fā)病中的作用日趨重要，但相關機制尚不完全清楚，黏蛋白作為哮喘患者體內分泌明顯增高的一種蛋白，與哮喘的發(fā)病及病情演變密切相關，本課題組在前期實驗中均證實組蛋白乙?；揎椏赡軈⑴c黏蛋白的分泌過程，但是本文仍具有一些局限性，主要包括以下幾點：①因MUC5AC 分子量過大，本研究未成功完成Western blotting；②在本實驗過程中出現(xiàn)肺泡灌洗液回收困難的情況，其中4 只小鼠在肺泡灌洗過程中出現(xiàn)肺泡破裂，3 只小鼠回抽肺泡灌洗液不成功，回收不成功小鼠大多數(shù)為哮喘組，考慮一方面與操作不當有關，另一方面可能與哮喘小鼠氣道炎癥腫脹有關；③未對小鼠的肺功能及氣道高反應性進行檢測；④本課題僅限于表型的研究，缺乏機制的研究，經過前期研究，初步考慮其機制可能與MUC5AC基因啟動子出的組蛋白乙?；蛘呦嚓P轉錄因子發(fā)生乙?；揎椨嘘P。本課題組將在后期實驗中進一步探索HAT 活性對MUC5AC 表達調控的作用，期望為將來從分子學角度研究哮喘的發(fā)病機制，從而指導分子學層面的診療奠定基礎。